原性

原性

国家公共营养师-清朝疆域

2023年2月21日发(作者：学校背景)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则

摘要：

几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体（anti-drugantibody，

ADA）反应，抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体

内，抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质，抗药

抗体反应能引起各种临床的不良反应，包括温和事件及严重不良事件。临床前研

究表明，抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动

力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机

构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性，以及将实验结果与临床事件联系

起来，在临床前研究和临床研究中，很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体

反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要，并且方法学验证是药物上市申

请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限，特别

是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此，本文对抗药抗体免疫分析方

法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独

特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。

这些建议被视为最佳的例子，旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检

测方法。

1．简介：

生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般通过人细胞系、

哺乳动物细胞或细菌进行表达，比常规的小分子药物更大（一般大于1~3KD）。

由于以上特性，生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与

产品的内在因素（种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂

质和制剂）、外在因素（给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、

患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法）相关。

抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状，包括过敏、自身免疫和不同的药

代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使

药物的的疗效发生改变）。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指

标，这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的。因此，美国食品

药品监督管理局以及欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均要求通

过药理学或毒理学相关的方法对抗药抗体进行评估。免疫原性与临床症状之间的

相关性的研究依赖于临床前研究和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征。

因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当的开发及验证。

已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的策略、方法开发及优化等方面的指

南。方法学验证是对分析方法的评价，通过特定的实验室方法表明采用的分析方

法适用于相应的检测要求。具体到抗药抗体的检测方法，验证就是指证明该方法

能可靠的（例如一致性和重复性）在复杂的生物基质（血清或血浆）中检测出低

量的药物特异性抗体。方法学验证应该通过预先研究阶段和研究阶段两个阶段进

行，预先研究阶段是指在分析样品之前的工作，研究阶段是指样品的分析工作，

预先研究阶段和研究阶段对于表明分析方法的有效性和可控性同等重要。本文主

要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的主要性能特征，推荐方法学验证相关的方法

和措施。本指南应当被视为最佳实践范例，考虑到具体实际分析方法时，在保持

科学合理性和客观性的情况下，也可以采取替代方法。若采用替代方法，建议与

监管机构进行充分讨论。以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导

的免疫分析不在本指南的讨论范围内。

2.方法

2.1抗药抗体检测

临床和非临床研究通常是通过对治疗引起的抗药抗体反应的检测和表征来

评估药物的免疫原性。目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测，包括酶联免

疫法（ELISA）、放射免疫检定法（RIA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等离

子体共振（SPR）、电化学发光法（ECL）。每一种检测方法均有其优点和局限性，

在最近的文章中已进行过讨论[8,14]。不管是采用何种方法，在方法开发和优化

后均应进行正式的方法学验证，以保证该方法适合相应的检测要求。因此可以预

测，本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测。研究人员应根据检测

系统的特点确定合适的方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体的检测和表征通常包括四种不同类型的方法。抗药抗体

