双分子荧光互补
机械装配-雾化吸入操作流程
2023年3月19日发(作者：电池隔膜)玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛
选
雷海英;白凤麟;段永红;王志军
【摘要】n(ZmCEN)function,we
employedthetechniqueofyeasttwohybridsystem(Y2HS)toinvestigate
study,usingmaizeinbredlineZheng58seedlingsasmaterials,weisolated
thetotalRNAandsynthesizedthedouble-strandcDNAsbySMART
ingtotheCDSsequenceoftheZmCENgene,we
designedtheprimerstoconstructrecombinantbaitvector(pGBKT7-
ZmCEN)andtransformyeaststrainY2HGoldforscreeningthetoxicityand
enedthepreyproteins
ctingproteinsNAC67andTON1bwere
verifiedtheinteractionbyβ-Csemi-
moleculevectorsofZmCEN-pSPYNEandTON1b-pSPYCEwereconstructed
dOntology
(GO)enrichmentanalysiswereperformedonthescreenedproteinsusing
ultsshowedthattheunamplified
cDNAlibrarywasconsistedof2.56×107CFUindependentclones,andthe
titeroflibrarywas5.36×108CFU/mLwhichmettherequirementsof
Alibrarywasscreenedbybaitvectorafter
testingnotoxicityandnoself-activation,and28proteinswereinteracted
chment
analysisoftheseproteinsshowedthattherewere21termsinthe
ENandTON1bproteinswerefurtherverified
-qualitycDNA
librarywasconstructedand28proteinswereinteractedwithZmCEN,which
couldbeusedtofurtherinvestigatetheinteractionmechanismsbetween
them.%为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互
作蛋白进行研究.提取玉米(ZeamaysL.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用
SMART技术反转录合成dscDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文
库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7ZmCEN)
转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋
白(ZmCEN)互作的猎物蛋白.将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)
再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-
pSPYNE和TON1b-pSPYCEBiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验
证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene
ontology(GO)注释分析.结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到
2.56×107CFU,文库滴度5.36×108CFU/mL,符合建库要求.经检测诱饵载体无毒
性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最
终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质.GO注释显示互作蛋白参与的生物
过程有21种.BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互
作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系.酵母双杂交系统
cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用
机制奠定了基础.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2018(038)004
【总页数】9页(P598-606)
【关键词】ZmCEN;SMART技术;cDNA文库;酵母双杂交;BiFC;GO分析
