溶剂效应

溶剂效应

数学函数图像-333k

2023年2月21日发(作者：外贸单证员考试)

液相色谱分离的溶剂效应

“溶剂效应”会致使哪些峰形异样？如何幸免溶剂效应？在HPLC分析中样品溶剂的选择和流动相是如何的

联系？为何建议利用流动相溶解样品？。。。。。一系列的问题都和样品溶剂的选择紧密相关，如何解决真正

的溶剂效应问题，又如何分辨哪些是非溶剂效应问题，不同的问题有不同的解决方式，有哪些先辈留下的实战

体会可供分享呢？一路来看看吧！

什么是溶剂效应?

样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。即色谱图上较早洗脱的峰前沿

或开叉，与此同时较晚洗脱的峰那么较为正常的现象。例如样品溶液的溶剂是100%乙腈（100%的强溶剂），

而流动相的组成那么较弱，18%的乙腈与72%的水。第一个峰是开叉的，而且与第二个峰相较，明显地变宽了。

当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。

可能发生溶剂效应的情形：

出峰时刻早；

保留弱；

进样量大。

用流动相溶解样品能够取得专门好的峰形

当溶解样品的溶剂不同于流动相时，样品溶剂与流动相发生混合，样品溶剂被冲稀。若是进样溶剂

之强度高于流动相，样品在刹时会表现为在较强溶剂中，并以较快速度通过色谱柱。表此刻色谱图

上确实是∶色谱峰的保留时刻缩短。`当进样溶剂与流动相混合时，一部份分子会先与流动相混合，

致使这些分子通过色谱柱的速度发生转变，使峰形扭曲，发生变形。洗脱较早的色谱峰峰变形要比

洗脱晚的色谱峰严峻。解决进样溶剂问题的关键是使进样体积足够小，如此稀释进程会超级快；或

利用比流动相弱的溶剂溶解样品。较弱的溶剂会使样品在色谱柱上发生浓缩，在某些情形下，色谱

峰会比利用较强溶剂时窄一些。因此，在通常情形下，若是溶解样品的溶剂比流动相强，进样体积

应不高于25mL。进样体积大小与进样溶剂与流动相之间的不同大小有关。这一不同很容易凭体会

取得∶慢慢加大进样体积，直至发生峰变形现象。采纳比发生峰变形时小一些的进样体积即可。问

题中发生的峰变形确实是因为溶解样品的溶剂甲醇强度远远高于流动相，因此取得了变形的、展宽

的峰。若是利用水来溶解样品，溶解样品的溶剂弱于流动相，峰形会得以改善。在离子对色谱中，

咱们建议利用流动相来溶解样品，以最大程度地降低基线假峰的显现。

样品溶剂别离为100%乙腈、流动相时峰形分析

上图中，色谱图上较早洗脱的峰扭曲变形或开叉，与此同时较晚洗脱的峰那么较为尖锐与对称，这

些现象显示一个比较特殊的起因——样品溶液的溶剂极可能强于流动相。此种强溶剂效应的例子在

左图中可见。此处的样品溶液的溶剂是100％乙腈（100％的强溶剂），而流动相的组成那么较弱，

18％的乙腈与72％的水。第一个峰是开叉的，而且与第二个峰相较，明显地变宽了。当样品溶液

的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。见右图。

什么缘故呢？这是因为当样品进样时,有可能显现峰展宽,最正确的样品溶液组成和体积将会维持在

10%乃至更低,在那个例子里,当样品溶剂与流动相溶剂强度不同时,换句话来讲,也确实是样品未用流

动相溶解,因此,有些样品分子溶解在强溶剂中,并随强溶剂流过柱子,而有些那么溶解在流动相中,从

而致使峰分叉.