检测试验通常包括筛选试验和特异性确证试验，表征试验通常包括抗体滴定和中

和抗体检测[10]。应用到具体研究样本时，抗药抗体分析试验需要两个关键决策

参数，分别为筛选试验的筛选临界点（screeningcutpoint）和特异性确证试

验的特异性临界点（specificitycutpoint）。筛选临界点有助于抗药抗体检

测结果的分类，高于筛选临界点为活性样品（活性样品通常为潜在阳性样品），

低于临界点为无活性样品。活性样品通过特异性确证试验（如竞争性药物抑制信

号通路）检测是阳性（特异性活性）还是阴性（非特异性活性）。特异性临界点

为抑制信号通路所需的样品量，也就是具体药物的抗药抗体，需要通过试验确定。

抗药抗体的检测方法通常是非定量试验（有时是半定量试验），因为没有可

用的标准化的物种特异性的抗药抗体作为校正标准品[15]。阳性对照一般都是内

部开发的（例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体），不可能将受试者检测到

的所有抗药抗体作为阳性对照。如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平，那应

该证明标准品和试验样品的平行性，以确定样品的浓度的准确性[8,10]。若未证

明样品与标准品间的平行性，则准确性是可疑的。滴定法是另一种评估抗体水平

的方法，该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性。然而，值得注意的是已有研究

表明，滴定法适用于抗体水平的评估。几十年来，临床上感染、自身免疫疾病的

诊断和治疗以及预防接种等都采用这一方法[16~22]。滴定法比较抗药抗体反应

更为简便且所需的验证工作更少，因为其不需要再对不同产品的抗药抗体与

标准品间的平行性进行详细描述与证明。此外质量单位法每当标准品品改变时均

需要进行重新验证。综上所述，两种方法都无法提供准确的定量数据。因此，赞

助商建议采用相对浓度（质量单位）或滴度表示抗药抗体水平。某些监管机构会

更倾向于使用滴度单位。滴度是仍能产生阳性结果的最大稀释倍数的倒数。

在方法的开发和优化阶段，应先确定方法并进行记录，例如选择所需的试剂、

最佳浓度、预期样品所需的最大稀释倍数等。这些需要研究人员在预先研究阶段

进行简单或重复确证。本文假定以下属性在验证之前已被确证：免疫分析方案及

方法设计，分析基质的类型，最大稀释倍数（MRD）、试剂的最佳浓度、酶标板

的均匀性评估（如位置的影响、漂移等）。监管机构可能会要求提供相关的数据

支持。在方法的开发和优化阶段，通过对对照品的检测，对方法的变异性有一个

初步的认识。

2.2统计学的应用

降低验证过程中的主观作用是本文的重点之一。为了确保实验的客观性必须

依靠于统计手段。由于大多数研究者无法获得统计学家的服务，本文提供了简单

且足够严格和有效的统计学方法。所涉及的统计计算都可以采用商业统计软件进

行计算，计算过程不需要经验丰富的统计学家。然而，如果有统计学家协助进行

验证实验设计和数据处理的话，统计学的应用可能会比本文提供的更为严格和有

效。

3.预研究验证

临床和非临床研究中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研究验证，它

主要从数学和可定量方面描述分析方法的性能特征[8]。预验证(prevalidation)

是指研究工作启动前的筹备工作，两者不能混淆。另一方面，在研究验证是指监

控整个方法使用过程的性能特征，以确保方法的有效性和数据的可靠性。通过完

整的方法开发和优化后，分析方法应具备验证的条件，如优化试验数据表明检测

方法具有潜在的可靠性和适用于相应的检测要求。方法的可靠性依赖于分析设备

和计算机系统的正常运转以及试验人员的熟练程度。本质上，

分析方法是包含多个因素的整体系统而不仅仅是试剂而已。验证方法应包括

系统适用性，这属于在研究验证范畴。

建议开始预研究验证之前制定相应的验证实验方案或验证实验标准操作程

序（SOP），验证实验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的详细说明、待

验证的性能特征以及精密度、稳健性、稳定性和耐用性的预期验收标准。此外建

议在验证实验方案中加入适当的实验细节和数据处理步骤，这样可以为验证人员

提供一个明确的指导以确保更好的处理数据。

抗药抗体检测应建立相应的验收标准，有助于确保在研阶段的试验的有效性。

为此，应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的系统适用

性标准（可接受范围）。此外，在研验证阶段中间精密度试验，对照品和样品检

测也应有相应的验收标准。当在研验证阶段的分析数据不符合验收标准时，应拒

绝该数据。在预研验证阶段不应建立验收标准，因为这可能会使某些验证数据被

排除，导致不能准确估计分析误差。除了可明原因（如技术误差）、有意或无意

偏离实验方案所得分析数据应被剔除外，预研阶段的所有分析数据都应计算在内。

目前，美国食品药品监督管理局（FDA）、国际协调会议（ICH）和美国药典的指

导性文件阐述了定量检测的分析验证应研究的一般性能特点[23~25]。由于抗药

抗体免疫分析属于半定量检测，所以有些要求并不不适用。对于抗药抗体免疫分

析方法学验证，应对以下9项参数进行测定：

1.筛选临界点

2.确证临界点

3.灵敏度*

4.系统适用性控制（QCs）验收标准

5.耐药性*

6.精密度

7.鲁棒性

8.稳定性*

9.耐用性（有条件时）

如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录，在预研验证阶

段不需要对以上标有*的参数进行重复验证，尽管验证报告中应提供相关的数据。

如果最终的方法有所变动的话，预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段的预期用途和产品上市后的用途可能会不同。例