【作者】雷海英;白凤麟;段永红;王志军
【作者单位】长治学院生物科学与技术系,山西长治046011;长治学院生物科学与
技术系,山西长治046011;山西农业大学农学院,山西太谷030801;长治学院化学系,
山西长治046011
【正文语种】中文
【中图分类】Q785;Q786;Q789
细胞中存在着一个精密的骨架系统——细胞骨架，尤其是微管和微丝骨架，在细
胞周期的进程中扮演着重要角色，直接参与有丝分裂中细胞器的组装及胞质分裂，
维持细胞正常的形态结构与功能[1]。微管组织中心(microtubuleorganizing
center,MTOC)决定着细胞微管的极性，为微管提供了生长的起点和延伸的方向。
哺乳动物的MTOC，如中心体，是一个高度动态变化的结构，随细胞周期进行复
制、分离，并且在分裂期形成纺锤体的两极，是细胞的动力中心。而63%的高等
植物没有中心体，其功能的执行依赖于细胞内的细胞结合蛋白以及上游信号分子的
调控，如中心蛋白(centrin)就是微管组织中心(MTOC)的一种重要组成部分[2]，最
早从绿藻(Tetraselmisstriata)中分离得到，是负责细胞分裂、分化的重要的钙结
合蛋白。现已知中心蛋白存在于藻类、酵母、低等生物及高等动植物中[3-4]。中
心蛋白的功能主要是通过与其互作蛋白，如中心体成分Sfi1[5-8]、Mps[9-10]和
Karl[11-12]等作用而执行功能。
目前，中心蛋白的研究主要集中在低等生物、模式植物及人，对玉米中心蛋白
(n,ZmCEN)的作用机制及互作蛋白研究未见报道。本实验室在
前期研究中已成功进行了ZmCEN基因克隆和表达，并对ZmCEN的功能开展了
初步研究[13-14]。本研究通过构建玉米cDNA文库，采用酵母双杂交技术筛选出
与ZmCEN互作的蛋白质，为从分子水平上揭示ZmCEN作用的分子机制及开展
其生物学功能研究奠定基础。
1材料和方法
1.1供试材料
参试材料为玉米(ZeamaysL.)自交系‘郑58’，由山西省农业科学院孙毅研究员
提供。
总RNA提取、质粒提取及片段回收等试剂盒购自Takara公司，cDNA文库构建、
酵母转化试剂盒、SD/Leu培养基等购自Clontech公司。酵母菌Y2HGold、
Y187、大肠杆菌EscherichiacoliTOP10均由本实验室保存；酵母双杂交载体质
粒为pGBKT7、pGADT7，购自Clontech公司。
1.2实验方法
1.2.1玉米幼苗全株cDNA文库的构建(1)总RNA的提取：选取玉米在光照培养
箱中培养1周的生长健康的4～5叶期植株，连同根部一起取出，冲洗干净，于干
热灭菌后的研钵中加入液氮，研磨后利用Trizol(TaKaRa)试剂提取总RNA(具体方
法参照说明书)，采用NanoDrop2000分光光度计检测RNA浓度和质量。
(2)ZmCENcDNA单链、双链合成及双链cDNA的纯化：采用SMART技术和
Clontech酵母双杂交文库构建试剂盒(“Mate&Plate”LibrarySystem)合成
cDNA，PCR反应条件为：95℃30s；95℃10s，65℃6min(每个循环+5s)，
25个循环；68℃5min。取7μL反应产物做1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的
约93μL加入到CHROMASPINTE-400纯化柱中纯化，最后溶解到20μL去离
子水中重悬cDNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。
(3)收集转化子:将dscDNA与pGADT7-Rec线性质粒共转至Y187感受态细胞
中，按酵母转化试剂盒(YeastmakerTMYeastTransformationSystem2，
Clontech)指南操作，将转化子涂布于150mmSD/-Leu平板上，待菌落长到
2～3mm时即收获转化子。
(4)文库滴度检测：取10μLcDNA文库菌液，分别稀释为10、100、10000倍
后涂布于100mmSD/-Leu平板上，30℃倒置培养3～5d，分别统计平板上的
菌落数以计算文库滴度。
1.2.2诱饵载体的构建引物序列依据ZmCEN基因CDS序列设计。ZmCEN-
F/ZmCEN-R引物序列见表1，限制性内切酶NcoI/XhoI将扩增产物进行双酶切
后，4℃连接过夜，采用载体通用引物测序验证序列的正确性。
1.2.3酵母转化、pGBKT7-ZmCEN毒性及自激活检测将pGBKT7质粒和构建好
的pGBKT7-ZmCEN重组载体100ng分别转化入酵母Y2HGold的感受态细胞
[26]中，稀释将转化液稀释10、100倍后分别取100μL涂布SD/-Trp、SD/-
Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba固体平板上检测其毒性；同时将100ng
pGBKT7-ZmCEN及100ngpGADT7质粒共转至Y2HGold感受态细胞，将转化
液稀释10、100倍后分别取100μL涂布SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal、SD/-Trp/-
Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板；同时将100ngpGBKT7-53与100ng
pGADT7-T共转至Y2HGold感受态细胞，为阳性对照；将100ngpGBKT7-lam
