cds序列

cds序列

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2023年3月17日发(作者：围墙压顶)

陈其军：缩略词

ＡＡ０３

ａｂａ

ＡＢＡ

ＡＢＦ

ａｂｉ

ＡＢＲＥ

ＡＲＥＢ

ＡＴＨＫｌ

芦＾ｌＴＫ

卢ＡＩＴＬｌ

ＡｌＩＴＬ２

ｂＤ

ｂＺｌＰ

ＣａＭ

ＣａＭＫ¨

ＣａＭＶ

ＣＢＦ

ＣＯＰＫ

ＣＤＳ

ＣＯＲ

ＣＦｒＴ

ＤＲＥ

ＤＲＥＢ

ＥＲＡｌ

ｅｒｄ

ＥＲＥＢＰ

ＥＲＫ

ＨＯＳ

Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３

Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４

Ｉｎｓ（１．３，４。５，６）Ｐ５

Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４

Ｉｎｓ（１，４．５）Ｐ３

Ｉｎｓ（３，４．５，６）Ｐ４

ＩｎｓＰ６

缩略词

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ａｌｄｅｈｙｄｅ

ｏｘｉｄａｓｅ３

ＡＢＡ—ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ

ａｂｓｃｉｓｉｃ

ａｃｉｄ

ＡＢＲＥ—ｂｉｎｄｉｎｇ

ｆａｃｔｏｒ

ＡＢＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ＡＢＡ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ

ＡＢＲＥ·ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ

ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３．４－ｔｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５，６－ｋｉｎａｓｅ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ＪｎｏｓＪｔｏｌ

１．３．４－ｔｒｉｓｐｈＯｓｐｈａｔｅ

５，６一ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

１

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ１，３，４－ｌｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ５／６一ｋｉｎａｓｅ—ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

２

ｂａｓｅ

ｐａｉｒｓ

ｂａｓｉｃｌｅｕｃｉｎｅ

ｚｉｐｐｅｒｔｙｐｅ

ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ

Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ

Ｉ｜

ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ

Ｃ·ｒｅｐｅａｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ

ｆａｃｔｏｒ

ｃａｌｃｉｕｍ

ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ａｎｄｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ

ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ

ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ

Ｃ－ｒｅｐｅａｔ

ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ

ＤＲＥ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ

ｅｎｈａｎｃｅｄ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏ

ＡＢＡ

ｅａｒｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｔｏ

ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ

ｅｔｈｙｌｅｎｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ

ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ

ｅ）ｃＩｒａｃｅｌｌｕｌａｒ

ｒｅｇｕｌａｔｅｄ

ｋｉｎａｓｅ

Ｈｉｇｈ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

Ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１．３．４－ｔｄｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ＩｎｏｓｉｔｏＩ

１．３，４，５－ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ

Ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１．３，４，５．６·ｐｅｎｔａｐｈＯｓｐｈａｔｅ

Ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３，４，６－ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ

Ｉｎｏｓｉｔｏｌｌ，４．５．ｔｒｉｓｐｈＯｓｐｈａｔｅ

ＩｎｏｓｉｔｏＩ

３，４．５．６－ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ＩｎｏｓｉｔｏＩ

１，２，３．４，５．６一ｈｅｘａｐｈＯｓｐｈａｔｅ

中国农业大学博士学位论文

ＩＰ３．ＩｎｓＰ３

ＫｌＮ

ＬＯＳ

ＬＴｌ

ＬＵＣ

ＭＡＰｋ

ＭＡＰＫＫ

ＭＡＰＫＫＫ

ＮＥＣＤ

ｏＲ

ＰＩ—ＰＬＣ

Ｐｔｄｌｎｓ（４，５）Ｐ２

ＲＤ

ｓｆｒ

ＳＯＳ

ＺＥＰ

Ｉｎｓ（１．４。５）Ｐ３

ｃｏｌｄ．ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ

Ｌｏｗ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

ｉｎｄｕｃｅｄ

ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ

ｍｉｔｏｇｅｎ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｓ

ｍｉｔｏｇｅｎ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ

ｍｉｔｏｇｅｎ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ

ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ

９－ｃｉｓ－Ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ

Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ

ｏｓｍｏｔｉｃ

ｓｔｒｅｓｓ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ

ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ

ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ

Ｃ

ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ４．５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＩＰ２

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｔｏ

ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ

ｔｏ

ｆｒｅｅｚｉｎｇ

ｓａｌｔ

ｏｖｅｒｌｙ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ

ｅｐｏｘｉｄａｓｅ

陈其军：摘要

编码１，３，４．三磷酸肌醇５／６．激酶类似物的拟南芥

基因在非生物胁迫反应中的功能分析

摘要

ｆ植物一生中注定要停留在它发芽生根的地方，频繁地暴露于不利的环境条件中。

极端的温度，干旱和高盐极大地影响着植物的生长，发育和繁殖。为了存活，植物在

进化中逐渐形成了一个复杂的信号网络感知不断变化的环境，保护自身免受环境胁迫

的影响。了解植物感知和传导胁迫信号的机制对于理解植物对胁迫的适应和反应，从

而利用生物技术的方法对胁迫耐受性状进行遗传改良，是至关重要的。伪了逐步阐明

胁迫信号转导的机制，需要发现更多与胁迫相关的新基因和功能未知的基因并对它们

在胁迫信号转导中的作用进行研究。我们研究分析了编码Ｉ，３，４．三磷酸肌醇５／６一激酶类

似物的拟南芥基因在逆境胁迫反应中的作用。

／本研究以对照和盐处理的拟南芥幼苗为材料，利用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选Ｎ－

个受盐诱导的功能未知的基因。Ｂｌａｓｔ分析表明，该基因编码１，３，４．三磷酸肌醇５／６一激酶

类似物，命名为ＡｔｌＴＬｌ。根据Ｂｌａｓｔ分析结合我们的实验结果，发现爿盯咒，基因的前

体ｍＲＮＡ有两种剪接方式，产生的两种ｍＲＮＡ或相应的ｅＤＮＡ被分别命名为ＡｔｌＴＬｌａ

和彳埘咒肋。我们通过ｍＲＮＡ差异显示筛选到的ｅＤＮＡ序列为．４ｔｌＴＬｌａｅＤＮＡ。

Ｂｌａｓｔ分析还发现，拟南芥基因组中包括ＡｔｌＴＬｌ在内共有３个基因编码５／６．激酶类

似物。其中的一个基因已有文献报告其编码的蛋白具有５１６．激酶活性。该基因被命名

为．４ｔｌＴＫ。另一基因同．４ｔＩＴＬｌ一样编码５／６．激酶类似物，该基因被命名为ＡｔｌＴＬ２。利

用ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增并克隆了拟南芥基因组中３个编码５／６．激酶类似物基因的ＣＤＳ。

其中，ＡｔｌＴＬＩａ和ＡｔｌＴＫ基因的ＣＤＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的序列一致，但ＡｔｌＴＬ２的

ＣＤＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＤＳ序列有较大的差异。／７

对拟南芥基因组中所有３个编码５／６一激酶类似物的基因在胁迫条件下的表达进行

了Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果表明，ＡｔｌＴＬｌ基因除受盐诱导外，还受低温诱导，但不受

干旱和ＡＢＡ诱导；高盐、低温、干旱及ＡＢＡ处理均诱导ＡｔｌＴＫ基因的表达，干旱和

ＡＢＡ对该基因的诱导强于高盐和低温；ＡｔｌＴＬ２基因似乎不受胁迫诱导。分析推测的

ＡｔｌＴＬＩ和ＡｔｌＴＫ基因的５’启动子区发现两者均存在不依赖于ＡＢＡ的ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式作

