pcr实验

pcr实验

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2023年3月4日发(作者：疑难病例讨论模板)

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pcr扩增实验报告

篇一：DNA提取及PCR扩增实验

报告

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳

刘琳1131428环境科学

一、实验目的

1．学习并掌握PCR扩增的基本原

理与实验技术。

2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝

胶电泳试验，并分析相应结果。

二、实验原理

扩增

多聚酶链反应（PCR）技术的原理

类似于DNA的天然复制过程。在微量离

心管中加入适量缓冲液，加入微量模板

DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热

Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而

后加热使模板DNA在高温下（94℃）变

性，双链解链，这是所谓变性阶段。降

低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）

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与模板DNA互补退火形成部分双链，这

是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中

温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP

为原料，引物为复制起点，模板DNA的

一条双链在解链和退火之后延伸为两条

双链，这是延伸阶段。如此反复，在同

一反应体系中可重复高温变性、低温退

火和DNA合成这一循环，使产物DNA

重复合成，并在重复过程中，前一循环

的产物DNA可作为后一循环的模板

DNA而参与DNA的合成，使产物DNA

的量按指数方式扩增。经过30～40个循

环，DNA扩增即可完成。

琼脂糖凝胶电泳实验

DNA分子在高于其等电点的溶液中

带负电，在电场中向阳极移动。在一定

的电场强度下，DNA分子的迁移速度取

决于分子筛效应，即分子本身的大小和

构型是主要的影响因素。DNA分子的迁

移速度与其相对分子量成反比。不同构

型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳

方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA

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分子在泳动时的电荷效应和分子筛效

应，达到分离混合物的目的。

三、实验材料

仪器：PCR扩增仪、薄壁管、离心

管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、

水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、

buffer、两种引物、16S全长DNA样本、

无菌ddH2O、模板DNA、TBE、琼脂

糖、EB、显色剂。

四、实验步骤

扩增

本次试验选择细菌16SrDNAV3区

片段进行扩增。

根据计算，首先取离心管按照

10×Buffer、1uldNTP、ul341GC、ul

534、ulTaq、ddH2O的比例配置足量

的PCR反应体系。

分别向9个薄壁管中分别加入24ul

的反应体系，并分别添加8种不同的模

版，并于第9个薄壁管中加入无菌

ddH2O作为阴性对照。

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将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照

预定程序进行PCR扩增。其中循环过程

需要达到30~40次。程序如下：

预变性：94℃3min

循环：94℃变性30s

55℃退火30s

72℃延伸30s

末次延伸：72℃5min

PCR扩增完成后，将样品取出并保

存于15℃环境中。

琼脂糖凝胶电泳实验

称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，

加入适量的×TBE电泳缓冲液。然后置微

波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，

待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量

的EB。

取有机玻璃制胶板槽，在一端插好

梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右

的胶液，使之形成均匀水平的胶面。

待胶凝固后，小心拔起梳子，使加

样孔端置阴极段放进电泳槽内。

在槽内加入×TBE电泳缓冲液，至液

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面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测

DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶

的加样孔中。

接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，

调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，

开始电泳。点样端放阴极端。根据经验

调节电压使分带清晰。

观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。

当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停

止电泳。

在紫外透视仪的样品台上重新铺上

一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝

胶放在上面。关上样品室外门，打开紫

外灯，通过观察孔进行观察。

五、实验结果与讨论

如图所示：从左至右，分别是模版

1-8号，第9列为阴性对照。

前8列均有明显的条带出现，而阴

性对照无显示，说明扩增整体效果

很

好。图中有上下两条线，上面一条

线所

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覆盖的条带基本可以代表扩增的产

生

的片段位置，参照图可以看出扩增

片段

在200bp左右。在第9个阴性对照

的第

二条线处可以看到较为模糊的条

带，并

非是出现假阴性，而是由于二聚物

而产

生的条带。通过该条带与最右侧的

marker对比可知该片段出现在

100bp左

右，并非由于实验操作等问题而产

生的

污染。

实验的照片显示实验结果有拖尾

现象，但是并不影响后续实验。在

实验

过程中由于有些试剂加到了管壁上

面，

并没有完全加入，可能会出现一些

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误

差。另外在第1列条带中出现了其

他的亮带，可能是由于在前期的扩增实

验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇

匀和融合等操作产生了非特异性扩增，

也有可能是因为胶板制作过程中梳子的

位置不合适或者胶板制作时边缘处不够

均匀导致产生污染。但总体而言，实验

结果较为满意。

六、实验注意事项

1.由于PCR技术非常敏感，可使一

个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂

的离心管打开之前，应先在微量离心机

上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR

扩增反应的条件，要控制好温度、时间

和循环次数。

2.最好在加完所有其它反应成分后

才加模板DNA。

3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方

可制胶。

具有致癌作用，配制及使用时应带

一次性手套。并在专门的实验室内使用。

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七、实验收获

1.通过本次实验学习并掌握了PCR

反应的基本原理、实验过程及技术。

2.通过本次实验掌握了电泳实验分

离DNA的原理和方法。

八、思考题

1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌

某个酶的基因，你如何进行相关实验？

通过PCR扩增出想要的片段，然后

通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适

的载体连接，转化进感受态细胞。经过

培养提取质粒，进行酶切或PCR验证，

测序最终验证，保存菌种

2.一对引物序列为5

‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和

5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA

请计算它们的Tm值及选择合适的退火

温度，如果按你算的退火温度做PCR时

没有得到相应的产物，你怎么解决？

5

‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’

Tm值=4（G+C）+2-

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=4（3+7）+2（6+4）-

=60℃-

=50~55℃

5

‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’

