引物合成
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2023年3月17日发(作者：大气的受热过程)引物合成原理及纯化⽅式选择
引物合成过程
寡核苷酸（后⾯简称引物）的制备是通过使⽤DNA合成仪完成的，合成仪本质上是⼀套由计算机控制的试剂递送系统。第⼀个碱基将会被
连接⾄固体⽀持物（通常是玻璃或聚苯⼄烯微珠），该⽀持物旨在锚定反应柱中不断延长的DNA链。DNA合成由⼀系列的化学反应所组成，不
同于酶促的DNA合成过程从5'→3'⽅向延伸，⽽是由3'→5'⽅向进⾏。
1.解封：第⼀个碱基通过糖环上的3'-OH与固体⽀持物相连，其糖环上的5'-OH被4,4'-⼆甲氧基三苯甲基（DMTr）封闭，合成循环的第⼀步就是
去除保护基团，⽣产⼀个游离的5’-OH基团，以便与下⼀个碱基进⾏反应。
2.活化：将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进⼊合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保
护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发⽣缩合反应。
3.偶联：携带亚磷酰胺四唑活性中间体的碱基（由亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合形成的中间体）与第⼀个碱基偶联，从⽽加⼊
3.偶联：携带亚磷酰胺四唑活性中间体的碱基（由亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合形成的中间体）与第⼀个碱基偶联，从⽽加⼊
新的核苷酸，偶联失败的产物就会形成短⽚段。这⼀步是引物链增长的过程，是整个循环中最关键的⼀步。
4.戴帽：上⼀步反应中，未能加⼊新碱基的活化碱基被醋酸酐酰化，这⼀步称为戴帽，这些戴帽的碱基在不会参与到后续的合成循环中。这⼀步
是⾮常必要的，如果没有这个过程，下个循环中错误的碱基就会掺⼊，影响引物的准确性和纯化。
5.氧化：通过氧化剂，第⼀个碱基与被成功偶联的第⼆个碱基之间的亚磷酯键将会被氧化成稳定的磷酸三酯键，以维持不断增长的链。
6.氧化完成后，清除新加⼊碱基5'端DMTr保护基团，开启新⼀轮的循环。这样循环往复，每个反应循环都会加⼊⼀个DNA碱基，通过控制循
环数即可达到期望长度的DNA引物。最后，引物链从固体⽀持物上切除，再清除引物的保护集团，通过脱盐和纯化即可得到⽬标产物。
有些实验员还搞不清楚引物5'端到底有没有磷酸基团，从第6步的过程看，最后⼀个碱基5'端DMTr保护基团清除后，暴露出来的是5’-OH，是没
有磷酸基团的，不能够直接⽤于3'-5'连接反应，这是合成⽅法本⾝局限的，如果你需要带5'端磷酸的引物，就需要告诉合成公司进⾏修饰，也可以
⾃⼰⽤磷酸化酶处理。
引物合成的副产物
所有的化学反应都不是100%进⾏的，即使是最彻底的中和反应也是处于动态平衡的，那么引物合成过程中会产⽣那些⼲扰呢？下⾯我们来看
看，反应不彻底会产⽣什么样的影响？
①假设我们要合成ATCG，A⾸先固定在固相载体上；
②然后解封、活化、偶联上T，这时假设有X的T被偶联上，那么就有(1-X)的A被加帽封闭了，如果加帽的效率为Y，就有
(1-X)(1-Y)的A仍处于5'-OH状态，本轮循环结束，产⽣X的AT，(1-X)Y的A（封死），(1-X)(1-Y)的A（活化态）；
③继续下⼀轮：X的AT中继续有X偶联上C产⽣X的ATC，X(1-X)Y的AT（封死），(1-X)(1-Y)的AT（活化），更严重
的是上⼀步未封死的A（(1-X)(1-Y)）会被加上C，产⽣X(1-X)(1-Y)的AC错误引物，虽然这个概率是极低的，但是引物
总量巨⼤，你可能正好⽤到错误的碱基，得到了错误的扩增结果；
……
④最后共产⽣ATCG、ATC、AT、A、AC、ATG等多种产物，其中
的ATCG的⽐例为X，A的⽐例为1-X，AT的⽐例为X(1-X)，ATC的⽐例为X(1-X)，A、AC、ATG可以忽略（仍有发
⽣的可能性，发⽣这种情况也只能说明你的运⽓实在差到了极点）。
⑤以此类推，要合成长度为n的引物，就会不可避免的产⽣1~n-1的短⽚段，全长产物的⽐例为X，长度为m的短⽚段
的⽐例为（1-X）*X的短⽚段。
⑥最后，产物从载体上切离，去保护基团，但是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发⽣在G
转换成其它碱基。碱基G在⼀定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中
DNA聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发⽣G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤
的引物中发⽣的频率较⾼。
引物合成过程中，会产⽣各种各样的副产物，⼤多数副产物基本可以忽略，但短⽚段的⽐例是不容忽视的，⼀般的偶联步骤效率在99%左
右，25nt的引物，全长的⽐例=0.99=78.6%，每种短⽚段的⽐例接近0.99%，⼀般PCR体系中，引物的使⽤浓度为0.2-0.5uM，这样的浓度下