如，在开发早期只有一个分析人员进行试验，开发工作完成后和上市后可能会有

多个分析人员进行试验。整个产品生命周期的验证要求应随着检测方法应用的改

变而改变。然后，在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证。

传统分析方法的稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。当使用滴度标示抗药

抗体反应时，需要使用阳性对照，或者最好使用累积抗药抗体阳性样品，在合理

稀释范围内不出现异常非线性。通常，在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度

（MRD）的选择，验证阶段不需要进行重复测定。如果出现前带效应，建议选择

一个不受前带效应影响的MRD，或者采用多种稀释样品。稀释线性信息有助于设

计系统适应性质量控制。

3.1筛选临界点

筛选临界点定义为筛选试验的响应水平，响应值高于该临界点的样品为活性

样品（或者称为潜在阳性），响应值低于该临界点的样品为阴性样品。一个有效

的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性的统计分

析确定，所使用的样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者。

当免疫分析的方法存在错误风险时，筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴

性[8,10]。如果筛选试验中不能识别出活性样品，应怀疑该方法检测低阳性样品

的能力。约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性，从而保证可以检测出低阳性样

品[8]。在实践中，假阳性结果总比没有阳性结果好（如假阳性率可能不等于5%）。

3.1.1筛选临界点的类型

可以应用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种：固定临界点、浮动临界点、

动态临界点。

（a）固定临界点：

预研验证阶段确定固定临界点，然后应用于在研验证阶段。固定临界点用于

测试样品的分析，直到需要重新验证或改变（如测定方法发生关键变化、转移到

另一个实验室进行试验或仪器升级等）。固定临界值在一个目标人群的同一研究

中或多目标人群的各研究间是固定的。当预研究阶段的整个试验的均值相等、方

差齐性时，采用固定临界点。

（b）浮动临界点

浮动临界点有两种计算方法，分析过程中数据需要进行对数（Log）转换时，

通过预研阶段确定的特定归一化因子乘以在研阶段的生物背景计算而得；分析过

程无对数转换时，计算方法归一化因子加上生物背景，生物背景可以由阴性对照

（由样品的基质组成，抗药抗体反应为阴性）、分析稀释剂或预处理受试者样品

（个体特异性临界点）标示。浮动临界点可以是每一次试验每一块板（每一次试

验中的若干块板）所特有的或每一个受试者所特有的（使用受试者的预处理/基

线样本结果）。如果采用个体特异性临界点，需要在同一块板上检测预处理样品

和处理后样品（或至少在同一试验中检测）。由于浮动临界点的确定过程需要对

预研究验证的数据进行方差估计，所以不同试验间的结果应表现出方差齐性。采

用阴性对照进行归一化时，应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质

样品的结果，例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在整个试验中是相

关联的。如果均值相关，阴性对照均值适用于计算浮动临界点。如果均值不相关，

则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理。

（c）动态临界点、

同一试验的不同板之间、同一研究的不同试验间或不同研究间的动态临界点

均不同。动态临界点的确定不需要预研究阶段的方差估计。这一特征将动态临界

点和浮动临界点区别开来。只有当不同试验间的结果方差有显著性差异时，才使

用动态临界点。实际使用时，动态临界点的限制性因素是每次试验都需要大量的

样本数才能确定临界点。建议优先采用固定临界点或浮动临界点。如果试验间的

均值或方差存在差异，建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查。例如，

若果差异来源于分析员或设备，则采用分析员或设备的固定临界点或浮动临界点

代替动态临界点。因为动态临界点是一种不常见的非常规方法，建议谨慎制

定该临界点，最好能与监管机构进行充分沟通。

3.1.2评估临界点的样品

建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估。有时候需要在开始预研究

验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的，甚至是不可能的。因

此，一般从药物初治健康受试者的样本中进行评估，并确立一个起始临界点。该

方法适用于于临床I期的研究。当临床研究开展到临床II期以后，便可得到目

