pcr实验步骤

pcr实验步骤

李应霞-人从众

2023年2月22日发(作者：我的童年)

荧光定量PCR原理及实验步骤

一、实时荧光定量PCR原理

常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始

模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术，在PCR反应体系

中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增

产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

几个概念：

（1）扩增曲线：

（2）荧光阈值：

（3）Ct值：

（4）标准曲线

SYBRGreen工作原理：

1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位

2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光

4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光

信号。

二、实验步骤

1.实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。

1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen

的用量。

2、反应体系（25μL）如下：

H

2

O11μL

SYBgreen12.5Μl

上游引物0.25μL

下游引物0.25μL

cDNA1μL

可先将H

2

O和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模

板。

4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。上机。