菌液pcr

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关爱明天网-马致远秋思

2023年2月15日发(作者：星系核)

荧光定量PCR技术检测红壤稻田土壤厌氧氨氧化细菌

宋亚娜;林智敏;陈在杰;刘晓强

【摘要】利用厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因特异引物对红壤稻田土壤总DNA

进行扩增、PCR产物纯化、克隆和测序,得到属浮霉菌(Planctomycetes)的厌氧氨

氧化细菌的部分16SrDNA序列(长度为502bp).以含该序列的重组质粒作为荧光

定量PCR的标准品,对水稻不同生育期红壤稻田土壤中的厌氧氨氧化细菌数量进行

检测.结果表明水稻各生育期内稻田表层和根层土壤中均存在一定数量的厌氧氨氧

化细菌,且其数量随水稻生长有所变化.表土中的数量随水稻生长呈逐渐增加的趋势,

根层土的数量在水稻生长前期变化不大,孕穗期后明显增加.红壤稻田土壤中存在的

厌氧氨氧化细菌对稻田土壤的硝化作用可能具有一定贡献.

【期刊名称】《福建农业学报》

【年(卷),期】2010(025)001

【总页数】4页(P82-85)

【关键词】红壤稻田;厌氧氨氧化细菌;荧光定量PCR

【作者】宋亚娜;林智敏;陈在杰;刘晓强

【作者单位】福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福州,350003;福建省农业科

学院生物技术研究所,福建,福州,350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福

州,350003;福建省农业科学院生物技术研究所,福建,福州,350003

【正文语种】中文

【中图分类】S154.3

厌氧氨氧化作用(ANAMMOX-Anaerobicammoniumoxidation)是指在厌氧条

件下,微生物以NO-2为电子受体,NH+4为电子供体,将NH+4、NO-2转变为氮

气的生化过程[1-2]。在这一过程中起作用的厌氧氨氧化细菌对氧极度敏感、生长

非常缓慢,并且在较高细菌浓度条件下才表现出厌氧氨氧化活性,因此用传统的微生

物分离、纯化培养方法研究厌氧氨氧化菌非常困难。目前,分子生物学方法已成为

研究环境中厌氧氨氧化菌的高效快捷的手段。Strous等最先测定了一种厌氧氨氧

化细菌的16SrDNA序列,并确定了其在细菌系统进化树中的位置属于浮霉细菌

(Planctomycetes),命名为CandidatusBrocadiaanammoxidans[3]。

厌氧氨氧化过程已经在海洋沉积物、海冰和淡水湖等很多生态环境中发现[4-7]。

水稻生长过程中稻田土壤长期处于淹水状态,可为厌氧氨氧化细菌生长提供有利环

境。因此,稻田土壤中也可能存在厌氧氨氧化过程。本研究以福建省红壤稻田土壤

为供试材料,运用荧光定量PCR技术检测水稻生长期内稻田土壤中的厌氧氨氧化细

菌及其数量,为进一步深入研究红壤稻田厌氧氨氧化过程奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

选择位于福州市闽侯县南屿镇的早稻田为采样

地。供试地点属暖湿的亚热带季风气候,无霜期长达326d,年平均气温为19.6℃、

平均湿度77%、年均降水量1342.5mm。供试土壤基本理化性状为:有机质含量

31.5g◦kg-1、pH6.10、全氮1.96g◦kg-1、全磷0.61g◦kg-1、全钾17.27

g◦kg-1、碱解氮183.9mg◦kg-1、有效磷11.8mg◦kg-1、速效钾123.6mg◦kg-

1。分别于早稻汕优016(LXianyou016)的分蘖期、孕穗期和成熟期

采集0～5cm的表土和10～20cm的根层土壤。早稻栽培的水肥等田间管理均按

当地常规进行。在约500m2的田块中采用5点法采集土样,将5点采集的土壤去

除根系、杂草、土壤动物和石块等杂质后混匀,然后分成3份重复。土壤装入50

mL塑料离心管中-20℃冷冻保存用于土壤微生物荧光定量PCR的分析。

1.2方法

1.2.1土壤微生物总DNA提取采用FastDNASPINKitForSoil(Q◦BIOgene)的

试剂盒方法,称取0.5g的土壤样品,按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总DNA

的提取,DNA样品-20℃冰箱保存待用。

1.2.2样品PCR扩增选用厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因特异引物Pla46:5′-