标疾病患者的样本，应该对不同的目标人群重新评估临界点。如果目标人群和正

常志愿者的响应值的平均值和方差相当，可以使用同一个临界点。如果没有可比

性，则需要采用目标疾病特异性的临界点。

为了确定临界点，在验证阶段应分析足够数量的样本，这样才能对生物和分

析变异进行有效的统计学评估。通常在临床研究中，需要分析超过50个独立受

试者的样本。非临床研究至少需要15个样品。不应使用混合基质样品进行临界

点评估，因为从混合样品中测试重复的样品，检测的只是分析变异而不是生物变

异。建议采用平衡实验设计有效评估潜在的变异性来源（seeAppendixA）。如

果将有多个分析员在研究过程进行分析样品操作，那么在预研究验证阶段应至少

包括两位分析员。如果研究过程中只有一个分析员进行样品分析，而这个分析员

与验证阶段的分析员不同，预研究验证阶段也应至少包括两位分析员。是否需要

对同一样品进行重复试验取决于在研验证的报告形式（例如在微量滴定板中进行

两个复孔或三个复孔）。

3.1.3排除异常值

应确认药物初治患者的偶然活性样本，以确保药物的特异性。在这一点上，

确证临界点将不能真正的确认阳性，此时应该使用科学的判断方法，应排除无法

确定是否为偶然活性样本。在分析临界点的统计学评估时应去除抗药抗体阳性样

品和统计学异常样品（样品响应值过高或过低）。因为下部极端异常值通常会使

差异性波动从而影响临界点，所以应当排除。去除较高或较低异常值会得到一个

较低的临界点，通常会增加假阳性率而变得更为谨慎（假阳性样本会在随后的特

异性确证试验中被证明为阴性）。如果在临界点评估中使用了强大的统计方

法（例如基于中位数的方法，图基的Tukey’sbiweight函数），则不需要排除

异常点。

3.1.4确定筛选临界点

为了确定筛选临界点的类型，需要进行一系列的数据评估，如图1所示。首

先，如果使用参数估计的方法，需要对药物初治的样本结果的分布类型进行检验

（正态分布检验），如果数据不符合正态分布，则可以对数据进行适当的转换（如

对数转换），然后排除异常值（AppendixB.1）。如果不需要用到参数估计（第

95百分位），则不需要进行数据转换，但仍需要排除异常值。其次，采用单因

素方差分析（ANOVA-basedstatisticalmethods）的统计学方法处理比较每一

次试验运行的平均值和方差，从而决定采用固定临界点、浮动临界点还是动态临

界点（AppendixB.2）。在浮动临界点的评价过程中，如果归一化过程使用了阴

性对照，则应该将阴性对照的均值与目标人群的基质样本进行比较，以确定是否

适合使用阴性对照。最后，基于以上评估，使用适当的统计学方法计算出临界点

（AppendixB.3）。

3.2确证临界点

特异性是分析方法在其它基质成分存在的条件下明确检测目标分析物的能

力[23]。筛选试验筛选出活性样品（通常称为潜在阳性），因为筛选临界点允许

5%的假阳性率，所以这些活性样品可能是非特异性的。因此从活性样品中鉴定出

阳性样品需要药物的特异性活性。检测人源样本的抗药抗体特异性是一种常见的

做法，动物样本也一样。特异性确证试验通常是一个竞争性抑制试验，通过检测

含或不含预孵育研究药物的样品的信号变化来进行评估。此外还可通过比较相同

大小和电荷的免疫无关的蛋白质进行评估。还有一些研究者通过比较加药和不加

药的信号区别进行评估，然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法的可接受性。

以上的任何一种方法，确证阳性信号的变化值称为确证临界点。确证临界点将抗

体与药物的特异性结合和非特异性结合区别开来，其有效性非常关键，必须客观

评估。不鼓励使用50%信号抑制等主观标准。信号略高于临界点的低信号的抗药

抗体弱阳性样品的评价尤为重要。抗药抗体强阳性药品需要用过量的药物进行竞

争性抑制，所以一般不会出现这一问题。当评价抗药抗体弱阳性样品时，即

使是加标药物样品的信号很细微的减弱都可能会使相对应的未加标药物样品的

信号降低50%以上，从而导致假阳性。此外，只有将抗药抗体阳性样品的信号下

降到背景信号，这信号强度只有未抑制样品信号的50%以下，这样可能会出现假

阴性。因此，特异性确证临界点应该通过客观的方法进行评估，在弱阳性样本附

近评估分析方法的变异性。有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估。

建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点。筛选临界点评估试验

所用到的药物初治样本可以加入药物后再以相同的方式检验。计算未加标药物样

本（抑制）的均值和标准偏差（SD），特异性确证临界点为抑制平均值加上3.09

倍的SD值（如果预期假阳性率为1%）。与筛选临界点的评估一样，特异性确证

临界点的评估过程也需要排除异常值。特异性确证临界点的详细计算步骤参见附

录C（AppendixC）。

在某些实验室，会在低于筛选临界点的样品（建议样本量大于等于25）中

加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点。用过量药物孵育后，计算

平均抑制百分率，并通过“×SD”值进行校正，确定特异性确证临界点（“×”

