亚洲鳄 暹罗鳄可以当宠物吗

亚洲鳄 暹罗鳄可以当宠物吗

生活中的感动-雨巷教学设计

２０１ １年１２月第１卷第２４期

暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽对小鼠免疫功能的影响

王凤林１ 万林春２ 李谨谨３ 张硕峰３

１．武警总医院药剂科，北京１０００３９；２．江西省食品药品检验所，江西南昌３３００２９；３．北京中医药大学，北京１００１０２

【摘要】目的观察暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽对小鼠免疫功能的影响。方法采用环磷酰胺为免疫抑制剂，获得免疫功能

低下的小鼠动物模型。比较小鼠服用胶原蛋白前后，小鼠Ｔ淋巴细胞增殖功能、ＮＫ细胞的杀伤功能以及小鼠碳粒廓清

能力。结果胶原蛋白多肽对免疫功能低下小鼠Ｔ淋巴细胞的增殖功能、ＮＫ细胞的杀伤活性，均具有免疫增强作用

（Ｐ＜０．０５），并呈剂量依赖性。结论鳄鱼鳞胶原蛋白多肽具有正向调节小鼠免疫功能的能力。

［关键词】暹罗鳄；胶原蛋白多肽；免疫功能

【中图分类号】Ｒ９６５ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】２０９５—０６１６（２０１１）２４—３４—０２

Ｏｂｓｅｒｖｅ ｓｉａｍｅｓｅ ｃｒｏｃｏｄｉｌｅｓ ｓｃａｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ

ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ

ＷＡＮＧ Ｆｅｎｇｌｉｎ ＷＡＮ Ｌｉｎｃｈｕｎ ＬＩ ｉｎ ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕｏｆｅｎｇ

１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ Ａｒｍｅｄ Ｐｏｌｉｃｅ Ｆｏｒｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｊｉａｎｇｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ

Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００２９，Ｃｈｉｎａ；３．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１２，Ｃｈｉｎａ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｓｉａｍｅｓｅ ｃｒｏｃｏｄｉｌｅｓ ｓｃａｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

Ｃｙｃｌｏｐｈ０ｓｐｈａｍｉｄｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｇｅｔｔｅｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｌｏｗ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔａｋｉｎｇ

ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｍｉｃｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｏ ｋｉｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｒｂｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｂｉｌｉｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ

Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｌｏｗ ｍｉｃｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｋｉｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｌｌ ｈａｄ ｉｍｍｕｎｏ—

ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆＰ＜０．０５）。ａｎｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ ｓｃａｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｈａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｄｊｕｓｔ ｔｈｅ ｍｉｃｅ

ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｂｉｌｉｔｙ

【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ Ｓｉａｍ ａｌｌｉｇａｔ０ｒ；Ｃ０ｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ；Ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ

胶原蛋白多肽是胶原蛋白经蛋白酶酶解后的产物，其生物

活性主要体现在提高免疫活性、降血压、调血脂、抗氧化、活化

细胞机能和抑制肿瘤活性等方面＿１＿。另外，胶原蛋白多肽还具

有改善皮肤的功效。津田友香等从鱼皮中得到水解胶原三肽，

并证明具有促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的生成、改

善皮肤弹性的作用［２１。Ｋｏｙａｍａ等 发现胶原蛋白多肽能提高

皮肤真皮和表皮的功能。在美国、德国、日本等国家，许多高档

化妆品中添加有胶原蛋白。美国ＣＴＦＡ化妆品原料手册录用

的天然物质和《功能性化妆品原料》中，都有胶原蛋白或其水

解产物［４－５１。文献报道中多为各种鱼鳞胶原蛋白的免疫增强作

用。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨暹罗鳄鱼鳞胶原蛋

向多肽对正常小鼠免疫功能的影响。

１材料与方法

１．１材料与试剂

鱼鳞胶原蛋白肽：购自山东省青州隆贝生物科技有限公

司，暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽『鲁卫食证字（２００８）第３７０７８１—

００５１７９号）】：鳄鱼皮购自养殖场，胶原蛋白自制；制法：用

热水烫鳄鱼皮，使鱼鳞自皮上脱落，得到的鱼鳞剪成小块，加

０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液（Ｗ：Ｖ＝ｌ：６）浸泡１ ｈ，水洗至中

性。再加０．２％硫酸溶液（Ｗ：Ｖ＝ｌ：６）浸泡１ ｈ，水洗至

中性，最后用热水抽提过夜，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃去沉淀

不溶物，得到粗胶制品，浓缩后，４５℃低温蒸于。称取制备的胶

原蛋白，用１００ ｍＬ ｐＨ ９．０的缓冲液（Ｏ．０２ ｍｏｌ／Ｌ）溶解制成ｌ％

３４十一医药辱牛詈ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ

的胶原溶液。加中性蛋白酶（酶与底物比为ｌ：２０）并在４５℃

水浴中水解５ ｈ后，１５ ｒａｉｎ沸水浴中灭活酶，离心（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ）