与100ngpGADT7-T共转至Y2HGold感受态细胞，设为阴性对照。将转化液稀
释10、100倍后分别取100μL涂布于SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal、SD/-Trp/-
Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板上，将上述平板在30℃下倒置培养3～5d，
检测自激活。感受态细胞的制备和转化过程按照试剂盒(YeastmakerTMYeast
TransformationSystem2，Clontech)操作指南进行。
1.2.4玉米中心蛋白(ZmCEN)互作蛋白的筛选从上述SD/-Trp平板上挑取含有
pGBKT7-ZmCEN的Y2HGold菌落(2～3mm)至50mLSD/-Trp液体培养基中，
30℃下250～270r/min振荡培养，直至OD600≈0.8；1000g离心5min，去
上清，用4～5mLSD/-Trp液体培养基重悬，在含有45mL2×YPDA液体培养
基的2L的锥形瓶中接入1mLcDNA文库菌液和4～5mL诱饵菌液，设阳性对
照为Y2HGold[pGBKT7-53+pGADT7-T]，阴性对照为Y2HGold[pGBKT7-
lam+pGADT7-T]。30℃下30～50r/min培养，20h后1000g离心收集10
min，弃上清，再用50mL0.5×YPDA清洗2次，离心，去上清，收集细胞；用
10mL0.5×YPDA重悬细胞，将杂交液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade的营养
缺陷型固体培养基上，30℃倒置培养7d，筛选互作蛋白。
将划线3次均能生长的克隆定为阳性克隆。将抽提所得质粒转化至大肠杆菌
TOP10宿主，涂布于加有Amp的平板上，挑斑送上海生工进行测序。测序后的
cDNA序列进行Blast比对分析。选取互作蛋白NAC67和TON1b的菌落分别在
SD/-Trp/Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ada营养缺陷型培养基上划线生长，β-半
乳糖苷酶进一步验证其互作。
1.2.5双分子荧光互补[15]体内验证ZmCEN与TON1b蛋白的互作通过设计PCR
引物，扩增出不含终止密码子的ZmCEN和TON1b的cDNA序列，并将此无终
止密码子的ZmCENcDNA序列插入到nYFP的N-端半分子载体pSPYNE的多克
隆位点中，使之与nYFP相连形成ZmCEN-pSPYNE融合蛋白；同时也将无终止
密码子的TON1b的cDNA序列插入到nYFP的C-端半分子载体pSPYCE的多克
隆位点中，形成TON1b-pSPYCE的融合蛋白。分别取两质粒5μL(约1.2mg)通
过PEG诱导分别转化及共转化玉米原生质体，23℃弱光孵育12～18h进行瞬时
表达，激光共聚焦显微镜(卡尔蔡司LSM880)观察并照相。
表1实验中用到的PCR引物Table1Primersusedinthisstudy引物名称
Primername引物序列(5′→3′)Primersequence限制性内切酶Restriction
enzymeZmCEN-
FTGGCCATGGAGGCCGAATTCATGAGTTTCAACCAGTCTACTGTCAAGGNco
ⅠZmCEN-RCCGCTGCAGGTCGACGGATCCGTAGCCAAAGCTGGTCCTCC
TCATCXhoⅠBiFC-ZmCEN-
FTGGCGCGCCACTAGTGGATCCATGAGTTTCAACCAGTCTACAscⅠBiFC-
ZmCEN-RGAGCGGTACCCTCGAGGTCGACGTAGCCAAAGCTGGTCCTKpn
ⅠNAC67-FTGGCGCGCCACTAGTGGATCCATGGAGGTGAAGAAGGAGGGAsc
ⅠNAC67-RGAGCGGTACCCTCGAGGTCGACGACACCCGCCATCTTCCGKpn
ⅠTON1b-
FTGGCGCGCCACTAGTGGATCCATGGACGACTACGCCCGGGAGAAsc
ⅠTON1b-RGAGCGGTACCCTCGAGGTCGACCTCGGCGCCATCCCCTGAKpn
ⅠpSPYNE-FCTCTAGAGTTAACCGGGCTCAGGpSPYNE-
RCATCCCGGGAGCGGTACCpSPYCE-
FCTCTAGAGTTAACCGGGCTCAGGpSPYCE-RCATCCCGGGAGCGGTACC
2结果与分析
2.1玉米酵母双杂交cDNA文库的构建
玉米幼苗总RNA提取及mRNA纯化。提取的总RNA，OD260/OD280为1.986。
由图1，A看出,提取的总RNA完整性较好，测定浓度为0.08μg/μL，取3μL进
行建库。LD-PCR设置为25个循环。
玉米幼苗cDNA的合成和纯化。如图1，B所示，合成的双链cDNA的电泳结果
呈现弥散状分布，双链cDNA大小介于300～5000bp之间，表明cDNA全长
性较好。纯化后双链cDNA浓度结果为167.4ng/μL，OD260/OD280为1.73，
大小介于300～4000bp之间，表明全长性较好，符合建库要求。
cDNA文库质量与滴度检测，库容2.56×107CFU>1×106CFU，文库滴度：
5.36×108CFU/mL，符合建库标准(>2×107CFU/mL)。
2.2诱饵载体pGBKT7-ZmCEN的毒性及自激活检测