取决于适当的假阳性率）。必须确保阳性对照样品的信号不会高于筛选临界点太

多，以免使假阳性率增高。这一方法确定的特异性确证临界点高度依赖于所使用

的阳性对照品。值得注意的是，研究样本中的低抗药抗体亲和力样本（特别是多

价IgM，亲和力成熟的IgG）可能会不被抑制。因此，使用单一阳性对照品确定

的特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还是非特

异性样品。

Neyer等提出了一种基于T检验（t-test）的表示抗药抗体特异性的方法，

该方法的原理是比较未加标药物样品与加标药物样品的信号值。然而，该分析法

的竞争性抑制结果的观测样本量相当有限，没有考虑到生物变异的影响。

然而，以上列举的方法均比人为的50%抑制率更为客观、可靠。一些研究人

员进行抗体免疫耗竭（如ProteinA），这一方法并不涉及特异性药物，它只能

证明信号来源于免疫球蛋白。这种方法可以用作支撑测试，不建议作为药物特异

性的决定性试验。

3.3灵敏度

完全定量方法一般采用适当的参考标准曲线来估计分析方法灵敏度，而抗药

抗体分析的灵敏度高度依赖于所用的阳性对照试剂。例如，在同一个分析试验中，

使用高亲和力阳性对照品得到的灵敏度优于低亲和力阳性对照品。因此当有一种

以上的阳性对照品时，通常会发现不同的阳性对照品会得到不一样的灵敏度。此

外，没有一种阳性对照品能表示出不同化合物处理后的免疫应答图谱。尽管如此，

分析灵敏度提供了分析方法的一般相关性，需要进行测定并报告。灵敏度有助于

在分析方法开发阶段选择最优的抗药抗体检测方法（方法开发起始阶段比较不同

方法），也有助于确定低阳性对照品的验证。

抗药抗体分析的灵敏度指阳性对照抗体能稳定产生阳性信号的最低浓度。例

如，预期试验的结果的95%高于筛选临界点的对照抗体的浓度，具体的比例取决

于一致性水平。确定分析灵敏度的试验方法参见附录D（Appendix）。

3.4系统适用性控制

系统适用性控制确保了分析方法的有效性[24]。分析方法通常都包含一系列

的质量控制（强、弱阳性对照和阴性对照），这些质量控制确保了性能的一致性，

从而确保了结果的有效性。换言之，系统适应性控制有助于确保了分析方法在整

个研究阶段都是有效的。因此，系统适用性控制帮助确认试验运行是否通过验证

的验收标准。关于系统适用性控制开发和相关的验收标准的详细信息参见附录E

（AppendixE）。

3.5选择性/干扰性（耐药性）

考虑到样品中的其它组分可能会影响抗药抗体的检测。选择性就是指分析方

法在其它组分存在的情况下检测目的物质的能力[27]，通过从含有潜在干扰组分

（多个）的样品中检测分析物（模拟阳性对照品）的回收率来进行表征。当阳性

对照和样品基质来源于不同物种时，anti-framework抗体和抗异种抗体常常会

阻碍阳性对照品的回收。注意当使用阳性对照时，抗药抗体分析的选择性不太可

能会影响测定临床或非临床样品的选择性。尽管如此，还是很有必要去了解抗药

抗体检测的试验条件，基质中可能含有研究药物、内源性抗体、合并用药和类风

湿因子等。

3.5.1基质成分的干扰

抗药抗体分析的回收率评估包括在试验条件下检测基质成分是否会抑制抗

药抗体与药物的结合。如果可能的话，选择性研究应包括阳性对照与疾病状态下

的血清的对照试验，因为某些人群或疾病状态下可能会产生干扰性物质。如果有