１５ ｍｉｎ。用超滤膜对上清液进行超滤处理，得到多肽，于冷冻干

燥机中冻干，备用；清洁级ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，１８ ２２ ｇ，购自北京

大学医学部实验动物中心，ＳＣＸＫ《京》２００６—０００９；刀豆蛋白

Ａ（ＣｏｎＡ）购自Ｓｉｇｍａ公司；ＭＴＴ、Ｈａｎｋｓ液（ｐＨ ７．２～７．４）、

ＲＰＭＩ１ ６４０完全培养液、碘硝基氯化四氮唑（ＩＮＴ）、吩嗪二甲酯

硫酸盐（ＰＭＳ）、环磷酰胺（ＣＴＸ）、台盼兰等。

１．２方法

１．２．１ 分组与给药将ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每组１０只随机分为６

个组：对照组、模型组、鱼鳞胶原蛋白多肽４００ ｍｇ／ｋｇ组、暹罗

鳄鱼鳞胶原蛋白多肽２００、４００、８００ ｍｇ／ｋｇ组。造模同时开始灌

胃给药，每天１次，连续１５ ｄ。对照组给予饮用水０．２ ｍＬ／１０ ｇ

体重。

１．２．２造模方法 除对照组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰

胺，０．６ ｍｇ／次，每日１次，共３次，对照组腹腔注射等量生理盐

水０．２ｍＬ／１０ ｇ体重。

１．２．３小鼠脾淋巴细胞的制备用７５０ ｍＬ／Ｌ酒精浸泡处死后

的小鼠，无菌条件下获取其脾脏。脾脏置于１００目网上轻轻碾

碎，滤过后加入试管中，离心（１ ０００ ｒ／ｍｉｎ）５ ｍｉｎ，将细胞洗涤后弃

去上清液，用１６４０培养液重悬细胞至４ ｍＬ，轻轻铺于小鼠淋巴细

胞分离液（３ ｍＬ，比重１．０８８）上，离心（２ ０００ ｒ／ｍｉｎ）２０ ｍｉｎ。吸

取单核淋巴细胞（ＰＢＬ），１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心，计数细胞，用１６４０（含