通过设计一步克隆引物，将ZmCEN基因插入到pGBKT7载体上，获得了
pGBKT7-ZmCEN真核融合表达载体，通用引物测序证明载体构建成功。对融合
表达载体转化酵母菌Y2HGold进行毒性检测，结果对照与插入菌株均在SD/-Trp
缺陷型培养基上生长出单克隆菌落，表明pGBKT7和pGBKT7-ZmCEN对酵母
Y2HGold无毒性作用(图2)。pGBKT7-ZmCEN诱饵质粒自激活作用检测结果如
图2所示，只有阳性对照组中由于pGBKT7-53表达的p53蛋白与pGADT7-T表
达的T蛋白发生相互作用，可在SD/-Trp/Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ada营养
缺陷型培养基上复苏，而阴性对照pGBKT7-lam+pGADT7-T和实验组pGBKT7-
ZmCEN+pGABT7-T只在SD/-Trp缺陷型培养基上生长，均不在四缺平板上生长，
表明该诱饵基因的融合蛋白没有自激活活性，可用于下一步实验。
2.3诱饵载体pGBKT7-ZmCEN筛选玉米幼苗cDNA文库
将诱饵载体pGBKT7-ZmCEN转入酵母Y2HGold后，提取单克隆质粒，送上海
生物工程公司进行测序，并通过NCBIBlast进行比对，得到了28个可能与
ZmCEN互作的蛋白质(表2)。从筛选的互作蛋白中分别选取NAC67和TON1b
蛋白，采用表1中引物进行扩增并构建载体，再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶
检测(图3)，进一步证明了NAC67和TON1b蛋白与ZmCEN存在互作。利用
Uniprot在线网站，对候选28个互作蛋白进行了geneontology(GO)注释(图4)，
结果表明ZmCEN的候选互作蛋白参与的生物过程有21种，包括翻译、代谢过程、
化合物的生物合成过程、对外界刺激的响应及防御等；细胞组份包含叶绿体基质、
核糖体及细胞内的非膜结合细胞器等；参与的分子功能有14种，包括水解酶、翻
译延伸因子、DNA复制原点结合活性及各种磷酸化酶活性等。
A.玉米全株总RNA；纯化;基因PCR扩增;M1.10000bp
DNA分子量标准;M2.5000bpDNA分子量标准;1和2为提取的总RNA;3和
4为纯化的cDNA;5和6为PCR扩增ZmCEN基因产物图1玉米ZmCEN基因
PCR扩增ophoresisresultsoftotalRNA;;
resultofZmCENgene;M1.10000bpDNAladder;M2.5000bpDNA
ladder;1and2werethetotalRNA;3and4werethepurifiedcDNA;5and
6werethePCRresultofZmCENgeneFig.1ThePCRresultofZmCENgene
ofmaize
图2诱饵融合蛋白的毒性和自激活活性检测Fig.2Toxicityandself-activation
detectionofthebaitrecombinantprotein
A、7-ZmCEN+pGADT7;7-ZmCEN+pGADT7-NAC67;3.
pGBKT7-53+pGADT7-T;7-lam+pGADT7-T;C、7-
ZmCEN+pGADT7;7-ZmCEN+pGADT7-TON1b;7-
53+pGADT7-T;7-lam+pGADT7-T图3诱饵载体与蛋白NAC67和
TON1b的互作验证Fig.3FunctionalassayofbaitproteinwithNAC67and
TON1bproteinsinyeast表2ZmCEN互作蛋白及功能分析Table2The
functionalanalysisofZmCENinteractingproteins
序号No.基因座位Genelocus染色体号码.候选互作蛋白Candidate
interactingprotein1GRMZM2G0083414α-玉米醇溶蛋白alpha-zein
protein2GRMZM2G0097176F-box蛋白F-boxprotein3GRMZM2G01802710
同OSJNBa0088A01.13样蛋白OSJNBa0088A01.13-like
protein4GRMZM2G0222691假定翻译延伸/起始因子家族Putativetranslation
elongation/initiationfactorfamily5GRMZM2G0358072未知蛋白质
Uncharacterizedprotein6GRMZM2G0465208假定蛋白Hypothetical
protein7GRMZM2G0488467中心蛋白Caltractin8GRMZM2G05853110包含
BTB/POZ结构域蛋白BTB/POZdomain-containing
protein9GRMZM2G074085960S核糖体蛋白L3160Sribosomalprotein
L3110GRMZM2G0741581淀粉磷酸化酶1Starch
phosphorylase111GRMZM2G08334710包含NAC结构域蛋白83NAC
domain-containingprotein8312GRMZM2G08782410未知蛋白质
Uncharacterizedprotein13GRMZM2G094074640S核糖体S14样蛋白40S
ribosomalproteinS14-like14GRMZM2G1002298钙调蛋白结合蛋白