用元件，在推测的ＡｔｌＴＫ基因的５’启动子区还存在对ＡＢＡ反应的Ｇ．ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相

中国农业大学博士学位论文

关的元件。这些结果表明，编码ｌ，３，４．三磷酸肌醇５／６．激酶类似物的拟南芥基因家族的

不同成员可能参与了依赖于ＡＢＡ和（或）不依赖于ＡＢＡ的胁迫信号传递途径。

／为了研究编码ｌ，３，４一三磷酸肌醇５／６一激酶类似物的基因在胁迫反应中的生理功能，

我们分别构建了ＡｔｌＴＬｌａ和ＡｔｌＴＫ的转基因表达载体，并获得了ＡｔｌＴＬｌａ超表达的转基

冈烟草和转基因拟南芥。对ＡｔｌＴＬｌａ转基因烟草在胁迫条件下的表现型进行初步分析

的结果表明，转基因烟草幼苗对ＮａＣＩ胁迫更加敏感。对转基因拟南芥在盐胁迫条件下

的表现型也进行了初步的功能分析，结果表明，转基因拟南芥幼苗对ＮａＣＩ胁迫的耐受

性增强。

为了从分子水平探讨ＡｔｌＴＬｌ或ＡｔｌＴＫ基因在陵塑值量佳递鲢中的地位，需要分析

爿盯死，或ＡｔｌＴＫ基因超表达的转基因拟南芥中对其它胁迫相关基因的影响。为此目的，

我们克隆了ＲＤ２９Ａ，ＲＤ２９Ｂ，ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６和ＫＩＮｌ等７个胁迫诱

导基因片段。克隆的这些基因片段可作为Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析用的探针，研究转基因拟

南芥中ＡｔｌＴＬｌａ或ＡｔｌＴＫ超表达后对这些胁迫诱导基因表达的影响。为了分析ＡｔＩＴＬｌａ

蛋白的生化功能以及从蛋白水平上研究这些基因在胁迫反应中的表达，我们构建了原

核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达了ＡｔｌＴＬｌａ的融合蛋白。利用融合蛋白上的组氨

酸标签分离纯化了融合蛋白并制备了相应的抗体。利用我们制各的抗体对野生型和３

个转基因烟草品系进行了Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，结果表明，

３个转基因品系有而野生型

没有抗体抗原反应信号。说明转基因烟草中ＡｔｌＴＬｌａ蛋白得到正常表达。７个胁迫相关

基因的克隆及ＡｔＩＴＬＩａ蛋白抗体的获得，为深入研究一ｔ玎ｚ肠或ＡｔｌＴＫ的基因功能奠

定了基础。）吖

关键词拟南芥ＡｔｌＴＬｌＡｔＦＦＬ２ＡｔｌＴＫ逆境胁迫删髓帕瑚Ｈ爿慨曲蜘喇ｐ一‘

２

陈其军：摘要

Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ

Ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

Ｇｅｎｅｓ

Ｅｎｃｏｄｉｎｇ

Ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３，４一Ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５／６一Ｋｉｎａｓｅ—ｌｉｋｅＰｒｏｔｅｉｎ

ｉｎ

Ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏＡｂｉｏｔｉｃＳｔｒｅｓｓｅｓ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｄｅｓｔｉｎｅｄｔｏｒｅｓｉｄｅｉｎｔｈｅｈａｂｉｔａｔｓｏｆ

ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．ｐｌａｎｔｓａｒｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｅｘｐｏｓｅｄ

ｔｏｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｅｘｔｒｅｍｅ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｄｒｏｕｇｈｔ．ｓａｌｉｎｉｔｙ

ｇｒｅａｔｌｙ

ａｆｆｅｃｔ

ｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｏ

ｓｕｒｖｉｖｅ，ｐｌａｎｔｓ

ｈａｖｅ

ｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｃｏｍｐｌｅｘｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｎｅｔｗｏｒｋｔｈａｔ

ｓｅｎｓｅｓ

ａｎｄ

ｐｒｏｔｅｃｔｓ

ｔｈｅｍ

ｆｒｏｍａｎ

ｅｖｅｒ－ｃｈａｎｇｉｎｇｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ

ｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ

ｂｙ

ｗｈｉｃｈ

ｐｌａｎｔｓｐｅｒｃｅｉｖｅ

ａｎｄｔｒａｎｓｄｕｃｅｔｈｅｓｔｒｅｓｓ

ｓｉｇｎａｌ

ｉｓ

ｔｈｅ

ｋｅｙ

ｔｏ

ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇａｄａｐｔａｔｉｏｎ

ａｎｄ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｏｆ

ｐｌａｎｔｓ

ｔｏｓｔｒｅｓｓｅｓａｎｄｔｏ

ｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ

ｏｆｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ

ｔｈｒｏｕｇｈ

ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎ

ｏｒｄｅｒｔｏ

ｃｌａｒｉｆｙ

ｔｈｅ

ｍｅｃｈａｎｉｓｍ

ｏｆｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｉｎ

ｐｌａｎｔｓ，

ｍｏｒｅｎｏｖｅｌａｎｄｕｎｋｎｏｗｎ

ｇｅｎｅｓ

ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｓｈｏｕｌｄ

ｂｅ

ｆｏｕｎｄａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓ

ｓｉｇｎａｔｉｎｇ

ｓｈｏｕｌｄｂｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｗｅｆｉｒｓｔ

ｒｅｐｏｒｔ

ｔｈａｔｔｈｅ

ｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ１，３，４－ｌｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ５／６·ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎａｒｅ

ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｏｆ

ｐｌａｎｔｓ

ｔｏｓｔｒｅｓｓｅｓ．

Ｂｙ

ｍＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ

ｄｉｓｐｌａｙ

ｆｒｏｍ

ｃｏｎｔｒｏｌｖｅｒｓｕｓＮａＣＩ·ｓｈｏｃｋｅｄ

Ａｒｓｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ｗｅ

ｓｃｒｅｅｎｅｄａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ３’ｐａｒｔｉａｌ

ｃＤＮＡ．ｗｈｉｃｈ

ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓａｇｅｎｅ

ｅｎｃｏｄｉｎｇ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３。４－ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５１６－ｋｉｎａｓｅ·ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ

ｏｆｔｈｅＢｌａｓｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ａｎｄｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ。ｔｈｅ

ｐｒｅ－ｍＲＮＡｓ

ｏｆｔｈｅＡｔｌｔＬｌ

ｇｅｎｅ

ｈａｖｅ

ｔｗｏ

ｓｐｌｉｃｉｎｇｗａｙｓ．Ｔｈｅ

ｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｍＲＮＡｏｒｒｅｓｕｌｔａｎｔ

ｃＤＮＡ

ｏｗｉｎｇ

ｔｏ

ｔｈｅ

ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ

ｓｐｌｉｃｉｎｇ

ｗｅｒｅｎａｍｅｄａｓＡｔｌＴＬｌａａｎｄＡｆｆ丁Ｌ伯．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐａｒｔｉａｌ

