cat酶

cat酶

-

2023年2月27日发(作者：人力资源管理师报考条件)

一、抗氧化酶活性测定（APX、GPX、SOD、CAT、Pro）参考《在同一提取系统

中同时测定5种抗氧化酶活性》

1、注意事项：在本提取系统中同时测定抗坏血酸专一性过氧化物酶（APX）、愈

创木酚过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、可

溶性蛋白共5个指标；所有操作过程必须在冰浴中完成，降低保护酶活性的

损失；称量药品时可稍稍过量。

2、提取液及反应准备液配置：以下溶液1-7d内可用，4℃保存。

1mol/LHCl（100ml）：8.333ml浓HCl定容至100ml。

750mM（750mmol/L）H

2

O

2

（100ml）：7.570mL30%H

2

O

2

定容至100ml。

500mMH

2

O

2

（100ml）：5.0464mL30%H

2

O

2

定容至100ml。

10mMH

2

O

2

（100ml）：2mL500mMH

2

O

2

定容至100ml。

（1）配置500ml提取液所需试剂药品如下：

药品用量

Tris3.0285g

HCl(1mol/L)22.5ml

甘油100ml

EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612g

AsA（抗坏血酸）0.08806g

DTT（二硫苏糖醇）0.07713g

GSH（谷胱甘肽）0.15366g

MgCl

2

0.50825g

蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，

然后定容至500ml。

（2）500mlA液配置所需试剂药品如下：

药品用量

Tris3.0285g

HCl(1mol/L)22.5ml

EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612g

蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.8，

然后定容至500ml。

（3）500mlB液配置所需试剂药品如下：

蒸馏水溶解后（终体积为450ml左右），0.1mM的HCl和NaOH调节pH至7.0，

然后定容至500ml。

3、GPX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。

反应液：111ul愈创木酚用5ml乙醇溶解后加入1ml500mMH

2

O

2

，用B液定

容至100ml。

4、APX反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。

反应液：1ml10mMH

2

O

2

用B液定容至100ml；

30mMAsA：0.52836gAsA用B液定容至100ml。

5、SOD反应液配置（100ml）：现用现配，24h内有效。

反应液：0.0082gNBT和0.1995g蛋氨酸（甲硫氨酸）用A液定容至100ml。

0.1mM核黄素溶液：0.00376gVB2用A液定容至100ml。

6、CAT反应液配置（100ml）：

直接使用B液即可。

7、可溶性蛋白反应液：

G-250考马斯亮蓝：100mg考马斯亮蓝溶于50ml90%（V/V）乙醇，加入85%

（质量浓度）H

3

PO

4

100ml，再用蒸馏水定容至1000ml，常温下保存1个月。

8、样品提取

用长镊子取小麦整株地上部位迅速固定成长2-3cm的棒状并放入液氮中，直

至取样过程结束后带回实验室-80℃下贮藏。

提取时，从液氮中取出样品，待液氮挥发干净后迅速称量然后放入预冷的研

钵中磨碎后加入5ml提取液进一步充分研磨至匀浆，转移至10ml具塞刻度试管

药品用量

Tris3.0285g

HCl(1mol/L)22.5ml

EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.18612g

中，并分2次冲洗，3000r/min离心15min后上清液定容至10ml，取2ml离心管

（每个重复2个）加入2ml上清液后12000r/min、4℃离心20min，4℃保存（2

天内有效）。

取上清液作为酶提取液。

9、酶活性测定：加入启动液摇匀后应立即放入分光光度计中进行测量。

(1)GPX酶活性：

2.95ml25℃预热后的反应液+50ul（自己摸索）酶液启动反应，测定OD

470

；

每隔30s读数一次，共测量180s，计算增加值。每个样品重复2次。

(2)CAT酶活性：

2.9ml25℃预热后的反应液（B液）+50ul酶液（自己摸索）+50ul750mMH

2

O

2

启动反应，测定OD

240

，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算

减少值。每个样品重复2次。

(3)APX酶活性：

2.9ml25℃预热后的反应液+50ul酶液（自己摸索）+50ulAsA(30mM)启动反

应，测定OD

290

，用石英比色皿，每隔30s读数一次，共测量180s，计算减小值。

每个样品重复2次。

(4)SOD酶活性：

1个暗中对照：2.9ml反应液+100ul核黄素；

2个光下对照：2.9ml反应液+100ul核黄素；

反应液2.85ml+50ul酶液（酶液量需要自己探索）+100ul核黄素，光下放置

10~30min（时间如何确定：加入酶液的试管颜色深度是光下对照的一半左右为止；

时间必须记录下来，结果中需要用到反应时间），光照强度12000lx，以暗中对

照调零，OD560。每个样品重复3次。

(5)Pro(可溶性蛋白)含量测定：反应液2.95ml+50ul酶液，25℃反应5min，测

定OD595，每个样品重复3次。

10、结果计算

(1)SOD酶活性计算，以抑制光化还原50%所需酶量为1个酶活单位(U)，公式如

下：

SOD酶活性=[V

T

×(OD

ck

-OD

E

)]/[0.5×OD

ck

×V

t

×W]

V

T

、V

t

分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；OD

ck

、OD

E

代表光下对照的分光光度计值和样品管的分光光度计值。

(2)APX、GPX、SOD、CAT酶活性计算，以每分钟降低0.1OD值为一个酶活性单位

（U），公式如下：

酶活性：=(V

T

×ΔOD

E

)/(V

t

×t×W×0.1)