Tm值=4（G+C）+2-

=4+2-

=64℃-=54~59℃

因此退火温度可以选择在55℃

可以通过分析几个逐步提高退火温

度的反应以提高特异性。开始低于估算

的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退

火温度。较高的退火温度会减少引物二

聚体和非特异性产物的形成。为获得最

佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会令

引物在循环中使用较低的退火温度而表

现出明显的错误起始。如果两个引物Tm

不同，将退火温度设定为比最低的Tm

低5℃或者为了提高特异性，可以在根

据较高Tm设计的退火温度先进行5个

循环，然后在根据较低Tm设计的退火

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温度进行剩余的循环。这使得在较为严

紧的条件下可以获得目的模板的部分拷

贝。

篇二：PCR实验报告

普通生物学实验报告

实验名称：用PCR扩增的方法鉴别

不同物种来源的肌肉

一、特异性目的片段DNA的扩增

（一）实验原理

聚合酶链式反应（PolymeraseChain

Reaction,PCR）是体外酶促合成特异

DNA片段的一种方法，其基本原理为

DNA的半保留复制。PCR技术由①高温

变性模板；②引物与模板退火；③引物

沿模板延伸这3步反应组成一个循环，

通过多次循环反应，目的DNA得以迅速

扩增。其主要步骤是：将模板DNA置于

高温下（通常为93℃-94℃），使其变性

解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引

物在其合适的复性温度下分别与目的基

因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚

合酶（Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物

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的3’端开始掺入，以目的基因为模板按

5’→3’的方向延伸，合成互补链。

本实验采用物种特异性引物扩增的

方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物DNA为模板，用

物种特异性的引物进行PCR扩增，只有

在模板和引物的物种相对应的情况下才

会有特异性条带的出现。应用此方法，

可以特异性地检测样品中痕量的特定

DNA成分。

（二）实验步骤

1.不同反应体系的配制

按下表将各成分分别加入一做好标

记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR

反应体系，注意酶要最后加，加完后将

PCR管放置在冰上。

2.将上述混合液稍加离心，约10s

左右。取下后立即置于PCR仪中，盖紧

热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩

增程序。

反应程序为：

预变性94℃5min

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变性94℃5s

退火50℃5s

延伸72℃20s

后延伸72℃5min

3.反应结束后，终止程序，将PCR

管取出，放置于4℃，待电泳检测。循

环30次

二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定

PCR产物

（一）实验原理

核酸分子是两性解离分子，在高于

其等电点的电泳缓冲液（pH)中，其碱

基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸

分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而

来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性

分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介

质，发挥分子筛功能，使得大小和构象

不同的核酸分子的迁移率出现较大差

异，从而达到分离的目的。

（二）实验步骤

1.制胶

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称取琼脂糖，放入250ml的锥形瓶

中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉

高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼

脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液

澄清透明。待琼脂糖温度降到60℃左右

时，按1:20000的浓度加入GoldenView,

混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具

中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。

轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放

入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至刚好

没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。

2.加样

取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓

冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。每加

完一个样品应更换一个吸头。加样前，

要记下加样的顺序。在每排样品孔中留

出一个位置加入5μl的marker。

3.电泳

加样后的凝胶板立即通电进行电

泳，电压100V，样品由负极向正极移动。

当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，

停止电泳。

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4.拍照

电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶

成像系统拍照保存。

三、实验小结

（一）实验结果

PCR产物电泳结果

由上图可以看出，样品1和样品6

出现了目的条带（大小约200bp），所以

DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3

为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。

（二）实验讨论

1.在加入Taq酶时，应始终保持酶在

冰浴中，不可握在手中。

2.每加完一次酶，都应更换吸头。因

为在加酶时，吸头会插入液面以下，为

防止污染，应更换吸头。

3.拔出梳子时，应两端一起用力，垂

直，缓慢地拔出，以免破坏胶孔。

4.将样品与上样缓冲液混合时，要反

复吸进，挤出溶液。为防止出现较多气

泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残

留少量溶液。

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5.在加样时，吸头要垂直于凝胶板且

不要插入太深，以免破坏样品孔。

6.我们组的电泳图中，条带不是很明

显，应该是加样时样品的量不够充足，

以后应注意。

篇三：PCR实验报告

PCR实验报告

实验目的：了解PCR技术原理，掌

握最基础的PCR实验步骤。

实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，

dNTPs，TaqDNA聚合酶，引物，H2O。

实验原理：

?PCR全称聚合酶链反应，是体外

快速扩增特定基因或DNA序列最常用

的方法。

?基本原理：首先将双链DNA分子

在临近沸点的温度下

加热分离成2条单链DNA分子，

DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用

反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合

成新的DNA互补链。PCR反应时，只

要在试管内加入模板DNA、PCR引物、

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四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA

聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增

100万倍以上。

（1）双链模板DNA分子首先在高

温下解开成长的单链，短链引物分子立

即与该模板DNA

两端的特定序列相结合，产生双链

区。

（2）DNA聚合酶从引物处开始复

制其互补链，迅速产生与目标序列完全

相同的复制品。

（3）在后续反应中，无论是起始

模板DNA还是经复制的杂合DNA双

链，都会在高温下解

开成为单链，体系中的引物分子再

次与其互补序列相结合，聚合酶也再度

复制模板DNA。

（4）由于在PCR反应中选用的一

对引物，是按照与扩增区域两端序列彼

此互补的原则设计

的，因此每一条新生链的合成都是

从引物的退火结合位点开始并朝反方向

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延伸的，每一条新合成的DNA链上都有

新的引物结合位点。

（5）整个PCR的反应全过程，即

DNA解链（变性）、引物与模板DNA结

合（退火）、DNA

合成（链的延伸）三步可以被不断

重复。经多次循环之后，反应混合物中

所含有的双链DNA分子数，即两条引物

结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理

论上的最高值应该是2

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，能进一步满足遗传分析的需要。

?试剂作用：

（1）引物：DNA复制的起始点，

针对复制DNA片段的两端，有5’引物

和3’引物

（2）TaqDNA聚合酶：促进dNTPs

与模板结合。

（3）Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，

TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应

条件。

（4）Mg2+：对PCR扩增效率影

响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特

异性，浓度过低则

影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增

失败而不出扩增条带。

（5）dNTPs：底物，在引物引导下

合成与模板互补的DNA新链。

（6）石蜡油：防止PCR加热过程

中DNA蒸发。

?试剂配置体积：

（1）热启动：94℃，5~10min

（2）变性：94℃，45~60s。

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（3）退火：50~65℃，1min。退火

温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链

温度）=4（G+C）

+2（A+T）。

（4）延伸：72℃，1~。

（5）步骤（2）~（4）热循环25~30

个周期

（6）保温：延伸72℃，10min

?产物检测：凝胶电泳。

实验步骤：

（1）设计20μl体系各试剂配比：

（2）按照预先设计的20μl体积配

置6管试管量，实际加入量如下表

（3）完成后分6管加入pcr管中，

每管15μl体积，标注1-6号码。

（4）在前1-~4号PCR管中加入模

板DNA，在5号管中加入C3H模板作

为阳性参照，6号中不加任何模板DNA，

作为阴性参照。

（5）在加完模板的6管试剂中各加

入20μl石蜡油

（6）将PCR管放入

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PCR仪，按之前设定的加热温度与

时间设置

a．热启动：94℃，2min；80℃，1min；

此时在各管中加入dNTPs4μl

b．变性：94℃，30s；

c．退火：65℃，；

d．延伸：72℃，2min

步骤b~d循环40次

e．保温：72℃，10min

（7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）

电泳进行检测。

实验结果：

PCR目标产物约为295bp

琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示

123456Marker

1、2号泳道为♂性小鼠DNA模板的

PCR产物

3、4号泳道为♀性小鼠DNA模板的

PCR产物

5号泳道为C3H阳性参照

6号泳道为阴性参照

由Marker参照可知，PCR产物大小

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约为290~300bp