ｃＤＮＡｓｃｒｅｅｎｅｄ

ｂｙ

ｍＲＮＡ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ

ｄｉｓｐｌａｙ

ｉｎｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔ

ｔｈｅ

Ａｔ／ＴＬ伯ｃＤＮＡ．

Ｂｌａｓｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ａｌｓｏｆｏｕｎｄｔｈａｔ

ｅｘｃｅｐｔ

ＡｔｌＴＬｌ．ｔｈｅｒｅ

ｅｘｉｓｔｔｗｏｏｔｈｅｒ

ｇｅｎｅｓ

ｅｎｃｏｄｉｎｇ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３。４－ｔｄｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５／６－ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｎｅ

ｏｆｔｈｅ

ｇｅｎｅｓ，

ｎａｍｅｄ

ａｓＡｔｌＴＫ，ｈａｓ

ｂｅｅｎ

ｒｅｐｏｒｔｅｄ

ｔｏｅｎｃｏｄｅｉｎｏｓｉｔｏｌ１．３，４－ｔｒＩｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５１６－ｋｉｎａｓｅａｎｄｉｔｓ

ｐｒｏｄｕｃｔ

ｈａｓｂｅｅｎ

ｒｅｐｏｒｔｅｄ

ｔｏ

ｈａｖｅ

ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，３．４－ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ

５／６－ｋｉｎａｓｅ．

Ａｎｏｔｈｅｒ

ｇｅｎｅ，ｎａｍｅｄａｓＡｔｌＴＬ２，ｅｎｃｏｄｅ

ｔｈｅ

３

中国农业大学博士学位论文

ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１。３．４－ｌｒｉｓｐｈＯｓｐｈａｔｅ

５／６－ｋｉｎａｓｅ—ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ．

Ｗｅ

ｃｌｏｎｅｄ

ｔｈｅＣＤＳｏｆｔｈｅ

ｔｈｒｅｅ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｇｅｎｅｓ

ｅｎｃｏｄｉｎｇ

ｉｎｏｓｉｔｏｌ１．３，４－ｌｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ５１６一ｋｉｎａｓｅ．１ｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｈｒｏｕｇｈ

ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

ｏｆｔｈｅＣＤＳｏｆ

ＡｔｌＴＬｌａａｎｄ

ＡｔｌＴＫ

ｃｌｏｎｅｄ

ｉｎｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ

ｗｉｔｈｔｈｏｓｅ

ｌｏｇｇｅｄ

ｉｎ

ｔｈｅＧｅｎＢａｎＫ

Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＡｔｌＴＬ２ｃｌｏｎｅｄｉｎ

ｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ

ｉｓ

ｓｏｍｅｗｈａｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍ

ｔｈａｔ

ｌｏｇｇｅｄ

ｉｎｔｈｅＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｔａｔｔｅｒｉｓ

ｔｈｅ

ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ

ＣＤＳ

ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔｏｔｈｅ

ｇｅｎｏｍｉｃ

ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．

Ｗｅ

ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ

Ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆａｌｌ

ｏｆｔｈｅ

ｔｈｒｅｅ

ｇｅｎｅｓ．Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ—ｆ『７＿Ｌ，ｉｓ

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ｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙ

ＮａＣＩ

ａｎｄｌｏｗ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｂｕｔ

ｎｏｔｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙｄｒｏｕｇｈｔ

ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ（ＡＢＡ）；Ｔｈｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

Ａｌ｜ＴＫｉｓｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙ

ａｌｌｔｈｅ

ｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｅｓｔｅｄａｎｄｉｎｄｕｃｅｄ

ｍｏｒｅ

ｓｔｒｏｎｇｌｙｂｙ

ｄｒｏｕｇｈｔ

ａｎｄ

ＡＢＡｔｈａｎ

ｂｙ

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ｃｏｌｄ；Ｔｈｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｔｈｅ芦＾ＩＴＬ２

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ｎｏｔ

ｔｏｂｅｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙ

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ｏｆ

ｔｈｅ

ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ５’ｐｒｏｍｏｔｅｒ

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ｔｈｅｒｅａｒｅＤＲＥ／ＣＲＴ

ｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ／Ｃ－ｒｅｐｅａｔ）ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ。ｂｕｔｎｏｅｌｅｍｅｎｔｓ

ｒｅｌａｔｅｄｔｏＧ—ｂｏｘａｎｄＡＢＲＥ

（ＡＢＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ）ｉｎｉｔｓ

５’ｒｅｇｉｏｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ

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ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１．３，４－ｔｒｉｓｐｈｏｓ—

ｐｈａｔｅ

５／６一ｋｉｎａｓｅ—ｌｉｋｅ

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ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ

ｔｈｅ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

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ｔｈｅＡｔＩＴＫ

ｇｅｎｅｓ。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。ａｎｄ

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ｔｈｅ

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Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ

ｔｈｅＡⅣ７＿Ｌ７

ｇｅｎｅｓ

Ｔｈｅ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

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ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ

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ｔｈｅ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｒｅｍｏｒｅｔｏｌｅｒａｎｔｔｏｓａｌｔ

ｔｒｅｓｓ．

ＴｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆＡＵＴＬｌ

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ｓｔｒｅｓｓ

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ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

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ｃｌｏｎｅｄ

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４

陈其军：摘要

ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅ

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ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｎ

ｏｒｄｅｒｔｏ

ａｎａｌｙｚｅ

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ｆｕｎｃｔｉｏｎ

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ｔｏｂａｃｃｏｓｈａｖｅ

ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ

ｓｉｇｎａｌｓ，ｂｕｔ

ｔｈｅｗｉｌｄ

ｔｙｐｅ

ｔｏｂａｃｃｏｈａｓｎｏｓｉｇｎａｌ

ｉｎ

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇ

ｔｈｅ

ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅｓｅｖｅｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ｏｆｓｔｒｅｓｓ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ

ｇｅｎｅｓ

ｃｌｏｎｅｄ

ａｎｄｔｈｅ

ａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒｅｄ

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Ｋｅｙ

ｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ＡｔｌＴＬｌ，ＡｔｌＴＬ２，ＡｔｌＴＫ，ａｂｉｏｔｉｃ