当样品与流动相强度相差较小,进样阻碍也会小,第一个峰可能会宽于第二个峰,而当这种展宽致使必

要的分离度降低时,如此情形应引发注意,在左图中,利用一根短柱,和5μL进样,这与最正确进样体积

4μL相近,用了极性更强的溶剂致使分离度明显的降低,从降到(如右图,分离度为2或更大是评估一个

完善方式的一个必要参数,也是天天方式的验证参数,只是一个大体的分离度,任何一个方式或一根柱

子都必需知足那个条件,当进样为一倍时,也确实是10μL时,分离度更一步降低,此方式就不行了。

样品溶剂选择不妥的解决方式

样品溶剂最好具有哪些特点比较好？

HPLC溶剂的要求

溶剂的极性要与待测样品相匹配，若是溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但阻碍纯化分离，且会

使柱子恶化。

实战问答Q&A，绝对接地气！

里面的溶剂效应是如何产生的，该如何幸免？

如何判定分叉的峰是不是由溶剂效应造成，第一确实是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外

吸收波谱，看看他们是不是能完全一样的µV特点吸收，第二将进样体积调剂到µl看看，峰是不是

好转，若是知足上面两个条件几乎就能够够确信是100%的溶剂效应。

产生缘故1，样品溶液的溶剂极可能强于流动相。例如样品溶液的溶剂是100％乙腈（100％的强溶

剂），而流动相的组成那么较弱，18％的乙腈与72％的水

产生缘故2，确实是进样量比较大，

产生缘故3，样品的pH值与HPLC流动相pH差异，比如酸性流动相体系，样品pH偏碱性

（pH=10）,这种情形下也很有可能发生其实上面三个缘故归结起来确实是一个缘故，那确实是样

品的溶剂与流动相存在一些不一样，当样品进入流动相的时候，由于这种庞大的不同，一部份样品

溶解进入了流动相，一部份还留在进样的溶剂里面，因此在HPLC上显现了保留的不同，因此要解

决那个问题的最正确方案确实是，利用流动相的起始梯度溶解样品，若是由于溶解度的问题，不能

不改用其余的溶剂，那就只能降低进样体积来解决，比如5µl，1µL。

2.高效液相做专属性实验时,溶剂峰和目标峰出峰时刻一样如何办?分离的是氨基酸类物质，不是离

子型化合物，流动相用的甲醇和水，也是用流动相配的溶剂，可是比例有少量不同，单进溶剂时确

实有溶剂峰，用流动相配的样品能够和溶剂峰分开，我在做肠灌流实验，可是当样品进入动物体内

灌流后，进样后就分不开了，我想把样品的出峰时刻延长一些，以为能分开，可是不明白怎么调整，

实在没方法。

回答：

问题1：你用的稀释剂是纯的有机相吗?稀释剂中有机相的比例一样尽可能与流动相一致,以减小溶

剂效应.若是改变稀释剂仍不能改善,那么说明你的色谱条件不适合,检测组分在色谱柱中几乎无保留.

若是你的化合物是离子型的,一样需要利用缓冲盐,缓冲液pH值应在化合物pKa值正负2之外,以增

强组分在色谱系统中的保留.若是不是离子型化合物,那么减少有机相较例,以增加组分保留时刻,躲开

溶剂峰.