显著比例的测试样本出现溶血或高血脂，则需要进行回收率评价。为了确定目标

基质样品的回收率，应将高、低浓度的特异性抗药抗体对照品（单克隆或多克隆）

加入分析缓冲液（不含基质成分）、健康个体的生物基质（血清或血浆）、治疗

人群样本。比较缓冲液的响应值与生物基质的响应值，可接受标准通常为两者的

差异超过20%，具体差异取决于所用的阳性对照。在试验中选择表达高、低非特

异性背景的捐助者是很有帮助的。不仅能够检测回收率，还能检查基质的干扰性，

确证最小稀释浓度（MRD）。

3.5.2药物干扰研究（耐药性）

抗药抗体检测的主要干扰物质通常来自药物本身。由于目标药物和试验过程

用到的捕获试剂的特异性抗体的产生存在竞争性作用，含药样品可能存在干扰物

质，导致出现假阴性。通常的做法是确定抑制阳性对照抗体检测的药物浓度，并

将此耐药限度应用于研究样本抗药抗体状态的决策方面。这一做法存在一定的缺

陷，因为耐药性高度依赖于所使用的阳性对照，在同一个试验中，使用高亲和力

阳性对照可以获得较低的耐药性，而低亲和力对照获得的耐药性更高。因为抗药

抗体存在个体差异性，所以研究样本的抗体获得的真正的耐药性可能会与阳性对

照的耐药性不同。事实上，当有一个以上阳性对照时，通常会发现每一个阳性对

照会对应一个不同的耐药性值。因此，真正的耐药性是无法确定的。与灵敏度类

似，耐药性仅限于了解试验中药物是否会产生干扰，在方法的开发和优化阶段可

以用于比较不同方法。尽管如此，确定耐药性是监管期望。

为了测定药物的耐药性，先用系列稀释的药物对低浓度ADAQC进行预孵育，

然后再进行检测。抑制低浓度QC信号检测的最低药物浓度就是试验的药物耐受

限，该耐受限会随着阳性对照的不同而改变。研究阶段的生物分析报告中，

当在抗药抗体阴性的样本中检测药物时，建议附上该抗药抗体阴性样本可能

伴随的药物干扰声明。

3.6精密度

精密度是指分析方法一系列随机测量值的变异程度，精密度的可接受标准应

该在免疫分析的常用预期范围内；同时也应该适合所用的平台（例如，电化学发

光法的标准要严于Elisa法）。建议采用平衡实验设计进行精密度性能验证，如

附录A（AppendixA）所示。筛选试验、特异性确证试验和滴定方法的精密度确

定方法如下。如果可行，建议在研究阶段将精密度试验适当放大至预期实际使用

规模。

3.6.1筛选试验精密度

对试验对照品（阴性对照、高、低浓度阳性对照）进行至少6次独立检测，

分析相应数据确定筛选试验精密度。以上数据可以通过附录D（AppendixD）所

述的灵敏度确定试验获得。从以上试验中计算出高浓度阳性样品和低浓度阳性样

品（刚好高于临界点）的不精确性，不精确性可以用变异系数（CV%）表示，变

异系数表征了先关变异的来源。批内分析精密度（也称批内精密度或内部运行精

密度）和中间精密度（也称运行间精密度、批间精密度、中间精密度或整体精密

度）都应该用变异系数CV%表示，例如最近出版物的表示方式[27]。如果分析研

究样本是使用了分析员特异性临界点，则应该测定分析员中间精密度

（inter-analystCV）。

3.6.2特异性确证试验精密度

特异性确证试验精密度的目的是检测信号抑制的重复性。为了计算百分抑制

率（%），特异性确证临界点的确定试验中，在至少6次独立运行中，往高、低

浓度对照组中加入适量的药物。以上试验已经有足够的数据计算批间精密度，计

算方式如3.6.1.