ｓｔｒｅｓｓｅｓ，ＤＲＥ／ＣＲＴ，

Ｇ．ｂｏｘ／ＡＢＲＥ

５

陈其军：文献综述

第一章文献综述

逆境信息传递研究进展

植物一生中注定要停留在它发芽生根的地方，频繁地暴露于不利的环境条件中。

极端的温度，干旱和高盐极大地影响着植物的生长，发育和繁殖。为了存活，植物在

进化中逐渐形成了一个复杂的信号网络感知不断变化的环境，保护植物免受环境胁迫

的影响１’２ｊ一。了解植物感知和传导胁迫信号的机制对于理解植物对胁迫的适应和反应，

从而利用生物技术的方法对胁迫耐受性状进行遗传改良，是至关重要的。

１ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的渗透或低温胁迫信号传递途径

１．１ＡＢＡ依赖的的胁迫信号传递途径

植物在对缺水和高盐条件引发的渗透胁迫反应中，许多基因的表达发生改变５，６ｔ７，８。

其中的一些渗透胁迫反应基因（ｏｓｍｏｔｉｃ

ｓｔｒｅｓｓ．ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ，ＯＲ）也能被低温胁迫

所诱导９’ｌｏ’ｌ‘。植物激素ＡＢＡ在植物对非生物胁迫反应中发挥着重要的作用。作为五大

类植物激素之一，ＡＢＡ除了参与调节植物的生长发育，如胚形成，种子休眠，茎和根

的生长以及叶片的蒸腾作用，也是植物对非生物胁迫反应的一个重要调节剂２，５，１２，１３ｅ

ＡＢＡ参与非生物胁迫表现在两个方面：一方面，在低温，干旱和盐胁迫条件下，植物

积累更多的ＡＢＡ，其中，干旱胁迫条件下，ＡＢＡ的积累最显著。另一方面，许多胁迫

反应基因的表达能够被外源ＡＢＡ所诱导，在ＡＢＡ合成或反应缺陷突变体植物中，环

境胁迫对这些基因表达的诱导性降低２，５，６０

最近几年，ＡＢＡ参与胁迫信号转导的研究进展很快，这些研究主要集中在以下几

个方面：通过利用Ｍ３Ａ的合成缺陷突变体或通过基因同源性比较克隆与ＡＢＡ合成与

代谢有关的基因，进而分析这些基因在胁迫信号转导中的作用；通过利用细胞学以及

分子遗传学的方法研究ＡＢＡ介导的胁迫信号转导链的其它组分。

高等植物ＡＢＡ来源于Ｃ４０－类胡萝ｈ素，Ｃ４０．类胡萝ｈ素（玉米黄质）在玉米黄质

环氧酶（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ

ｅｐｏｘｉｄａｓｅ，ＺＥＰ）的作用下产生全反式紫黄质（ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－ｖｉｏｌａｘａｎｔｈｉｎ），

ＺＥＰ基因已经从烟草ａｂａ２和拟南芥ａｂａｌ突变体中克隆“。全反式紫黄质是叶黄素

（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌ）的一个异构体，叶黄素的另外三个异构体分别是９一顺式．紫黄质（９＿ｃｉｓ．

ｖｉｏｌａｘａｎｔｈｉｎ），全反式新黄质（ａｌｌ－ｔｒａｎｓ—ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ）和９一顺式．新黄质（９．ｃｉｓ－ｎｅｏｘａｎｔｈｉｎ），

在ＡＢＡ合成途径中，叶黄素的其它三个异构体通过异构化作用转化为９．顺式．新黄质，

编码黄氧素合成酶的基因已经从马铃薯”和番茄”中克隆出来。９．顺式．新黄质在９．顺式

７

中国农业大学博士学位论文

－环氧类胡萝Ｉ－素双氧酶（９·ｃｉｓ·ＥｐｏｘｙｃａｍｔｅｎｏｉｄＤｉｏｘｙｇｃｎａｓｅ，ＮＥＣＤ）的作用下断裂为

黄氧索和Ｃ＿２５类胡萝ｂ索衍生物（Ｃ．２５

ｃｐｏｃａｒｏｔｃｎｏｉｄｓ），目前认为这一步骤是ＡＢＡ合

成的关键的调控步骤或限速步骤”。编码ＮＥＣＤ的基因最先从玉米ＡＢＡ缺陷型突变体

ｖｐｌ４中得到克隆”。随后从大豆”瑚，番茄”，豇豆”，鳄梨２３和拟南芥２４中克隆到ＮＥＣＤ

基因。ＡＢＡ生物合成的最后两个步骤是：黄氧素（ｘａｎｔｈｏｘｉｎ）转化为ＡＢＡ醛，ＡＢＡ

醛在ＡＢＡ醛氧化酶的作用下形成ＡＢＡ。ＡＢＡ２基因编码的产物在黄氧素转化为ＡＢＡ

醛的反应步骤中起作用，目前该基因尚未得到克隆。最近从拟南芥中克隆到了ＡＢＡ醛

氧化酶基因ＡＡ０３”’２６。

植物激素突变体可分为合成型突变体和应答型突变体。前者又可分为缺陷型突变

体和过量产生某种植物激素的突变体：或者根据突变体对植物激素的敏感性又可分为

不敏感型突变体和组成应答型突变体。有些资料将合成型突变体和组成应答型突变体

通称为组成型突变体。ＡＢＡ对种子萌发具有抑制效应，据此筛选出ＡＢＡ合成缺陷或

对ＡＢＡ的反应性改变的突变体２７，２８．２９．３０。例如，拟南芥ＡＢＡ合成缺陷突变体面口Ｊ，如ｎ２

和曲订，烟草ＡＢＡ合成缺陷型突变体ａｂａｌ和ａｂａ２，玉米ＡＢＡ合成缺陷型突变体ｖｐｌ４，

拟南芥ＡＢＡ不敏感型突变体ａｂｆ』～５等。

传统的遗传学筛选突变体的方法是通过突变体的表型来筛选，如ａｂａｌ，口６口２，口妇３

突变体的筛选是根据种子萌发特性进行筛选，ｓｏｓｌ３１，ｓｏｓ２３２，ｓｏｓ３”，ｓｏｓ４“突变体是根

据弯根实验来筛选。朱健康实验室在研究逆境胁迫信号转导过程中建立的另一套遗传

筛选系统是通过报告基因筛选突变体。。其原理是：将萤火虫发光蛋白基因ＬＵＣ与

ＲＤ２９Ａ启动子融合转入拟南芥得到ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ转基因植株，以纯合的转基因拟南芥

品系代替野生型拟南芥，经ＥＭＳ诱变处理的Ｍ２代种子用于筛选突变体。由于ＲＤ２９Ａ

启动子特异性地受干旱、高盐和低温胁迫以及ＡＢＡ诱导，正常生长条件下ＬＵＣ基因

不表达，在干旱、高盐和低温胁迫条件下以及用外源ＡＢＡ处理时，ＬＵＣ基因表达，

町以检测到萤火虫发光蛋白的发光信号。当逆境胁迫以及ＡＢＡ信号传递链中的基因发

生突变时，突变体的ＬＵＣ基因的表达模式在胁迫或正常条件下将发生改变，根据ＬＵＣ

甾白的发光情况町以分离相应的突变体。利用这套筛选系统筛选得到的突变体包括：

Ｉｏｓ５／ａｂａ３”，ｌｏｓ６／ａｂａｌ”，ＦｉｅｒｙＩ”，ｈｏｓｌ３８舯，ｈｏｓ５４０，ｈｏｓ２‘Ｉ等。

利用上述筛选系统筛选的ｌｏｓ５突变体，其ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ基因在低温、高盐和干旱

条件下的表达量降低，而对外源ＡＢＡ的反应性没有发生改变。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，

几个受胁迫诱导的基因（ＲＤ２９Ａ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ４７，ＲＤ２２和ＰＳＣＳ）在ｌｏｓ５突变体中

８

陈其军：文献综述

对低温的反应性降低，对渗透胁迫的反应大大降低甚至完全丧失。ｌｏｓ５突变体植株对

冷冻、高盐和干早胁迫的耐受性降低。ｌｏｓ５突变体表现出ＡＢＡ合成缺陷的性状，如蒸

腾作用增强，水分丧失加剧，突变体在干旱条件下积累的ＡＢＡ低于野生型。遗传分析

表明，ｌｏｓ５突变体与ａｂａ３突变体在遗传上是等位的。ＬＯＳＳ／ＡＢＡ３编码钼辅因子

（Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｃｏｆａｃｔｏｒ，ＭｏＣｏ）硫化酶（ｓｕｌｆｕｒｙａｓｅ，ｓｕｌｆｕｒａｓｅ），该酶催化形成硫化