问题2：氨基酸类物质是两性化合物，出峰时刻跟pH值有专门大关系，样品通过动物体内后，pH

值确信是发生了转变的，样品的预处置就很重要了（那个你要请教其他高人，我没做过生物方面的

药物分析）。若是你只是想单独延迟样品出峰时刻，能够试着减少有机相较例，看能不能达到成效，

若是不行，可能仍是要用缓冲体系。

3.醋酸曲安耐德用高效液相色谱测定，流动相为甲醇-水（60:40），ODSC18柱，紫外检测波长

240nm，柱温30度。以前样品用甲醇溶解后直接进样，色谱峰各项参数正常。此刻用甲醇溶解后

进样，色谱峰变宽，必需用流动相溶解才能正常。仪器与色谱柱未改换，溶解样品的甲醇换成默克

色谱纯甲醇也仍是如此！什么缘故？另外我需要测定的另一个中药中黄芩苷也显现了这种现象？我

此刻该如何办？

解答：溶剂效应是确信的。溶剂效应的原理其实很简单：确实是溶质的极性和流动相的极性不匹配，

致使溶质被流动相包裹或部份包裹，不能充分分散并充分与C18互换，因此才致使峰展宽。你的醋

酸曲安耐德极性并非是很强。我帮你查了它的log

P，没查到，但依照我的体会，并依照其结构式我可能推算了一下，应该在2左右，应该属于中等

偏弱极性的化合物（C26）。因此其在60：40如此含水流动相匹配度确信不行。以前你做的没有问

题，一个缘故是上面列位所说的，溶解样品的甲醇可能含水量略微高一些，比如大约含水2%（只

是猜想哈），可能就可不能显现溶剂效应，而这次用的甲醇含水量很低。另一个可能的缘故我感觉

可能是原先柱子相对照较新，用了一段时刻后，柱头可能有塌陷，致使溶剂效应加重（这种可能性

更大一点）。这些都是猜想的，不然很难说明以前专门好，此刻不行的缘故。

无非确实是这两条。至于黄芩苷，我也查了其结构式，极性跟醋酸曲安耐德也差不多，能略微强一

点。一样的问题。解决方法：你能够尝试用90：10的溶液溶解样品再试一下，若是变好了，那就

说明溶剂效应很明显。只能改变溶剂样品的溶剂了，没别的方法。

关于排除溶剂效应，在咱们利用的甲醇当中，其实并非是单单甲醇，还有其他成份，只是这些个成

份，在紫外下不干扰测定罢了做过度离的朋友都明白，不同厂家，不同批次间甲醇的洗脱能力，体

会证明确实不尽相同的，专门是关于对极性条件相对苛刻的分离情形。因此，问题可能在于甲醇上，

有条件的话，是不是能够测一下那个批次甲醇的水分呢。固然，溶剂效应还有其他方面的阻碍，比

如系统，色谱柱...

4.今天我做葛根素的测定，葛根素是用30%乙醇溶解，流动相是甲醇-水（25:75），半年前的色谱

峰对称系数为，此刻变成了，峰明显变胖！什么缘故此刻只要不是用流动相溶解，就会显现峰变形

的情形呢？与我的仪器是不是有关系，仍是溶剂（比如甲醇）有关呢？

一、葛根素和黄芩苷包括醋酸曲安耐德他们都是结构超级相似的三个化合物，因此一个出问题，所

有的都会有相似的问题的。我感觉问题最大的可能仍是在色谱柱的柱头。溶剂效应现象，柱子越细，

进样量越大，目标化合物和流动相极性匹配度不同越大，问题越明显。若是你用的是超高压的话，

会更明显。我在做HPLC/MS/MS的时候，用的都是的柱子，大体上都要用流动相来溶解样品，不

然绝大多数情形下都有溶剂效应。你若是用超高压HPLC这种溶解效应会很显著。这种问题没别的

方法，只有改用流动相溶解。

二、你上面提到的葛根素的测定要做一个对如实验：一个是纯溶剂溶解的，一个是流动相溶解的。

若是二者有区别，那说明是溶剂效应问题，建议先用异丙醇清洗系统，若是溶剂效应还在，建议再

换成20微升进样定量环，每次进10微升。满环进样仍是有很明显的溶剂效应，工程师也没有跟好

的方法。

若是二者没有区别，那就不是溶剂效应问题。你半年前做的好好的，不代表这根柱子此刻就必需必

然得好好的，若是柱子利历时刻长了，脏了，对称因子从也是超级正常的。我不明白你做过对如实

验没有？

若是单纯是拖尾的问题，那很简单，你把柱子入口部份打开，将柱头脏的部份用一个特制的小铲掏

出来，再用C18填料（散装，最好是入口的，不限品牌）用乙腈调成糨糊状，将缺少填料部位填实

（注意填料别弄的处处都是，阻碍密封成效），再装好，从头利用，就会恢复到以前的的状态。若

是塌陷的比较多，填完正常利用一两次，让高压将后填的填料压实，再重复填装一次。如此这根柱

子还会继续利用很长时刻。柱子柱效降低或峰拖尾90%都是那个缘故。