半定量pcr
-
2023年3月6日发(作者：徽州民居)RT-PCR实验方法总结大全
生物谷:RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。
要求:
1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng
或1ug。
按要求做,一般不会出太大问题。
,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA
存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须
在RT时,引物设计有3种方法即a:Random9mers;b:OligodT-Adaptor
Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上),
还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?
问题:
在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一
种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到
许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:
已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不
会和这有关呢?请高手指教!
解答:
-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转
录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测
是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。
(promega)。
-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5…,3?RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略
定量的话还应考虑R
NA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将
RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
我做过RACE(3?RACE是宝生物的Kit;5…RACE是Gibico),但现在再进行另一
个同源基因的3…RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来
的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3?UTR却增么也扩
不出来,我推测是不是该基因的3…UTR太长的缘故,我都快绿了,有无
RT-PCR的常用内标b-actin和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不
同的刺激。
有关内参:
RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把
除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表
达的相对浓度。
问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin和目的基因引物。虽然可见到两条
均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教mxbdna2003,你是如何
处理同一管的PCR的各成分的浓度?
答:otforthe
wasconvienenttoguesstheamountot
thetemplate<(forRTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorif
amountjustusing"accurate
piptte"dberememberedtodotheinnercontrolof
housekeepinggeneeverytime.
在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量
的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这
肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到
均一条带就很好了。
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总
是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板
中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同
基因之间。
有关内参的建议:
一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都
谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是
绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。2、以电泳为
基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终
结果的,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,
长度差不多,GC含量相似,或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2
的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动
力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。我们
学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的
关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物
ntp都是这样。烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范
围内,所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切
线,这图我在***帖过。
关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,
根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR)、长度小于
500bp-600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机
器里啊。我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,
也不用查。
我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件
的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是
限制是只能用总RNA为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH
这个破烂了。18s除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基
因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教。我认为,就
像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖
造成的,比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是
服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用的那
条序列,不知有没有人用过,告知其序列和genbank号。
正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的actin的荧
光探针还没有完,当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)?
原位杂交最好用RNA做探针,效果好一些,反正你有钱卖roche的盒子,而且量
也能保证,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都
有详细的描述,但是许多人还
是历经多次磨难,有时就是得不出结果。因此,我认为因为每个人所要克隆的
片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历
说明:做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的RT-PCR时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下
游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的
克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用RT-
PCR克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复
出她的产物),因此,我先用她的引物和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产
物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9mers随机引物),用我的引进物进行一般
PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到,但足
可以说明实验可以有自己的模式,书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要
受到书本框框和别人经验的限制
请问:
1引物的特异退火温度怎样设定?可以根据gc和at含量算出吗?可以用引物
报告单上的Tm值吗?
2PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适?MgCl2应加多少?各个成分的
量有无确定标准?
3PCR结果跑电泳,actin有,但跑不出目的条带,有几种原因?与cDNA的量少
有关吗?Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性?
一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,
剩下的可以摸的.
20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以
的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.
如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要
原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要
辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程
中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA
的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑
制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它
分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、
玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则
含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被
氯仿腐蚀,故不能使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在
3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压
灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配
制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和
RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也
使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强
烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合
形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋
白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5.其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5?端帽子结构(m7G)和3?端的
Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3?端存在20-30个腺苷酸组成的
Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便
的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基
础就在于此。
mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常
规方法。此法利用mRNA3?末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素
柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或
在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到
较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1.3M醋酸钠(pH5.2)
2.0.1MNaOH
3.1×上样缓冲液:20mMTris-HCl(pH7.6);0.5MNaCl;1MEDTA(pH
8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、
EDTA(pH8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却
至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:10mMTris-HCl(pH7.6);1mMEDTA(pH8.0);0.05%SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
二、操作步骤