简并引物
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2023年2月27日发(作者：车间巡检记录表)引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增
高。太长则比较浪费,且难以合成。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝
4(G+C)+2(A+T).
(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由
于密码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。
(6)两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好
不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合
位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在
5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生
非特异性扩增,影响产量。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不
存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚
体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯
中,260nm下,引物浓度可按下式计算：
Xmol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。
分子生物学实验作的并不多，我的几点经验，
1直接查文献照搬别人成功的引物最省事。
2需要多对引物时，最好退火温度设计为同一温度，便于实验同时进行。
3RT-PCR及RealtimePCR的引物必须包含intron，以排除genomicDNA的影响
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一
基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基
因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温
度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相
差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一
定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其
Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，
会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使
在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、
C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布
最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因
这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身
复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4
个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer
与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于
4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正
常进行。
8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，
△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝
对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA
聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而
不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+
等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列
等。
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二
级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有
助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成
功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11.引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以
进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产
物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条
件。
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所
要求的参数是不同的。引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp
最为合适（可以延长至300bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨
外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一
大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在
GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物
种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出
其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是
真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一
序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有ClustalW，也可在线
分析[url][/url]/clustalw/。
三、确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～400个aa为
宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，
因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区
域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到
要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复
调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。
四、利用软件设计引物
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，
将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简
并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸
链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A
／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷
酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两
个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守
区域内，结果会有数对，分数越高越好。
五、对引物的修饰
若得到的引物为：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可
以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好
这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。
最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分
类地位相同的其他物种。
如果知道了基因序列，（从pubmed上下载的）怎么样设计出最合适的引物呢？关于引物设
计，有oligo和primer5两种主要的软件，但是这两个软件***版的在网上很难找，我这里
有primer5的***版.
还有一种简便易行的因无设计方法，那就是利用在线的因无设计软件primer3.0
进行引物的设计
1.打开网址:/cgi-bin/primer3/primer3_
2.在框中粘贴入你的原始序列(要比你要扩的目的片段两端延伸一点)
3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引
物退火温度等,你可以进行设定
4.点击"pickupprimers"就会出现下一页,上面会列出多种设计，一般来说，第一对引物是
最适合的。
同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增
高。太长则比较浪费,且难以合成。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝
4(G+C)+2(A+T).
(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密
码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。
两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4
个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、
起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限
制酶位点外再加1-2个保护碱基。
引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特
异性扩增,影响产量。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在
简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
RT-PCR引物设计原则和方法
在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，
在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序
列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引
物窗口。
此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引
物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search
Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长
度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按
照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的
综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G
或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容
易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～
55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口
的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误
引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级
结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”
为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配
的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的
评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量
感觉不如Primer5。
在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在
菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面
有该引物的详细信息。
在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序
列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口
和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上
游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligo
length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游
引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单
中各种强大的引物分析功能了。
Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，
其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算，会比Primer5
中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG。3’端的DeltaG
过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最
好不要超过9。
Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，
分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即
上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应
该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta
G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分
析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。
Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同
样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基
的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间
的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbor
method、％GCmethod和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的
方法，Tm值可以控制在50～70度之间。
第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分
析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使
错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，
错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应
Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。
若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的
评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo
软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG
窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他
基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有
交叉的其他基因的同源序列就可以。
有一个问题，引物设计原则里面常常强调，引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，
但是软件里面Search出来的引物，很少有达到这个值的，一般都在50～65度之间，这是
什么原因？软件怎么没有限定这个规则？
PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序
列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二
级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可
以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600
碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱
基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻
找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的
互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记
生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，
因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为
密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如
前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗
万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二
级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开
这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，
Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃),
不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%
寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）
+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使
复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3
个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级
结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不
能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不
应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除
在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四种dNTP各
200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参
数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶
A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：
模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影
响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；
引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会
影响扩增特异性与效率。
PCR引物设计及软件使用技巧
2006-12-219:54:41信息来源：来源网络
PCR引物设计及软件使用技巧
生物谷网站PCR引物设计及软件使用技巧
张新宇，朱有康，高燕宁
（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）
摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详
细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性
引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。
关键词：PCR；引物设计
中图分类号：Q524文献标识码：文章编号：
1
自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PC
R
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避
免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即
错配)。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度
（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性
(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplex
formationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的
GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，
引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增
加[2]。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配
位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应
当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反
应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearest
neighbormethod)[6][7]。
6.?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定
性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G值相对较高的引
物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载
体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
2
含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产
物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条
件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数
商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在
这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以
“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、
“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件
的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”
进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
PrimerPremier5.0的使用技巧简介
1.功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、
限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源
性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、
语音提示键盘输入（）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见
结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会
遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列
组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚
结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模
板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结
构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）、无脊椎动物线粒
体（InvertebrateMitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（PlantMitochondrion）、
原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vert
ebrate
Mitochondrion）和酵母线粒体（YeastMitochondrion）。
2.使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
3
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功
能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列
等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新
限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingPrimers），
杂交探针（HybridizationProbes）。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引
物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游
引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外还可改变选择区域（Search
Ranges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParamete
rs）
4
等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分
为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
5
性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引
发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最
好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾
给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改
引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo6.22使用技巧简介
1.功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo6.22的界
面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物
设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.使用（以Oligo6.22为例）
Oligo6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6
至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发
6
的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windo
ws
菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左
下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。?G值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线
为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选
用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falseprimingsite的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的
7
8
模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“PrimerPremier5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由WhiteheadInstitute
开发的“Primer3”等（本网站
210.72.11.60已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。
参考文献（References）：
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协
和医科大学联合出版社,1991.
[2]林万明著.PCR技术操作与应用指南.北京:人民军医出版社,1993.
[3]朱平主编.PCR基因扩增实验操作手册.北京:中国科学技术出版社,1992
[4]郑仲承.寡核苷酸的优化设计，生命的化学,2001,21(3):254-256.
[5]bes.1992.
[6]Oligo软件帮助文件().
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cAcidsRes,1985,13:8927-8938.
[8]Rychlik,ads,terprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilter
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