（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｔｅｄ）的ＭｏＣｏ，后者为ＡＢＡ．醛氧化酶（ａｉｄｅｂｙｄｅｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯ）所必需，

ＡＢＡ．ＡＯ催化ＡＢＡ合成的最后一步反应，即氧化ＡＢＡ一醛最终形成ＡＢＡ。ＬＯＳＳ／ＡＢＡ３

在植物的不同部位均有表达，其表达受干旱、高盐和ＡＢＡ诱导，但不受低温诱导。

ＬＯＳ５／ＡＢＡ３基因的启动子区域含有ＡＢＲＥ和ＤＲＥ／ＣＲＴ相关的元件。ＬＯＳ５／ＡＢＡ３受

ＡＢＡ升调节，可能表明ＡＢＡ的合成受ＡＢＡ的正反馈调节。这些研究表明，ＬＯＳ５／ＡＢＡ３

在ＡＢＡ生物合成的最后步骤起着重要的调控作用。此外，也证明了ＡＢＡ在胁迫反应

基因的表达以及胁迫耐受性中起着重要的调控作用３５ｏＬＯＳ５／ＡＢＡ３不受低温诱导，这

与内源ＡＢＡ生物合成较小程度地受低温影响是一致的４，３５，４２＊ｌｏｓ５／ａｂａ３突变体中

ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ报告基因在低温胁迫条件下的诱导表达水平大大低于野生型植物，在低温

胁迫处理的同时用ＡＢＡ处理不能将突变体中ＲＤ２９Ａ—ＬＵＣ报告基因的表达水平恢复到

野生型，说明ｌｏｓ５／ａｂａ３突变体在低温胁迫条件下基因的诱导表达水平大大低于野生型

植物不是由于ＡＢＡ的生物合成缺陷造成的。另一个突变体ｌｏｓ６在渗透胁迫条件下，

其ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ报告基因在渗透胁迫条件下的表达量降低。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，与

野生型相比，ｌｏｓ６突变体中几个受胁迫诱导的基因（兄Ｄ２鲥，ｃＤ尺Ｊ鲥，ＫＩＮｌ，ＣＯＲ４７，

ＲＤｌ９和ＡＤＨ）在渗透胁迫条件下表达量降低，且ｌｏｓ６突变体内源ＡＢＡ含量降低。遗

传分析表明，ｌｏｓ６与ＡＢＡ合成缺陷突变体曲甜在遗传上是等位的。如前所述，

ＬＯＳ６／ＡＢＡｌ编码玉米黄质环氧酶，在ＡＢＡ合成的早期步骤中起作用。ＬＯＳ６／ＡＢＡｌ基

因的表达受渗透胁迫诱导。同ＬＯＳＳ／ＡＢＡ３以及ＡＢＡ合成途径的其它基因（如ＡＡ０３

和ＮＣＥＤ３）一样，ＬＯＳ６／ＡＢＡｌ基因的表达也受ＡＢＡ升调节，再次表明ＡＢＡ的合成

受ＡＢＡ的正反馈调节。在ＡＢＡ缺陷突变体中，这些参与ＡＢＡ合成的基因对渗透胁

迫的反应性大大降低，这可能是由于渗透胁迫不能诱导ＡＢＡ的合成，导致ＡＢＡ对其

它参与ＡＢＡ合成的基因的反馈调节作用被阻断的缘故。ＬＯＳ６１ＡＢＡｌ超表达的转基因植

株其ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ报告基因在渗透胁迫条件下表达增强。这些结果表明渗透胁迫诱导

基因的表达水平依赖于玉米黄质环氧酶的剂量。同时也再次表明ＡＢＡ对胁迫反应基因

的表达起着重要的调控作用”。

９

中国农业大学博士学位论文

大豆在受到水分胁迫时，其ＰｖＮＣＥＤｌ基因的ｍＲＮＡ水平以及蛋白水平强烈地升

高，这一过程发生在ＡＢＡ含量升高之前”瑚。番茄”，豇豆”，鳄梨２３的ＮＣＥＤ基因

也存在类似的情况。番茄ＬｅＮＣＥＤｌ基因超表达的转基因烟草，其叶片中的ＡＢＡ的含

量提高”。将大豆的ＰｖＮＣＥＤｌ基因导入烟草，无论以组成性超表达还是在地塞米松

（ＤＥＸ）诱导的启动子驱动下诱导性超表达，都可以导致ＡＢＡ及其代谢物红花菜豆酸

（ｐｈａｓ￡ｉｃ

ａｃｉｄ，ＰＡ）含量的增高。ＰｖＮＣＥＤＩ基因超表达的转基因植物，种子发芽延迟，

叶片的水分丧失速度大大减缓，植物对干旱胁迫的耐受性增强。对拟南芥ＡｔＮＣＥＤ３基

因超表达的转基因拟南芥植物的研究也得到类似的结果：内源ＡＢＡ的含量提高，干旱

和ＡＢＡ诱导的基因转录水平增强，植物叶片的蒸腾速率减缓，对干旱胁迫的耐受性增

强“。相反，反义ＡｔＮＣＥＤ３基因的转基因拟南芥植物以及ＡｔＮＣＥＤ３基因被Ｔ－ＤＮＡ

插入失活的敲除突变体，内源ＡＢＡ的含量降低，植物叶片的蒸腾速率增强。这些结果

表明，通过ＡＢＡ合成中的关键的调控基因超表达操纵植物体内ＡＢＡ的水平进而改善

胁迫耐受性是可行的。

调控ＡＢＡ和（或）胁迫反应基因表达的ＡＢＡ反应元件（ＡＢＡ－ｍｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｓ，

ＡＢＲＥｓ）在很多研究中得到鉴定“－锄１４７。最为广泛存在的一类ＡＢＲＥ顺式作用元件的

共有序列是（Ｃ厂ｒ）ＡＣＧＴＧＧＣ，其中许多序列包括Ｇ－ｂｏｘ序列（ＣＡＣＧＴＧ），后者存在

于其它许多受环境因子调控的基因中”。另一类ＡＢＲＥｓ元件，称为耦合元件（ｃｏｕｐｌｉｎｇ

ｅｌｅｍｅｎｔ），ｈｅ）【３或ｍｏｔｉｆＵＩ，其共有的核心序列为ＣＧＣＧＴＧ。与ＡＢＲＥｓ元件结合的

许多反式作用因子得到分离，这些反式作用因子及其同源物和其它许多Ｇ－ｂｏｘ结合因

子都属于基本亮氨酸拉链类型（ｂａｓｉｃｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｔｙｐｅ，ｂＺＩＰ）的蛋白”。

拟南芥脱水反应基因ＲＤ２９Ｂ的表达主要受ＡＢＡ介导。ＲＤ２９Ｂ启动子分析表明，

两个ＡＢＡ．反应元件（ＡＢＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＡＢＲＥｓ）是ＲＤ２９Ｂ基因受脱水诱导表