GGATTAGGCATGCAAGTC-3′和Anammox2:5′-TCTGTATTACCGCGGCT-3′[8],

对不同取样时期的稻田表土和根层土DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为25μ

L,其中2μLDNA模板加反应液23μL,反应液包括0.5μLTaqDNA聚合酶(2.5

U◦μL-1,天根生物公司,北京),2.5μLdNTPs(2mmol◦L-1各碱基,上海生物工程

公司,上海),2.5μL10×PCR-buffer(10倍的PCR缓冲液)(天根生物公司,北京),前、

后引物各2μL(5pmoL◦μL-1,上海生物工程公司,上海)和13.5μL超纯水。反应

程序为95℃予变性5min,94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个

循环,最后72℃延伸10min。用1.5%的琼脂糖电泳溴化乙腚染色检测PCR产物。

1.2.3PCR产物克隆将各生育期表土和根层土的PCR扩增产物混合后,使用

ractionKit(OMEGA,美国,USA)胶回收试剂盒纯化。再按试剂盒方

法用pMD18-T载体连接PCR纯化产物,以大肠杆菌DH5α制备的感受态细胞转

化连接产物,在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑试验筛选阳性克隆。取部分阳性转化

菌液送上海英骏生物工程有限公司进行测序,测序结果在GenBank上进行Blast同

源性比对分析。

1.2.4荧光定量PCR检测标准曲线制备利用dMiniKit(OMEGA,

美国,USA)试剂盒提取上述阳性克隆重组质粒DNA,然后用Nanodrop(美国,UAS)

测定重组质粒DNA的质量浓度。根据已知重组质粒全序列和阿伏伽德罗常数

(6.02×1023分子数◦mol-1)计算拷贝数为7.86×1010cells◦μL-1。以10倍梯度

稀释重组质粒:7.86×109～7.86×102cells◦μL-1做为标准曲线进行荧光定量PCR

检测。

1.2.5样品的荧光定量PCR检测对以上述重组质粒DNA构建的标准曲线样品和

各生育期表土和根层土DNA样品进行绝对荧光定量PCR检测。每个样品进行3

次重复。采用了SYBR○RPremixExTaqTM(宝生物工程公司,TakaRa,大连)试剂盒

于ABIPRISM7500Real-TimePCRSystem扩增仪上进行绝对定量PCR分析。

荧光定量PCR反应体系25μL,其中稀释5倍的DNA模板2μL,反应液23μL,

反应液包括12.5μLSYBRPremixExTaqTM(2x),0.5μLROXReferenceDye

II(50x),前、后引物各1μL(5pmol◦L-1,英骏生物工程公司,上海)和8μL超纯水。

反应程序为95℃予变性30s,94℃变性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,40

个循环。

1.2.6数据分析利用SPSS13.0软件进行数据方差分析。

2结果与分析

2.1厌氧氨氧化细菌的PCR扩增

利用厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因的特异引物对红壤稻田土壤DNA进行扩增,

琼脂糖电泳结果显示(图1)各个样品中都能得到目的片段,目的片段大小约为500

bp,且所有样品均只扩增到单一的目的片段条带。

2.2PCR产物克隆

将上述扩增得到的6个样品的PCR产物进行混合后再纯化,用pMD18-T载体连接

PCR纯化产物,以大肠杆菌DH5α制备的感受态细胞转化连接产物,在氨苄青霉素平

板上进行蓝白斑试验筛选阳性克隆。再用厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因的特异

引物对阳性克隆菌的菌液进行PCR鉴定,琼脂糖电泳结果显示(图2)阳性克隆菌的

菌液能够扩增出单一的目的片段,表明厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因重组质粒构

建成功。

图1红壤稻田土壤厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因扩增Fig.1PCRof16SrDNA