V

T

、V

t

分别为提取液的总体积、测定时酶液用量；W为样品质量；ΔOD

E

为测

定时OD值的改变量，t为OD值变化所花费的时间。

二、GSH（谷光甘肽）、AsA（抗坏血酸）、MDA（丙二醛）含量测定

1.提取液、反应液及缓冲液配制：

500ml5%的三氯乙酸（TCA）：25g三氯乙酸用蒸馏水定容至500ml；

200ml10%的三氯乙酸：20g三氯乙酸用蒸馏水定容至200ml；

200ml44%的H

3

PO

4

：103.5ml浓磷酸（85%）用蒸馏水定容至200ml；

500ml150mMNa

2

HPO

4

(pH=7.7)：26.8605gNa

2

HPO

4

加入400ml蒸馏水溶解后

调节pH，再用蒸馏水定容至500ml；

200ml150mMNaH

2

PO

4

(pH=7.4)：4.6805gNaH

2

PO

4

加入180ml蒸馏水溶解后调

节pH，再用蒸馏水定容至200ml；

100ml100mM磷酸缓冲液（PBS,pH=6.8）：1.7907gNa

2

HPO

4

+0.6805gKH

2

PO

4

用90ml蒸馏水溶解后调节pH，再定容至100ml；

100ml3%的FeCl

3

：3gFeCl

3

用蒸馏水溶解后定容至100ml。

10ml4%的2,2-二联吡啶：0.4g2,2-二联吡啶加5ml乙醇溶解后用蒸馏水定

容至10ml；

100ml0.6%的硫代巴比妥酸：用5%的TCA加热溶解并用其定容至100ml。

注：以上试剂常温下可放置一周。

TDNB试剂：25.1mgTDNB用pH6.8的磷酸缓冲液定容至10ml（用具塞刻度试

管即可），现用现配，4℃保存。

2.实验步骤：

(1)提取：取样后迅速用液氮冰冻，用5ml5%TCA+少许石英砂充分研磨后，再

用5ml5%TCA冲洗入10ml离心管中，3000r/min离心15min，上清液定容至

10ml，再吸取定容后的样液各1.5ml放入离心管中用于GSH和AsA含量的测

定，剩下的样液用于MDA含量的测定。

(2)MDA含量测定：

取4ml样品提取液+4ml0.6%硫代巴比妥酸，沸水浴10min后离心取上清液

定容至8ml，测量其在450nm、532nm、620nm下的OD值，每个样品测量三次。

(3)GSH含量测定：

300ul5%TCA+300ul样液+2.4mlH

2

O+2.8mlpH7.7Na

2

HPO

4

+0.2mlTDNB，30℃

保温5min，每个样品重复三次，测定OD

412

，调零管中的TDNB用0.2mlpH6.8的

磷酸缓冲液代替参与上述过程。

(4)AsA含量测定：

500ulH

2

O+300ul样液+400ulpH7.4NaH

2

PO

4

,37℃保温30s后再分别加入

800ul10%TCA、44%H

3

PO

4

和4%二联吡啶，40ul3%FeCl

3

，然后37℃反应60min，

测定OD

525

,三次重复，调零管加入300ul5%TCA代替样品提取液参与上述过程。