3.7稳健性

鲁棒性能够指示分析方法的可靠性。鲁棒性是指当方法的参数发生故意的微

小变化时，分析方法不受影响的能力[23]。鲁棒性关注的是在标准试验室发生真

实生活的变化时分析方法的一致性。验证过程中鲁棒性参数测定需要基于具

体的分析方及其相关风险[28]。应该评估特定实验室哪些试验条件可能发生变化，

并设计适当的测试，以检查被认为关键的参数。包括微孔板批次、孵育时间、温

度、每一次运行的微孔板数、试剂批次和浓度或者设备。研究样本或阳性对照样

本都可用于检测鲁棒性。建议在鲁棒性验证过程中使用系统适用性控制的验收标

准（在方法开发和优化阶段计算或验证系统适用性验收标准）

3.8稳定性

稳定性研究评估分析方法在预期样品的储存条件下的分析性能。理想状态下，

稳定性测试条件应模仿预期样品和试剂的装卸条件、储存温度和不同的储存时间。

考虑到分析物的稳定性，抗药抗体的本质属性值得深思。不管抗药抗体分析物是

抗X药物抗体还是抗Y药物抗体，他们都是多克隆抗体。因此，有理由认为抗药

抗体的稳定性都是一样的。按照这一逻辑，抗药抗体的稳定性接近血清或血浆中

任意抗原的免疫球蛋白的稳定性。建议对每一物种的的基质样本分开进行稳定性

表征，无论是临床的还是非临床的，然后在研究实验室内将试验结果推广至所有

的药物检测项目，有必要检测来自目标适应症（如类风湿性关节炎）的基质。因

此，并未规定分析不同药物时样品稳定性都要分开进行验证。需要注意一个事实，

当不同受试者注射不同的药物时，产生的IgM，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的比

例各不相同，不可以知道并模拟不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用该法评

价分析物质的稳定性是合理的。

加了阳性对照的药物初治基质可以用作模拟阳性样本进行稳定性测定，但是

这样的样本是否能合理的模拟预期测试样品需要科学的判断。最好是能有多个不

同浓度的阳性样品，至少也要包含一个强阳性对照和一个弱阳性对照。更详细的

信息参见附录F（AppendixF）。

稳定性表征还应包括关键试剂的稳定性，如质量控制样品、涂层试验板或芯

片（如果有使用）以及其它关键试剂（如偶联物）。然而，这是一个商业决策而

不是规定的验证项目，因为抗药抗体分析是一个稳定性指标试验方法（如，关键

试剂的稳定性缺失就会导致分析性能不佳或分析失败，可以由系统适用性控制

进行监控）。

3.9重现性

重现性是指在一个以上实验室进行试验时，分析方法的可靠性。因此它需要

证明分析方法在不同实验室间是有效的。在FDA和ICH的方法学验证指导原则中

并没有重现性这一术语[13,23,24]。美国药典将其描述为实验室间精密度和分析

员间精密度。分析员间精密度在ICH的文件中描述为中间精密度[23,24]。ICH

将实验室间精密度描述为再现性(reproducibility)。重现性经常被错误的解释

为“常规的变化”（routinechanges），如设备间的不精确性，实际上属于稳

健性的范畴。

因为有些公司可能含有多个生物分析实验室，或者由于外包的不断增长，建

议在这种情况下验证重现性。重现性成为评价分析方法的“转让性能”的好方法，

如在两个或两个以上的实验室测试样本的邮箱，并比较不同实验室的数据。例如，

分析灵敏度使用了单一的阳性对照，应对临界值和控制范围进行评估；可以在主

办方的试验室中产生盲样然后由接收实验室进行检测。当只有一个实验室进行抗

药抗体分析时，直到该方法要转移到另一个实验室时才需要进行重现性验证。

4.在研究验证（监控）和重新验证

在研究验证（系统适用性监控或保持）和重新验证是生物分析方法的关键组

成部分。因此，分析方法的验证工作直到该方法停止使用时才结束。

对于定量生物分析方法的在研究验证，通常需要精密度和准确性的验收标准

[13]。因为抗药抗体分析方法中并未涉及准确性，所以按照3.4部分描述的

办法监测质量控制样品的性能。再度确保该监测系统是适用预定用途的，如分析

方法仍是有效的，其性能仍像预先研究验证阶段一样。弱阳性对照的使用确保了

分析方法的灵敏度。关于样品和微孔板的验收标准参见附录E2(AppendixE2)。

建议根据测定法减少“漂移”的需要，对分析方法进行重新验证。例如，当分析

方法的关键部分、设备或者样品（疾病适应症）发生改变时，需要进行重新验证。

重新验证应包括部分或全部验证特性（如部分或全部重新验证）。分析关键试剂

的批号与预先研究验证阶段的批号不同时不需要进行重新验证，但必须通过适当

的实验资质进行支持，以保持系统适应性。

5、结语

关于免疫原性评估系列论文共有三篇，第一篇介绍了生物制药产品抗体免疫

分析方法的开发和优化[8]，第二篇介绍了抗药抗体的评估策略[10]，本文介绍

了抗药抗体免疫分析验证的重要性能特点，并提供了测定各性能的建议。旨在促

进整个生物制药行业形成治疗性蛋白质免疫原性评估的标准化方法。这三篇论文

里的建议都应被视为最佳实践范例。只要保持科学原理和客观性，也可以接受替

代方法。

期望在此推荐的方法可以产生高质量的抗药抗体数据，从而更好的了解免疫

原性在临床上的影响。同时也希望论文的发表会促进全世界的监管机构颁布具体

的指导文件。