达的顺式作用元件。利用酵母单杂交的方法筛选到三个编码ｂＺＩＰ类的ＡＢＲＥ结合蛋白，

分别命名为ＡＲＥＢｌ，ＡＲＥＢ２和ＡＲＥＢ３。营养组织中的ＡＲＥＢｌ和ＡＲＥＢ２基因的转录

水平受干旱，ＮａＣＩ和ＡＢＡ处理升调节。在利用拟南芥叶原生质体进行的瞬时反式激

活实验中，ＡＲＥＢＩ和ＡＲＥＢ２蛋白激活了由ＡＢＲＥ驱动的报告基因的转录。ＡＲＥＢｌ

和ＡＲＥＢ２在激活报告基因转录过程中需要ＡＢＡ，因为它们的转录活性在ＡＢＡ缺陷型

突变体口６以和ａｂｉｌ中降低，而在ＡＢＡ超敏感突变体ｅｒａｌ中增强。ＡＢＡ在激活ＡＲＥＢｓ

转录因子过程中受蛋白激酶抑制剂抑制，以拟南芥培养细胞为材料进行的研究发现

ＡＲＥＢ蛋白的Ｎ端保守区域受一个４２．ＫＤ的蛋白激酶磷酸化，后者特异性地受ＡＢＡ

１０

陈其军：文献综述

激活。这些结果说明ＡＲＥＢＩ和ＡＲＥＢ２在ＡＢＡ诱导ＲＤ２９Ｂ表达过程中起转录激活因

子的作用，而且ＡＲＥＢｌ和ＡＲＥＢ２转录因子的转录后激活是ＡＢＡ依赖的”。

上述工作是日本Ｓｈｉｎｚａｋｉ实验室的工作，韩国的Ｋｉｍ实验室也利用酵母单杂交系

统分离了４个结合ＡＢＲＥ的ｂｚＩＰ转录因子，命名为ＡＢＦＩ～ＡＢＦ４，这些ｂＺＩＰ转录因

子受ＡＢＡ和胁迫诱导，在酵母中能激活受ＡＢＲＥ驱动的报告基因。不同于其它结合

ＡＢＲＥ元件的ｂＺＩＰ转录因子，ＡＢＦｓ能够同时与Ｇ．ｂｏｘ类的ＡＢＲＥｓ和包含ＣＧＣＧＴＧ

序列的ＡＢＲＥｓ相互作用。其中的ＡＢＦ２和ＡＢＦ４基因就是上述的ＡＲＢＦＩ和ＡＲＢＦ２基

冈”。Ｋｉｍ实验室随后进一步对这些转录因子在植物体内的功能进行了研究。结果表明，

ＡＢＦ３和ＡＢＦ４转基因品系对ＡＢＡ非常敏感，转基因植株的种子萌发延迟，在含ＡＢＡ

的介质中转基因种子萌发及根生长受到抑制。转基因植物也表现出其它方面的与ＡＢＡ

信号转导有关的现象。例如，在含１００ｍＭＮａＣＩ的生长介质中，转基因与野生型及ＡＢＡ

敏感性突变体相比，其种子的萌发及生长受抑制。最近的研究表明，ＡＢＡ参与葡萄糖

和蔗糖的信号转导”，５３一，例如糖不敏感型突变体ｓｉｓ４与ＡＢＡ缺陷型突变体ｎ６ａＬ２在遗

传上是等位的。ＡＢＦ转基因植物在含３％葡萄糖的介质中生长发育出现严重障碍，而野

生型能够正常生长。最近的研究表明ＡＢＡ信号转导途径和乙烯的信号转导途径相互作

用。例如，ＡＢＡ介导的对种子萌发的抑制作用受乙烯负调控，ＡＢＡ对根生长的抑制作

用需要乙烯信号转导途径中的组分。有研究表明，生长素参与ＡＢＡ依赖的胁迫反应。

当对植物进行渐进性的干旱处理时，新的侧生根短而结节（ｔｕｂｅｒｉｚｅｄ）。这种早生根的

过程不仅在ａｂａｌ和ａｂａｌ．Ｊ突变体中而且在抗生长素突变体ａｘｒｌ．３中受到破坏。尽管

用乙烯前体１．氨基环丙烷．１－羧酸和吲哚－３．乙酸处理野生型和ＡＢＦ转基因植物，没有看

到生长上的不同。但ＡＢＦ４转基因植物的叶片出现偏上性弯曲的趋势。而偏上性生长

一般认为是乙烯的作用．并且，ＡＢＦ４转基因植物的根生长特性发生改变，即根生长的

接触障碍物反应（ｏｂｓｔａｃｌｅ－ｔｏｕｃｈｉｎｇ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ）受到抑制。已知上述反应涉及到生长信

