抗体制备
载流量计算公式-气的拼音怎么写
2023年3月20日发(作者：结合的近义词)单克隆抗体制备的基本原
理
ItwaslastrevisedonJanuary2,2021
单克隆抗体制备的基本原理
一、单克隆抗体的概念
抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫
球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而
抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的
抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同
抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍
是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克
隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加
之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许
多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗
体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得
以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原
免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B
细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在
体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分
泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交
瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所
谓单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科
学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
德国科学家柯勒（GeorgesKo1er）和英国科学家米尔斯坦（CesarMilstein）
两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术
（一）杂交瘤技术的诞生
淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必
然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成
以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同
时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮
备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为
“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuousculturesof
fusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）的着名论文。他们大胆
地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸
核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的
骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介
导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤
（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生
长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合
的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融
合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养
基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本
脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存
活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红
细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即
所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克
隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，
且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系
如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由
它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了
骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞
融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
（二）杂交瘤技术的基本原理
细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞
悬中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的
脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细
胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无
需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特
别的筛选去除。在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一
般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)
和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源
性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸
在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤
或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthineguznine
phosphoribosyltransferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase,TK)的催
化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,
能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种
酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧
啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活,但B淋巴细胞是正常细胞,故不能
长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-
缺陷型,缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外
源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细
胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基
中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只
有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
三、单克隆抗体制备的方法与步骤
（一）单抗制备的基本流程
单克隆抗体制备的主要步骤有：①正常小鼠免疫处理；②用物理、化学和生
物方法促使细胞融合；③杂交瘤细胞的筛选与培养；④单克隆抗体的提纯。
（二）单克隆抗体制备的基本方法
抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗
原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分
乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研
磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不
限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途
径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般
被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性
越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小
鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融
合。
骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细
胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株
生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻
链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞
应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。骨
髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合
的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细
胞。
在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细
胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。常用的饲养
细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部
数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦
有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重
污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。
细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG
使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的
细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。
①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的
比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞
的混合细胞悬液中，第1min滴加培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后
加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其
中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随
时核查培养基情况。
有限稀释法
筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细
胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释
至个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培
养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依
抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗
原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，
发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是
增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该
法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩
和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小
鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小
鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～
10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可
达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯
化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增
减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株
活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌
种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护
剂。冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。如果低于50％，则说明
冻存复苏过程有问题。
单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血
清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方
法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采
用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，
多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交
联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与
IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗
体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，
（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加
中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。