考马斯亮蓝法测蛋白质含量
培训计划方案-野扁豆
2023年2月19日发(作者：黄冈恢复公共交通)蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染
料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸
收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此
可用于蛋白质的定量测定。
（蓝色）变为氨基酸
芳香族
碱性
染料考马斯亮蓝磷酸nmG595250
max
该方法灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生
的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变
的变化很大。
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋
白质测定时有较大的偏差。
【实验准备】
一、试剂
（1）考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml
85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
（2）生理盐水：0.9%NaCl溶液。
（3）标准蛋白质溶液：牛血清蛋白（BSA），用0.9%NaCl稀释成0.1mg/ml蛋白标准
溶液。
二、器材：
试管和试管架、紫外分光光度计、移液枪、漩涡振荡器
【实验步骤】
一、制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂
编号0123456
标准蛋白质溶液/ml00.10.20.40.60.81.0
生理盐水/ml10.90.80.60.40.20
考马斯亮蓝试剂/ml5555555
各管加入试剂立即置于漩涡振荡器上混匀后，静置5min，以0号管为空白管调零，在
595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A
595
值），如下表所示。
编号蛋白浓度（ug/mL）吸光度（A
595
）
1100.152
2200.199
3400.332
4600.457
5800.571
61000.667
以吸光度（A595值）为纵坐标，标准蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，进行直线拟合，
得到标准曲线，如y=0.0059X+0.093，R2=0.9975（注：一般相关系数应在0.995以上，至少
2个9以上）。
考马斯亮蓝标曲
y=0.0059x+0.093
R2=0.9975
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
120
浓度（μg/mL）
A
5
9
5
A595
线性(A595)
线性(A595)
二、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照标准曲线操
作，测出样品的A
595nm
，然后利用标准曲线对应回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A
595nm
值在0.2-0.8之间，所以上述样品如果A
595nm
值太大，
可以稀释后再测A
595nm
值，然后再计算。
【注意事项】：
1、玻璃仪器要洗净且干燥，确保无蛋白质、SDS、Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA
及微量的去污剂如TritonX-100等污染或干扰实验结果。
2、测定完后用乙醇将玻璃比色皿清洗干净。
3、所测样品的A
595nm
值应在0.2-0.8之间，否则需要稀释后检测。
4、必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
5、每次配制考马斯亮蓝染色液后都需要制作标准曲线。