Calmodulinbindingprotein15GRMZM2G1172307丙氨酸转氨酶2Alanine
aminotransferase216GRMZM2G1177077磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶
Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonatealdolase
117GRMZM2G1275912GDP-甘露糖转运蛋白GDP-mannosetransporter
GONST518GRMZM2G12945710假定蛋白Hypothetical
protein19GRMZM2G1298042未知蛋白质
Uncharacterized20GRMZM2G145496850S核糖体蛋白L27叶绿体50S
ribosomalproteinL27chloroplastic21GRMZM2G1669445木葡聚糖内转糖基
酶/水解酶蛋白23Xyloglucanendotransglucosylase/hydrolaseprotein
2322GRMZM2G3857872未知蛋白质Uncharacterized23GRMZM2G4044594
玉米醇溶蛋白L2bZeinpolypeptidesL2b24GRMZM2G4155297ABC转运G
家族成员43ABCtransporterGfamilymember43-
like25GRMZM2G4500554DNA复制许可因子MCM5DNAreplication
licensingfactorMCM526GRMZM2G4730017磷酸烯醇丙酮酸羧基酶4
Phosphoenolpyruvatecarboxylase427GRMZM2G5044013未知蛋白质
Uncharacterized28GRMZM2G1512682蛋白TON1bProteinTON1b
1.其他机体防御反应；2.翻译；3.肽的生物合成过程；4.肽的代谢过程；5.对其他
生物体的反应；6.响应外部的生物刺激；7.酰胺的合成过程；8.细胞内酰胺的代谢
过程；9.生物刺激反应；10.对真菌的防御反应；11.有机氮类化合物的生物合成过
程；12.对外刺激反应；13.响应真菌；14.防御反应；15.翻译延伸；16.多生物过
程；17.生物合成过程；18.有机体合物的代谢过程；19.细胞大分子生物合成过程；
20.大分子生物合成过程；21.细胞生物合成过程；22.核糖体；23.核糖核蛋白复合
体；24.叶绿体基质；25.质体间质；26.细胞的一部分；复合物；28.细胞；
29.细胞内；30.非膜结合细胞器；31.细胞内的非膜结合细胞器；32.脲基乙醇酸水
解酶活性；33.翻译延伸因子活性；34.糖原磷酸化酶的活性；复制原点的
结合；36.营养库活性；37.核糖体的结构成分；38.水解酶活性，作用于碳氮健；
39.磷酸化酶活性；40.结构分子活性；41.磷酸吡哆醛结合；42.磷酸烯醇式丙酮酸
羧化酶活性；43.核苷三磷酸酶活性；44.焦磷酸酶活性；45.水解酶活性，作用于
酸酐图4ZmCEN候选互作蛋白Geneontology注释eresponseto
otherorganism;ation;ebiosyntheticprocess;e
metabolicprocess;setootherorganism;setoexternal
bioticstimulus;iosyntheticprocess;aramidemetabolic
process;setobioticstimulus;eresponsetofungus;11.
organonitrogencompoundbiosyntheticprocess;setoexternal
stimulus;setofungus;eresponse;ational
elongation;-organismprocess;theticprocess;18.
organonitrogencompoundmetabolicprocess;armacromolecule
biosyntheticprocess;oleculebiosyntheticprocess;21.
cellularbiosyntheticprocess;e;cleoproteincomplex;
plaststroma;dstroma;rt;plex;
;ellular;-membrane-boundedorganelle;31.
intracellularnon-membrane-boundedorganelle;glycolate
hydrolaseactivity;ationelongationfactoractivity;en
phosphorylaseactivity;licationoriginbinding;nt
reservoiractivity;uralconstituentofribosome;ase
activity,actingoncarbon-nitrogen(butnotpeptide)bonds;39.
phosphorylaseactivity;uralmoleculeactivity;xal
phosphatebinding;oenolpyruvatecarboxylaseactivity;43.
nucleoside-triphosphataseactivity;osphataseactivity;45.