２０１１年１２月第１卷第２４期

１０％ＦＣＳ）调整ＰＢＬ的密度至５×１０ ／Ｌ待用。

１．２．４ ＣｏｎＡ诱导小鼠Ｔ淋巴细胞转化实验连续对小鼠灌胃

１５ ｄ，将其颈椎脱臼处死，无菌条件下获取其脾脏，用镊子将脾

在盛有适量无菌Ｈａｎｋｓ液的小平皿中轻轻撕碎，２００目筛网过

滤制成单细胞悬液，悬液分为２部分，用于转化实验备用。细

胞悬液用Ｈａｎｋｓ液洗涤２次，每次进行１０ ｒａｉｎ（１ ０００ ｒ／ｒａｉｎ）

离心，然后将细胞悬浮于１ ｍＬ的完全培养液中，台盼兰染色计

数活细胞数（在９５％以上），将细胞浓度调整为３ Ｘ １０６个／ｍＬ。

每份细胞悬液分两孑Ｌ加人２４孔培养板中，每孔１ ｍＬ，一孔加

７５ Ｌ Ｃｏｒ￣＿液作为实验，另一孔作为对照，置培养箱中培养７２ ｈ。

培养结束前４ ｈ，每孔吸去上清液０．７ ｍＬ，加入０．７ ｍＬ不含血

清的ＲＰＭＩ １６４０培养液，同时加入ＭＴｒ ５０ＩＸＬ／孔，继续培养４ｈ。

培养结束后，每孔加人１ ｍＬ酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结

晶完全溶解。然后分装到９６孔培养板，每孑Ｌ做３个平行孔，用

酶标仪以５７０ ｎｍ波长测定光密度值。以实验孔与对照孑Ｌ ＯＤ

的差值代表淋巴细胞增殖能力。

１．２．５小鼠ＮＫ细胞杀伤功能实验采用ＬＤＨ释放法。将小

鼠脾细胞悬液（５ Ｘ １０６／Ｌ）加入９６孔细胞培养板内，１００ Ｌ／孔。

将体外传代培养的ＹＡＣ一１靶细胞离心，并调整细胞密度为

１ Ｘ １０ ／Ｌ，加于９６孔培养板中，１００ Ｌ／孔（１×１０４细胞／孔），

置３７℃、ＣＯ 培养箱中培养４ ｈ。同时设自然释放和最大释放组。

以１ ０００ ｄｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，吸取上清１００ Ｌ，加入ＬＤＨ底物液

１００ Ｌ，静置３０ｍｉｎ显色。随后加入０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１终止反应，

于波长４９０ｎｍ读取Ａ值，参照马安伦等同计算ＮＫ细胞的杀伤率。

１．３统计学处理

用ＳＰＳＳ１６．０软件，测定结果数据均用（ 士Ｓ）表示，对结果

进行ｔ检验，对于ＮＫ细胞杀伤活性的实验，结果采用秩和检验

分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２结果

２．１胶原蛋白多肽对淋巴细胞增殖功能的影响

结果表明给药组小鼠Ｔ淋巴细胞的增殖功能较环磷酰胺

组小鼠的功能有明显上升。特别是鳄鱼胶原肽中、高剂量组变

化更为明显（与模型组比较，Ｐ＜０．０１）。见表１。

表１ 鳄鱼胶原肽对环磷酰胺致免疫功能损伤小鼠脾淋巴细胞

增殖功能的影响（ ±Ｓ）

注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５；与模型组比较， Ｐ＜０．０１

２．２胶原蛋白多肽对小鼠ＮＫ细胞杀伤活性的影响

不同组别的ＮＫ细胞杀伤结果显示，胶原蛋白肽不仅对环

磷酰胺的免疫抑制效应具有拮抗作用，而且具有正向免疫调节

作用，可提高小鼠的免疫功能，且呈一定的剂量依赖性。不同

剂量的胶原蛋白多肽的ＮＫ细胞杀伤活性与环磷酰胺组相比，

也有不同程度的提高。见表２。

表２ 鳄鱼胶原肽对环磷酰胺致免疫功能损伤小鼠ＮＫ细胞

杀伤活性的影响（ ±Ｓ）

注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５；与模型组比较， Ｐ＜０．Ｏｌ

３讨论

近年来，鳄鱼进入我国境内，形成一门新的特种动物养殖

业，国内养殖以暹罗鳄、湾鳄、尼罗鳄为主。国家林业局在２００３

年公布可以商业开发的５４种野生动物中，就包括暹罗鳄在内

的多种鳄鱼品种，这些品种都为人工养殖的子二代。随着鳄鱼

人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐

饮、时装皮具等。鳄鱼皮主要用于制作高档皮具，鱼鳞却成了

工业垃圾。如何提取、利用鱼鳞的胶原蛋白多肽将会成为水产

综合开发的新突破。

本研究所先前研究表明，采用环磷酰胺作为免疫抑制剂处

理的小鼠，其Ｔ淋巴细胞增殖功能、ＮＫ细胞的杀伤功能明显

低下。给予小鼠灌胃鳄鱼胶原蛋白多肽后，小鼠Ｔ淋巴细

胞的增殖功能、ＮＫ细胞的杀伤活性，均具有免疫增强作用

（Ｐ＜０．０５），并呈剂量依赖性。由此可知，暹罗鳄鱼鳞胶原蛋

白多肽是可以开发成为增强免疫力保健食品的。

［参考文献】

…郭瑶，曾名勇，崔文萱．水产胶原蛋白及胶原多肽的研究进展ｆＪＪ．水产科

学，２００６，２５（２）：１０１—１０２．

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（４）：２４６—２４８．

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ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００６，３４（６）：８２—８５．

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１９９７：１９７．

［６】马安伦，葛海良，张冬青．抗ＣＤ９４ｍＡｂ与ＮＫ细胞、 ６＋Ｔ细胞及ＣＴＬ

功能的关联［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００１，１７（２）：１６４—１６５．

（收稿日期：２０１１－１１－１１）

ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ十一五药斜晕３５