短⽚段的数⽬也是很⼤的，这些短⽚段可能结合在⾮⽬的区，往往导致⾮特异条带的产⽣，甚⾄克隆失败。为了避免这种缺陷，引物合成之后需要
对应的纯化步骤，去除⼩⽚段，这对较⾼要求的PCR和分⼦克隆是⼗分必要的。
引物纯化⽅式
DSL（脱盐）纯化
⼜称为简易反相柱，柱⼦特异性吸附氨盐（寡核苷酸），氨盐可以被有机溶液洗脱，但不会被⽔洗脱，能有效的去除盐分，纯度可满⾜⼤
多分⼦⽣物学实验需求。该⽅法速度快，价格低，但不能有效去除⽐⽬的⽚段略短的引物⼩⽚段，适合低要求的PCR反应。
HAP
HAP纯化柱中装有对DMT具有亲和⼒的树脂，合成DNA⽚段时保留5'端最后⼀个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在柱上以后，⽤
稀的有机溶剂洗柱，带有DMT的⽚段吸附能⼒强，不易被洗脱，不带有DMT的⽚段吸附能⼒弱，被洗脱。然后⽤三氟⼄酸TFA或三氯⼄
酸TCA脱去DMT基团，再⽤浓⼀点的有机溶剂洗脱DNA。这种⽅法具有多快好省的特点。制品纯度可达到80~90%，可以满⾜杂交探
针、测序、常规PCR（不再做进⼀步克隆实验）等⽤途了。但是因为其专⼀性吸附DMT能⼒有限，不免仍然有短⽚段带⼊的可能，⽽且负载
量⼩。特别是对长于39碱基以上的⽚段纯化效果不好，若考虑节约经费，对于要求较低的实验，采⽤HAP纯化即可。
RPC
RPC纯化是通过反相净化滤芯(ReversePhaseCartridge)对引物进⾏纯化，纯化原理与反相HPLC纯化⼀样。与反相HPLC⽐
较，RPC是⼀种有效且更加经济的纯化⽅式。反相净化滤芯通常包含⼀种疏⽔基质如C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以⽤⽔轻松
地将切割下来的保护基团和短的引物⽚段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应⽤于DNA测序、PCR及基因合成等。
PAGE纯化
该⽅法是使⽤变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA⽚段进⾏分离，然后从凝胶中回收⽬的DNA的⽅法。PAGE纯化基于尺⼨和构象分离全长
产物和失败序列，可以分离相差⼀个碱基的引物(120碱基以内)，从⽽提供⾼纯度的引物。纯化后的DNA纯度⼤于90%，相⽐与其他两种⽅
法，PAGE纯化对长链OligoDNA(⼤于50mer)的纯化特别有效，制品纯度可达90~95%。可⽤作RT-PCR引物、各种探针，或⽤于PCR克
隆测序、定点突变等。
HPLC纯化
HPLC是使⽤⾼效液相⾊谱的原理，依据DNA的疏⽔性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA⽚段的疏⽔性不同，⼀般来说较长
的⽚段具有较强的疏⽔性，AT含量⾼的⽚段也具有较强的疏⽔性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该⽅法⽤
于分离纯化时能达到很⾼的纯度和灵敏度，可以有效的去除⼤部分短⽚段，从⽽对DNA⽚段进⾏纯化。由于HPLC产品的纯度⾮常⾼，使⽤本
法纯化的DNA制品可适⽤于各种分⼦实验，当然这种⽅法的成本也是最⾼的。
2
32
n-1
m-1
24
应对办法
1.引物设计
引物合成过程中，造成碱基缺失，插⼊，置换突变的因素客观存在，合成的⽚段越长副产物越多，尤其是短⽚段，虽然可以通过纯化不同
程度地得到去除，但很多合成公司为了节省成本选择的纯化⽅式你是不清楚的，为了尽可能降低短⽚段的⽐例，设计引物时，在保证特异性的
前提下，可以减少引物的长度。如果你发现PCR产物特异性总是很差，这是你就要更换合成公司或者选择纯度更⾼的纯化⽅式了。
2.选择合适的纯化⽅式
DSL只是简单的脱盐处理，不能去除短⽚段，⼀些价格极低的合成公司就是这种纯化⽅式，⼀般第⼆天就能到货，选择需要慎重。HAP、
RPC只能去除部分短⽚段，效果⽐DSL好⼀些，但⾼要求的PCR、⾼保真克隆、全基因合成推荐选择更好的纯化⽅式。对40mer以下的DNA
制品，HPLC是最好的纯化⽅法，其次是PAGE；⽽对40mer以上的DNA制品PAGE纯化要优于HPLC纯化。
纯化⽅法描述优势
脱盐
（25nm:10–100
bp;50nm:5-100bp)
采⽤正相⾊谱柱处理寡核苷酸，去除盐但不去
除失败序列。
即⽤型⽆盐DNA溶液；适⽤于许多PCR和测
序分析，⽆需进⼀步纯化。"
过柱
（50nm–1µm,7-55
bp)
基于反相⾊谱；从完成的合成中去除失败序
列。
提供某些分析应⽤所需的全长序列
HPLC
(50nm+,10-55bp)
反相⾼效液相⾊谱（HPLC）以与过柱纯化相
同的⽅式去除失效序列或未掺⼊的标记。
保证某些分析应⽤中需要的⾼度纯化的引物（>
=85％全长）。
PAGE
(200nm+,7-100bp)
⽤于根据⼤⼩和构象区分全长产品和失效序列
的⽅法。
提供特定应⽤（例如诱变或接头⽣产）所需的最
⾼⽐例的全长寡核苷酸（>=85％）。
引物是PCR成功与否最重要的影响因素之⼀，影响PCR成功率的因素我们后⾯还会讨论。⼀般来说，在引物区发⽣突变的概率不⼤，但是偶
尔也会发⽣，合成公司⼀般都有对应的赔偿措施，但花费的时间精⼒是你的，因此进⾏⽐较重要的实验时，尽量不要在引物合成上节约成本。