hydrolaseactivity,actingonacidanhydridesFig.4Geneontology
annotationofZmCENcandidateinteractingproteins
Ⅰ.BiFC载体图谱；Ⅱ.ZmCEN与TON1b蛋白在拟南芥原生质体中的互作。其
中,A～C为明场下的拟南芥叶片原生质体细胞图；D～F为拟南芥叶片原生质体细
胞的YFP荧光信号图；G～I为荧光信号与明场的叠加图图5BiFC验证ZmCEN
与候选蛋白TON1b的相互作用(Bar=2μm)Ⅰ.BiFCvectormap;Ⅱ.The
interactionofZmCENandTON1bproteininArabidopsisprotoplastcell.A-
-fieldimagesofArabidopsisprotoplastcell;orescent
imagesofyellowfluorescentprotein(YFP)inArabidopsisprotoplastcell;G-
imagesofepifluorescentandbright-fieldimagesFig.5BiFC
identifiedinteractionbetweenZmCENandTON1bproteins(Bar=2μm)
2.4BiFC体内验证ZmCEN与TON1b蛋白的互作
利用BiFC载体系统(图5，Ⅰ)验证ZmCEN和TON1b蛋白在拟南芥原生质体的
相互作用，如图5，Ⅱ(卡尔蔡司LSM880共聚焦显微镜100X油镜下观察并拍照)
所示，在构建的对照组N-端YFP半分子载体ZmCEN-pSPYNE(图5，Ⅱ，A、D、
G)和C-端YFP半分子载体TON1b-pSPYCE(图5，Ⅱ，B、E、H)分别转化拟南芥
原生质体，结果均未观察到黄色荧光的表达，当将两半分子YFP载体共转拟南芥
原生质体时，由于蛋白ZmCEN和TON1b蛋白发生相互作用可产生完整的YFP，
可观察到明显的黄色荧光的表达(图5，Ⅱ，C、F、I)，从而证明ZmCEN和
TON1b蛋白在拟南芥细胞内存在互作。
3讨论
构建高质量cDNA文库是利用酵母双杂交系统筛得大量互作蛋白的成功基础。本
实验构建的cDNA文库滴度为5.36×108CFU/mL，达到了文库筛选的要求。通
过构建的文库，筛选到了28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质，为进一步研究
ZmCEN的分子机制打下基础。
在筛选的28个与ZmCEN发生互作的蛋白质中，其中2个是玉米醇溶蛋白的相关
蛋白，已知玉米醇溶蛋白是玉米胚乳细胞中蛋白质的主要成分，但醇溶蛋白与
ZmCEN作用的机制还不了解。研究表明：玉米醇溶蛋白的积累过程与细胞骨架有
紧密联系，α醇溶蛋白在细胞骨架指导下，调控其基因转录形成mRNA，然后到
达内质网中，醇溶蛋白组分到达蛋白体中心区域，促使其体积增大，最后蓄积成球
状蛋白体[16]。而ZmCEN属于细胞骨架维管组织中心的一个组分，它与玉米醇溶
蛋白发生互作，可能与醇溶蛋白在细胞中的积累存在联系，确保胚乳细胞中的醇溶
蛋白达到足够数量及一定体积。二者之间的互作的机制研究对于玉米胚乳细胞的蛋
白含量、籽粒大小乃至玉米产量等研究都有一定的意义。
有研究报道NAC是植物特有的一类转录因子，在植物的发育调控、抗病、激素信
号转导、响应生物和非生物胁迫等都有作用[17]。本试验还筛选到2种与ZmCEN
互作的BTB/POZ(Bric-a-bractramtrackbroadcomplex/Poxvirusandzinc
finger)蛋白家族蛋白，该家族的蛋白质N端都含有一个保守的BTB/POZ蛋白-蛋
白结合结构域，以同源或异源二聚体的形式执行功能。此类蛋白质已经被证明执行
许多分子功能，包括转录调控、细胞形态维持、细胞增殖和凋亡、离子通道组装、
泛素途径降解蛋白等[18]。其中1种BTB/POZ结构的互作蛋白是一个NAC转录
因子(LOC103640879)。NAC家族转录因子在植物的次生细胞壁生物合成过程中
也起着重要的调控作用[19]。Zhong等[20]研究发现拟南芥NAC结构域转录因子
SND1(forsecondarywall-associatedNACdomainprotein)是调控纤维中次
生壁合成的关键转录开关和转录活化剂。Zhong等[21]研究表明，与水稻和玉米
次生壁相关的NACs(namelyOsSWNsandZmSWNs)在次生壁增厚方面双突变
体缺失的缺陷[22]。柳展基等[23]从玉米中克隆了ZmNAC1(EU224278)，发现其
受低温、干旱、高盐和ABA诱导表达，如形成纺锤丝、细胞板、细胞壁，并将细
胞能够均等地拉向两极，以保证子代细胞能与其亲代有同样的遗传信息。由于植物
细胞没有中心体，通过一个维管组织中心(MTOC)执行相同的功能，高度动态的微
管和微丝骨架是高等植物细胞分裂和细胞生长所必须的重要基本组成成分。
ZmCEN属于骨架结构微管组织中心蛋白，ZmCEN在MTOC中通过与其他蛋白
作用，共同完成细胞有丝分裂的一系列活动[21]。推测ZmCEN与NAC67互作也
可能参与细胞骨架的建成、维持细胞形态，细胞壁的形成、细胞的均等分裂等。本
研究也证实了ZmCEN与TON1b蛋白存在互作，研究表明，TON1b招募基序蛋
白(TRMs)与TON1b、蛋白磷酸酶2A共同作用，参与早前期带(preprophase
band，PPB)形成及细胞分裂的调控[24]。研究结果显示，拟南芥CEN1在体内与
TON1a相互作用，参与细胞骨架及有丝分裂前皮层微管和微丝PPB的形成，而
PPB在有丝分裂中决定细胞的分裂面和新细胞壁的位置[25]。TON1b蛋白与PPB
发生共定位，若将拟南芥的ton1基因突变，则不能形成PPB。TON1b蛋白为植
物在PPB形成所必须[26]。许多微管结合蛋白已经被证明参与PPB的形成，为
PPB决定细胞分裂面的位置[24]。由此推测，研究ZmCEN与TON1b的互作对于
玉米细胞分裂中细胞板分裂面和细胞壁的形成非常重要，为进一步研究ZmCEN
在玉米中的作用机制奠定了基础。
近年来采用酵母双杂交系统，筛选出了许多相互作用且有意义的蛋白[27-30]，如
本实验中与ZmCEN相互作用的蛋白NAC67、TON1b等，进一步说明该系统在
研究蛋白互作筛选候选蛋白方面具有重要意义。虽然该系统存在假阳性问题，但可
以通过其他实验手段对互作蛋白进行进一步验证。在后面的研究中我们将对筛选到
的其余蛋白逐一验证，并通过相互作用的蛋白研究ZmCEN的调控机制及生物学
通路。
参考文献:
【相关文献】
[1]VECCHIOAJD,HARPERJDI,VAUGHNKC,nhomologuesinhigherplants
areprominentlyassociatedwiththedevelopingcellplates[J].Protoplasma,1997,196(4):
224-234.