号转导途径中的组分。这些结果表明，ＡＢＦ４的超表达影响了乙烯和生长素反应的一些

方面。转基因植物中ＡＢＡ及胁迫反应基因的表达发生改变，表明ＡＢＦ３和ＡＢＦ４在植

物体内作为转录调控因子发挥作用．在水分胁迫条件下，一个重要的ＡＢＡ调控过程是

气孔关闭。ＡＢＡ缺陷型突变体和敏感型突变体容易遭受干旱胁迫的原因就是因为这些

突变体对气孔的调节作用受到破坏舒挪。ＡＢＦ３和ＡＢＦ４基因在干旱条件下气孔开放程

度和蒸腾速率低于野生型，对干旱胁迫的耐受性增强。这些结果从植物体内实验证明

了的转录因子ＡＢＦ３和ＡＢＦ４参与了胁迫反应的ＡＢＡ信号转导”。

中国农业大学博士学位论文

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图１·１ＡＢＩ在ＡＢＡ信号传递中两种可能的作用模式．

（Ａ）ＡＢＩ蛋白的催化活性不受Ａ８Ａ调控．ＡＢＡＣａ＂号的感受刺激信号转导级联途径．导致生理反应

的激活．ＡＢｌｌ磷酸酶通过去磷酸／Ｉ］Ｍ，ＢＡ信号传递链中的某个蛋白组分减弱信号转导级联反应．

在回复突变体ａｂ／１－１ＲＩ（从ａｂｌｌ－ｌＲｌ到ａｂ／１—１Ｒ７）中，ＡＢｔｌ

ＰＰ２Ｃ活性丧失（圈中以Ｘ号表示）

导致ＡＢＡ反应性增强．ＡＢＡ诱导的ＡＢＩＩ

ｍＲＮＡ，水平增高启动了负反馈调节机制（图中以点线表

示）．

（Ｂ）ＡＢＡ抑制了ＡＢＩ蛋白的催化活性．ＡＢＡ或ＡＢＡ衍生的信号抑制ＡＢｌｌ的ＰＰ２Ｃ活性。从而

解除ＡＢＩ磷酸酶活性对ＡＢＡ反应通路的抑制作用，触发了生理反应．在回复突变体中，ＡＢｌｌ

的ＰＰ２Ｃ活性丧失（图中以Ｘ号衰示）导致ＡＢＡ反应性增强．ＡＢＡ诱导的舶盯ｍＲＮＡ水平

增高启动了负反馈调节机制（图中以点线表示）．

ＡＢＨ和ＡＢｌ２基因编码的蛋白是同源的，属于丝氨酸，苏氨酸蛋白磷酸酯酶的２ｃ家

族（ＰＰ２Ｃｓ）”，７１，７２３州·”。迄今只得到ＡＢｌｌ和ＡＢｌ２基因的两种突变体：ａｂｉｌ．Ｊ和ａｂｉ２一』。

这两个突变体都是显性的，突变位点发生在ＰＰ２Ｃ结构域的相应位置，都是相同的氨

１２

陈其军ｔ文献综述

基酸被取代７１，７５

ｏ这两个突变体的表型大体是重叠的：种子萌发和幼苗生长对ＡＢＡ的

反应性改变，种子的休眠时间缩短，气孔调节不正常，对干旱胁迫的反应性存在缺陷

５８，６３，７１３６，７７ｏ然而，不能仅仅根据显性突变体的功能来理解ＡＢＩＩ和ＡＢｌ２磷酸酶的功能。

首先，不能确定这些蛋白是否参与ＡＢＡ的信号传递。因为存在这种可能的情况：野生

型的ＡＢＩＩ和ＡＢｌ２不能正常地参与ＡＢＡ信号转导，只有获得功能的ＡＢｌｌ和ＡＢｌ２蛋

白突变体才能阻碍ＡＢＡ反应。其次，即使野生型的ＡＢｌｌ和ＡＢｌ２是ＡＢＡ信号转导链

中的组分，那么这些蛋白是ＡＢＡ反应的正调控因子还是负调控因子？由于突变体的显

性性质使我们不容易得出这一问题的结论。利用药理学的方法研究ＰＰ２Ｃ蛋白是否参

与ＡＢＡ信号转导并不可行，因为尚未发现这一类磷酸酶蛋白的抑制剂。为了阐明丘唧

和ＡＢｌ２基因在ＡＢＡ信号转导中的作用，需要得到隐性的失去功能的突变体，并通过

其功能分析最终搞清除这些基因的功能，筛选经ＥＭＳ诱变处理的ａｂｉｌ．』突变体的种子，

分离出７个失去了ＡＢｌｌ基因功能的隐性突变体，这７个失去功能的突变体是ａｂｉｌ．Ｊ突

变体的基网内回复突变体（ｉｎｔｒａｇｅｎｉｅ

ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）。这些基因内回复突变体对ＡＢＡ的

反应比野生型植物更敏感，并且对ＡＢＡ超敏感的表型是隐性的。所有这些回复突变体

基因编码的蛋白在体外酶活分析中检测不到磷酸酶活性。这些遗传学上的证据表明，

失去ＡＢＩＩＰＰ２Ｃ活性导致植物对ＡＢＡ的反应增强，因此，野生型ＡＢｌｌ磷酸酶是ＡＢＡ

反应的负调控因子（图１．１）７８，７９０

１．２ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递途径

如上所述，Ｏｌ国§因在胁迫条件下的诱导表达受ＡＢＡ的调控，但研究也发现一些ＯＲ

基因的表达不受ＡＢＡ的调控９。首先，一些ＯＲ基因的表达不受外源ＡＢＡ的诱导”，其次

那些受外源ＡＢＡ诱导的Ｏ噬因对渗透胁迫的反应也可能不依赖于内源ＡＢＡ。例如，尽

管ＲＤ２９Ａ基因能够被外源ＡＢＡ所诱导，但在ＡＢＡ合成缺陷突变体ａｂａｌ中渗透胁迫仍能

诱导其表达ｑ“＇。２。日本Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ研究组利用差示筛选的方法从干旱处理的模式植物拟

南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因，定名为ＲＤ（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔＯｄｅｈｙｄｔｒａｔｉｏｎ）基因。

其中，ＲＤ２９Ａ基因的表达不仅受干旱、高盐胁迫的诱导，也受低温胁迫的诱导。对其

启动子进行了分析，发现一个受干旱、高盐和低温胁迫应答有关的ＤＲＥ顺式作用元件

（序列为ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ）。此外，ＲＤ２９Ａ基因的表达也受外源ＡＢＡ诱导，但是，删去该

启动子区域中的ＡＢＡ应答元件ＡＢＲＥ，保留ＤＲＥ元件，同样也能使兄Ｄ２鲥基因在干旱、

高盐或低温胁迫条件下被快速诱导表达，说明ＲＤ２９Ａ基因在上述胁迫条件下的快速表

达不依赖于细胞内ＡＢＡ的作用。ＲＤ２９Ａ启动子中含有２个ＤＲＥＩ顿式作用元件，核心序列

中国农业大学博士学位论文

为ＣＣＧＡＣ”。Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ研究组最初在研究拟南芥冷适应过程中鉴定ｙ４个ＣＯＲ基因，

即ＣＯＲ６．６，ＣＯＲｌ５ａ，ＣＯＲ４７和ＣＯＲ７８。其中的ＣＯＲ４７和ＣＯＲ７８分别是后来日本Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

研究组利用差示筛选的方法筛选得到的ＲＤｌ７和ＲＤ２９Ａ。分析ＣＯＲｌ５ａ基因的启动子，

发现了与ＤＲＥ元件极为相似的序列－－ＴＧＧＣＣＧＡＣ，称为ＣＲＴ（Ｃ－ｒｅｐｅａｔ）元件“。在一

些同样受干旱、高盐或低温诱导的拟南芥基因如ＲＤｌ７，ＫＩＮｌ，ｃｏＲａ６基因的启动子中，

也发现有ＤＲＥ元件或ＤＲＥ核心序列的元件”一。此外，ＤＲＥ元件的核心序歹ＩＪＣＣＧＡＣ在

低温诱导的甘蓝型油菜的ＢＮＩｌ５基因启动子区域中也存在，称为ＬＴＲＥ元件”（１０ｗ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ）。Ｔｈｏｍａｓｈｏ、ｖ研究组利用酵母单杂交的方法首先首先分

离了与ＤＲＥ／ＣＲＴ元件结合的转录因子的基因，命名为ＣＢＦｌ（ＣＲＴ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒＩ）８８。

后来，该研究小组又分离了ｃ丑川的另外两个同源物ＣＢＦ２和ＣＢＦ３”。Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ研究组

几乎与Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ实验组同时分离了与ＤＲＥ／ＣＲＴ元件结合的转录因子的５个基因，命名

为ＤＲＥＢｓ（ＤＲ．Ｅ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）９０．这５个基因同样是利用酵母单杂交的方法分别从低

温处理和干早处理的拟南芥ｅＤＮＡ文库中克隆到的。从低温处理的拟南芥ｅＤＮＡ文库中

克隆了３个基因，分别命名为ＤＲＥＢＩＡ，ＤＲＥＢＩＢ，ＤＲＥＢＩＣ；从干旱处理的拟南芥ｃＤＮＡ

文库中克隆了２个基因，分别命名为ＤＲＥＢ２Ａ，ＤＲＥＢ２Ｂ。其中，ＤＲＥＢｌＡ与ＣＢＦ３，ＤＲＥＢＩＢ

与ＣＢＦＩ，ＤＲＥＢＩＣ与ＣＢＦ２是同一基因。３个基因按ＤＰ隰ＢＩＢ／ＣＢＦＩ，ＤＲＥＢＩＡ／ＣＢＦ３和￡）兄髓』ｃ／蚴的顺序在４号染色体上串连排列，氨基酸的同源性在８５％以上。ＤＲＥＢｌ

和ＤＲＥＢ２基因之间除了都具有保守的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结构域，没有明显的序列同源性。已

