怎么设计引物
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2023年3月17日发(作者：时令蔬菜)10.26-qPCR引物设计
设计原则：
扩增产物长度:80-150bp.引物的产物⼤⼩不要太⼤，⼀般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长⾄300bp）
2.引物长度⼀般在15-30碱基之间。
引物长度（primerlength）常⽤的是18-27bp，但不应⼤于38bp，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进⾏反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。Tm=58-60度。
GC含量（composition）过⾼或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太⼤。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡的解链温度，即在⼀
定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，⼀般⾼于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其
Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很⼤的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，⽽当末位链为T时，错配的引发效率⼤⼤降
低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
5.引物⾃⾝及引物之间不应存在互补序列。
引物⾃⾝不应存在互补序列，否则引物⾃⾝会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本⾝复性。这种⼆级结构会因空间位阻⽽影响引物与模板的复性结合。引物⾃⾝不能有连续
4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防⽌引物⼆聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物⼆聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过⾼（应⼩于4.5kcal/mol）。否则易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使反应不能正常进
⾏。
设计步骤：
获得基因序列后，打开primer5.0
1.点击File-new-DNAsequence粘贴cDNA序列-asis-ok
2.点search-调整如图参数（产物长度⼀般为100-300，引物长度⼀般为20左右，视情况调整）
3.弹出下图窗⼝后，先看右边，根据系统设计的引物进⾏筛选，优先评分较⾼的
S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看
ΔG绝对值⼩于10
tm在58左右，正负2度
GC%在40%-60%
末端不能是A
不能有连续3个相同的碱基
3’端⼀定不能有错配
【筛选原则】：
1.最好hairpin,dimer,falsepriming没有
2.最好是没有连续相同碱基，如TTT、GGG
3.最好两个引物之间bp之差⼩于等于2，
4.产物长度⼤于100，⼩于300最好，也可以到400
在58左右，正负2度
6.⼀般设计时引物18-22长度，最长不要超过25
7.3’不能以A结尾
8.出现Found时，ΔG绝对值⼩于10
4.以系统给出的第⼀对引物为例（看框住的地⽅），虽然系统给出的评分⽐较⾼，但是下游引物可能出现发夹结构（Hairpin）和⼆聚体（Dimer）,我们可以尝试调整⼀下。
弹出如下窗⼝后，光标点在①号位置，删除⼏个碱基后，
点击②号位置Analyze,点击③号位置ok