geneofanaerobicammonium-oxidizersinredpaddysoil注:1-分蘖期表

土;2-孕穗期表土;3-成熟期表土;4-分蘖期根层土;5-孕穗期根层土;6-成熟期根层

土;M-100bpDNAladder

将该质粒菌液送往上海英骏生物工程有限公司进行测序,获得大小为502bp克隆

片段序列。测序结果在GenBank上进行Blast同源性比对显示:该克隆序列与

GenBank已公布的厌氧氨氧化细菌同属浮霉细菌

[Unculturedplanctomycete(GQ443694)]同源性为94%。结果表明该重组质粒

DNA可以作为厌氧氨氧化细菌荧光定量PCR检测的标准样品。以含有该序列的重

组质粒作为标准DNA进行了红壤稻田土壤的厌氧氨氧化细菌的荧光定量PCR检

测。

图2克隆菌的菌液PCR扩增Fig.2PCRofpositiveclone注:1-克隆菌菌液;M-

100bpDNAladder。

2.3厌氧氨氧化细菌的荧光定量PCR检测

运用SYBR染料法荧光定量PCR检测了水稻各生育期红壤稻田表土和根层土中的

厌氧氨氧化细菌数量。待测样品和标准曲线样品均重复3次,图3-a显示了待测样

品和不同稀释倍数的重组质粒DNA的扩增曲线,图3-b显示了根据重组质粒所制

定的标准曲线,其R2为0.995、斜率-3.39、截距40.78,线性范围可达到8个数量

级(7.86×102～7.86×109cells◦μL-1)。通过该标准曲线计算可获得各生育期土

壤待测样品中的厌氧氨氧化细菌数量。

图3荧光定量PCR扩增曲线(a)和标准曲线(b)Fig.3Amplificationcurve(a)and

standardcurve(b)ofreal-timePCR

图4不同生育期稻田土壤厌氧氨氧化细菌数量变化Fig.4Changesinnumberof

anaerobicammonia-oxidizersinpaddysoilduringricegrowingseason

水稻不同生育期内土壤厌氧氨氧化细菌数量如图4所示。由此可见,红壤稻田土壤

的厌氧氨氧化细菌数量在1.0×108～7.0×108copies◦g-1drysoil,且水稻生育期

内稻田表土和根层土中的厌氧氨氧化细菌数量都具有增加趋势,其中表土中细菌数

量呈明显的线性增加(P＜0.05),而根层土中细菌数量在生育中前期变化不大,生育

后期才显著增加(P＜0.05)。

3结论与讨论

厌氧氨氧化脱氮过程与硝化、反硝化过程相比能节省大量氧气和有机碳,格外值得

关注。虽然研究表明厌氧氨氧化细菌应在自然环境中广泛存在,但由于目前这类菌

的分离培养还十分困难,使得对于厌氧氨氧化细菌的生理生态特性及其在自然界中

可能存在的新种的描述都还很不够。应用分子生物学方法通过对16SrDNA基因

的研究能够鉴定环境中的厌氧氨氧化细菌,为这类微生物的研究提供了技术[9-10]。

稻田土壤长期淹水,具有进行厌氧氨氧化过程的条件,而稻田土壤中的好氧/厌氧界面

又能为厌氧氨氧化微生物提供理想的生境。因此稻田土壤中有可能存在厌氧氨氧化

过程及其相关微生物。本研究通过利用厌氧氨氧化细菌16SrDNA基因特异引物,

从稻田土壤中扩增到与厌氧氨氧化细菌同属分枝很深的浮霉菌的16SrDNA基因

片段,并以含有此片段序列的重组质粒DNA为标准品,运用荧光定量PCR技术检测

到稻田土壤中存在较丰富的该基因片段。结果表明稻田土壤中应存在一定数量的厌

氧氨氧化细菌,而这些厌氧氨氧化细菌的种类组成、是否含有新种、是否具有厌氧

氨氧化活性及其对土壤硝化作用的影响等问题都还有待进一步研究。

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