[2]WICKS，plantspindlepolescontainaproteinthatreactwith
antibodiestothecalcium-bindingproteincentrin[J].JournalofCellBiology,1988,107:455.
[3]SCHIEBELE,choffunctionforcentrins[J].TrendsCellBiol.,
1995,5(5):197-201.
[4]n,centrosomes,andmitoticspindlepoles[J].CurrentOpinionin
CellBiology,1995,7(1):39-45.
[5]somes:Sfi1pandcentrinunravelastructuralriddle[J].Current
Biology,2003,14(1):27-29.
[6]JUANMS,ightsintotheinteractionofcentrinwithSfi1[J].BBA-
ProteinsProteom,2016,1864(4):319-330.
[7]1phasconservedcentrin-bindingsitesandanessentialfunctionin
buddingyeastspindlepolebodyduplication[J].JournalofCellBiology,2003,162(7):1
211-1221.
[8]DORAORAG,2phosphorylationofhumancentrins1and2regulates
theirbindingtotheDNArepairproteinXPC,thecentrosomalproteinSfi1andthephoto
transductionproteintransducinβ[J].FEBSOpenBio.,2014,4(1):407-419.
[9]JASPERSENSL,GIDDINGSJT,3pisanovelcomponentoftheyeast
spindlepolebodythatinteractswiththeyeastcentrinhomologueCdc31p[J].Journalof
CellBiology,2002,159(6):945-956.
[10]SAWANTDB,MAJUMDERS,PERKINSJL,n3isaninhibitorof
centrosomalMps1andantagonizescentrin2function[J].MolecularBiologyoftheCell,
2015,26(21):3741-3753.
[11]JEANM,CYNTHIAR,OLIVUERF,N2modulateshomologous
recombinationandnucleotideexcisionrepairinArabidopsis[J].PlantCell,2004,16(6):1
633-1643.
[12]HUH,HEEHANJH,eofactionofcentrin:bindingofCa2+and
apeptidefragmentofKar1ptotheC-terminaldomain[J].JournalofBiologyChemistry,
2004,279(49):50895-50903.
[13]雷海英,白凤麟,王志军.玉米(ZeamaysL.)ZmCEN基因原核表达载体的构建及表达体系的优
化[J].长治学院学报,2016,33(2):5-9.
LEIHY,BAIFL,ctionoptimizationofexpressionconditionsofZmCEN
gene(ZeamaysL.)inprokaryoticcells[J].JournalofChangzhiUniversity,2016,33(2):5-9.
[14]雷海英,白凤麟,刘建霞,等.玉米ZmCEN基因的克隆、表达与生物信息学分析[J].华北农学报,
2016,31(3):18-24.
LEIHY,BAIFL,LIUJX,g,experssionandbioinformationsanalysisofmaize
ZmCENgene[J].ActaAgricultureBoreali-Sinica,2016,31(3):18-24.
[15]BERENDZENKW,BOHMERM,WALLMEROTHN,ingforinplanta
protein-proteininteractionscombiningbimolecularfluorescencecomplementationwith
flowcytometry[J].PlantMethods,2012,8(1):1-17.
[16]李强.玉米自交系醇溶蛋白突变性状的表征鉴定与遗传分析[D].太原:山西大学,2012.