3.结果计算：

MDA（umol∙gFW-1）=8×[6.45×(OD

532

—OD

600

)-0.56×OD

450

]×2.5/(1000×W)

通过标准曲线查出对应OD值的GSH和AsA含量，按照下式计算GSH和AsA含量。

GSH(mg∙gFW-1)=C×V

T

/(V

t

×W)

AsA(ug∙gFW-1)=C×V

T

/(V

t

×W)

V

T

、V

t

分别代表提取液的总体积和参与反应中样液的体积；W为样品质量。

三、可溶性总糖、可溶性还原糖含量测定

1.试剂配制：

500ml硫酸-蒽酮溶液：1g蒽酮+5g硫脲用体积比为76：24（硫酸：水）的

浓硫酸溶解，4℃保存可用半个月；

200ml2mol/LNaOH：16gNaOH溶解后定容至200ml，用塑料瓶盛放；

3,5-二硝基水杨酸：1g3,5-二硝基水杨酸溶于20ml2mol/LNaOH(加热溶解)

加入40ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500ml，转

移至试剂瓶中，盖好瓶塞，防止CO

2

进入；

2.实验步骤：

(1)提取：从液氮中取出称重后，用3ml蒸馏水研磨至10ml玻璃试管中，再用

4ml冲洗两次，煮沸20min，转移至离心管中（用3ml蒸馏水冲洗两次），调

平后3000r/min离心15min，上清液定容至25ml；

(2)还原糖含量测定：

2ml3,5-二硝基水杨酸+2ml提取液+4ml蒸馏水，沸水浴5min，调零管用水

代替提取液，测定OD

540

。

(3)总糖含量测定：

2.9ml硫酸-蒽酮溶液+100ul提取液，沸水浴10min，对照加水调零，测定

OD

620

。

3.结果计算：

糖含量=C×V

T

/(V

t

×W)

C是根据标准曲线对应OD值查出的糖含量，V

T

、V

t

分别是提取液总体积和参

与反应的提取液体积，W是样品质量。

四、脯氨酸含量测定

1.试剂配制：

500ml2mol/L的磷酸：67.57ml85%H

3

PO

4

蒸馏水定容至500ml;

100ml酸性茚三酮试剂：2.5g茚三酮+60ml冰乙酸+40ml2mol/L的磷酸，70℃加

热溶解；

100ml3%磺基水杨酸：3g5-磺基水杨酸用蒸馏水溶解后定容至100ml；

2.实验步骤：

(1)提取：取样称量后用3ml3%磺基水杨酸研磨，4ml冲洗再次至玻璃试管中，

沸水浴15min(加盖)，转移至10ml离心管中，1ml冲洗一次，3000r/min离

心15min，上清液定容至10ml；

(2)2ml提取液+2ml冰乙酸+2ml茚三酮，加盖后沸水浴30min；加4ml甲苯摇匀

萃取后离心15min，取甲苯层，以甲苯调零，测定OD

520

，每个样品重复三次。

3.结果计算：

糖含量=C×V

T

/(V

t

×W)

C是根据标准曲线对应OD值查出的糖含量，VT、Vt分别是提取液总体积和

参与反应的提取液体积，W是样品质量。