[17]葛姗姗,唐桂英,毕玉平,等.玉米全基因组NAC基因家族的鉴定与分析[J].山东农业科学，
2015,47(2):1-6.
GESS,TANGGY,BIYP,-wideidentificationandanalysisofNACgene
familyinmaize[J].ShandongAgriculturalSciences,2015,47(2):1-6.
[18]ALBAGLIO,DHORDAINP,DEWEINDTC,/POZdomain:anewprotein-
proteininteractionmotifcommontoDNAandactin-bindingproteins[J].CellGrowth&
DifferentiationtheMolecularBiology,1995,6(9):1193-1198.
[19]邢国芳,张雁明,张魏斌,等.植物NAC转录因子的研究进展[J].山西农业科学,2012,40(4):
409-411,423.
XINGGF,ZHANGYM,ZHANGWB,chprogressofNACtranscriptionfactors
inplant[J].ShanxiAgriculturalSciences,2012,40(4):409-411,423.
[20]ZHONGR,DEMURAT,1,aNACdomaintranscriptionfactor,isakey
regulatorofsecondarywallsynthesisinfibersofArabidopsis[J].PlantCell,2006,18(11):3
158-3170.
[21]ZHONGR,LEEC,MCCARTHYRL,riptionalactivationofsecondarywall
biosynthesisbyriceandmaizeNACandMYBtranscriptionfactors[J].PlantCellPhysiol.,
2011,52(10):1856-1871.
[22]陈娜,蒋晶,曹必好,等.植物NAC转录因子功能研究新进展[J].分子植物育种,2015,13(6):1
407-1414.
CHENN,JIANGJ,CAOBH,estprogressesonplantNACtranscriptionfactors
function[J].MolecularPlantBreeding,2015,13(6):1407-1414.
[23]柳展基,邵凤霞,唐桂英,等.一个新的玉米NAC类基因(ZmNAC1)的克隆与分析[J]．遗传,
2009,31(2):199-205．
LIUZJ,SHAOFX,TANGGY,gandcharacterizationofatranscriptionfactor
ZmNAC1inmaize(Zeamays)[J].Hereditas,2009,31(2):199-205．
[24]薛秀花,任海云.细胞骨架在植物细胞周期进程中的动态变化及其调控[J].北京师范大学学报(自
然科学版),2016,52(6):687-695.
XUEXH,eletondynamicsandregulationduringplantcellcycle[J].Journal
ofBeijingNormalUniversity(NaturalScience).2016,52(6):687-695.
[25]AZIMZADEHJ,NACRYP,CHRISTODOULIDOUA,opsisTONNEAU1
proteinsareessentialforpreprophasebandformationandinteractwithcentrin[J].Plant
Cell,2008,20(8):2146-2159.
[26]DREVENSEKS,GOUSSOTM,DUROCY,bidopsisTRM1-TON1interaction
revealsarecruitmentnetworkcommontoplantcorticalmicrotubulearraysand
eukaryoticcentrosomes[J].PlantCell,2012,24(1):178-191.
[27]朱海龙,程光远,彭磊,等.甘蔗条纹花叶病毒P3蛋白与甘蔗Rubiso大亚基互作的研究[J].西
北植物学报,2014,34(4):676-681.
ZHUHL,CHENGGY,PENGL,ctionbetweensugarcanestreakmosaicvirusP3
andRubisolargesubunitfromsugarcane[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,
2014,34(4):676-681.
[28]赵艺泽,刘艳,王锡锋.利用酵母双杂交系统筛选介体异沙叶蝉中与小麦矮缩病毒外壳蛋白互作
的蛋白质[J].中国农业科学,2015,48(12):2354-2363.
ZHAOYZ,LIUY,ingofputativeproteinsinvectorPsammotettix
einteractedwithcoatproteinofwheatdwarfvirusbyasplit-ubiquitin
YeastMembraneSystem[J].ScientiaAgriculturaSinica,2015,48(12):2354-2363.
[29]曹新有,刘阳娜,陈明,等.采用酵母双杂交系统筛选GmDREB5的互作蛋白[J].西北植物学报,
2009,29(4):662-668.
CAOXY,LIUYN,CHENM,ingofproteinsinvolvedintheinteractionwith
GmDREB5usingYeastTwo-HybridSystem[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,
2009,29(4):662-668.
[30]梁浩,董爱武,俞瑜.水稻MRG701互作蛋白的筛选和鉴定[J].复旦学报(自然科学版),
2016,55(1):82-88.
LIANGH,DONGAW,inginteractionproteinsofriceproteinMRG701by
YeastTwoHybrid[J].JournalofFudanUniversity(NaturalScience),2016,55(1):82-88.