知ＡＰ２和ＥＲＥＢＰ结构域９啪存在于ＡＰＥＴＡＬＡ２和ＥＢＥＢＰ蛋白中，前者在花形态建成中起

作用，后者在乙烯反应中起作用。ＤＫＥＢｌ和２蛋白特异性地与ＤＲＥ／ＣＲＴ元件结合，在

酵母及拟南芥原生质体中都能激活Ｉ扫ＤＲＥ／ＣＲＴ元件驱动的报告基因的表达。ＤＲＥＢｌ基

因受低温诱导，ＤＲＥＢ２基因受干旱或高盐诱导”。这些研究表明，拟南芥中存在两个独

立的ＤＲＥＢ转录因子家族，分别参与了低温和渗透胁迫反应的信号传递途径。ＤＲＥＢＩＡ

超表达的转基因拟南芥在非胁迫条件下诱导ＲＤ２９Ａ等靶基因的强表达，植物的抗冻性

和耐旱性增强９０，”一。Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ研究组也得到类似的结果：ＣＢＦｌ／ＤＲＥＢＩＢ或

ＣＢＦ２／ＤＲＥＢｌＣ或ＣＢＦ３／ＤＲＥＢＩＡ基因超表达在非胁迫条件下诱导了ＣＯＲ基因如

ＣＯＲ６６，ＣＯＲｌ５ａ，ＣＯＲ４７／ＲＤｌ７ｔｉＯＣＯＲ７８／ＲＤ２９Ａ基因的表达，转基因植物的抗冻性提

高９６·９７，”。

以ＲＤ２９Ａ／ＣＯＲ７８／ＬＴｌ７８基因的诱导表达为例，ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的胁迫信

号传递途径可以概括为图ｌ－２”。

１４

陈其军：文献综述

Ｓｉｇｎａｌｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ

Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ

Ｔｒａｎｓｆａｃｔｏｒｓ

ＲＤ２９Ａ

ｐｒｏｍｏｔｅｒ

Ｃｉｓｅｌｅｍｅｎｔｓ

Ｌｏｗ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＤｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ罗。弋

７弋～Ａ

／弋

＼坚！！／

图１－２ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递途径”

两个顺式作用元件ＤＲＥ／ＣＲＴ和ＡＢＲＥ分别参与ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的ＲＤ２９Ａ基因的诱

导。两种不同的ＤＲＥ／ＣＲＴ结合蛋白ＤＲＥＢＩ／ＣＢＦ和ＤＲＥＢ２分别参与冷胁迫和渗透胁迫信号传递途

径．ＡＢＲＥ元件的结合蛋白为ｂＺＩＰ转录因子，如ＡＢＦ／ＡＲＢＦ．开放式箭头表示ＡＢＡ依赖的信号转

导途径；封闭式箭头表示ＡＢＡ不依赣的信号转导途径。其中．实线部分代表渗透胁迫反应途径，虚

线代表低温胁迫反应途径．

近年来。分子遗传学的研究大大丰富了胁迫信号传递途径的知识。如上所述，ＡＢＡ

合成缺陷型突变体和反应缺陷型突变体为研究ＡＢＡ参与胁迫信号传递途径提供了很

好的材料。ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递途径中也发现了一些突变体，这些突变体的发

现和研究加深了人们对ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递途径的了解（图１—３）。这些突变体

包括ｈｏｓｌ，ｈｏｓ２，ｈｏｓ５，ｓｆｒ６，

ｅｓｋｌ等。

ｅｓｋｌ即ｅｓｋｉｍｏｌ突变体是组成性抗冻的突变体。在未进行冷适应（ｃｏｌｄａｃｅｌｉｍａｔｉｚａ－

ｔｉｏｎ）的情况下，ｅｓｋｌ突变体的抗冻性强于野生型植物。ｅｓｋｌ耐受低温胁迫的分子机制

还不清楚。研究发现，ｅｓｋｌ突变体积累更多的脯氨酸…。已知脯氨酸可以在渗透保护，

活性氧的清除以及蛋白和核酸的保护方面起作用。脯氨酸脱氢酶反义ｃＤＮＡ超表达的

转基因拟南芥抗冻及耐盐性均大大增强”１。ｅｓＭ突变体中ＣＯＲｌ５ａ，ＲＤｌ７／ＣＯＲ４７，

ＲＤ２９Ａ／ＣＯＲ７８基因的表达不受影响，说明ＥＳＫＩ基因在不同于这些基因的信号传递系

］ｒｖｒｖｒｖ三一；ｖ—ｌｖ叩；ｖ—一

中国农业大学博士学位论文

统中起作用。

Ｓｉｇｎａｌ

ｐｅｍｅｐｔｍｎ

Ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

Ｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ

ｆａｃｔｏｒ

Ｃｉｓｅｌｅｍｅｎｔ

Ｇｃｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

图Ｉ－３胁迫信号转导的几个途径”

围中，以逆境胁迫诱导基因ＥＲＤＩ．ＲＤ２２，ＲＤ２９Ｂ，ＲＤ２９Ａ和ＣＯＲＩＳａ为例来说明拟南芥中

至少存在６条胁迫信号传递途径．其中２个（ｂ和ｃ）是ＡＢＡ依赖的，４个（＾，ｄ，ｃ．ｆ）是ＡＢＡ

不依赖的．口ｂａ，ａｂｉｌ／２，ｅｒａｌ，ｈｏｓ５，ｓｆｒ６，ｈｏＭ．ｈｏｓ２，ｅｓｋｌ是参与逆境胁迫信号传递的一些突

变体。实线代表渗透胁迫反应途径，虚线代表低温胁迫反应途径．封闭式箭头和开放式箭头分别

表示主要的和次要的胁迫信号转导途径．

在ｈｏｓ５突变体中，ＲＤ２９Ａ基因在渗透胁迫条件下的表达增强，但在低温胁迫条件

下的表达未受影响。因为渗透胁迫诱导ＡＢＡ的合成，对ＡＢＡ的过敏感理论上能导致

对渗透胁迫反应的过敏感。ｈｏｓ５突变体对渗透胁迫和ＡＢＡ的敏感性均增强，那么ｈｏｓ５

突变体对渗透胁迫的敏感性是否是由于对ＡＢＡ的敏感性增强造成呢？通过分析ｂｏｘ５

曲口Ｊ和ｈｏｓ５ａｂｉｌ双突变体排除了这种可能．如果ｈｏｓ５突变体对渗透胁迫的敏感性是

由于对ＡＢＡ的敏感性增强造成的，那么ＡＢＡ合成发生缺陷的ｈｏｓ５

ａｂａｌ双突变体对

渗透胁迫的反应的敏感性应该大大降低。而实际上ｈｏｓ５

ａｂａｌ双突变体对ＡＢＡ和高盐

的反应均类似于ｈｏｓ５突变体。ｈｏｓ５

ａｂｉｌ双突变体对高盐的反应也类似于ｈｏｓ５突变体。

ｈｏｓ５突变体对ＡＢＡ和渗透胁迫同时处理表现出的反应是加和性。这些研究表明，ｈｏｓ５

１６

陈其军；文献综述

突变体对渗透胁迫的敏感性不是由于对ＡＢＡ的敏感性增强造成，换句话说，是ＡＢＡ

不依赖的。因此，ＨＯＳ５在ＡＢＡ不依赖的渗透胁迫信号传递中以及在ＡＢＡ信号传递

途径的下游充当负调控因子”。

驴（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｆｒｅｅｚｉｎｇ）突变体是对冷冻敏感的拟南芥突变体。驴突变体在冷

适应后表现出对冷冻的过敏感性。这些突变体相应的基因ＳＦＲ为冷冻抗性所必需－ｏｚ。

其中的ｓｐａ突变体中冷诱导基因ＫＩＮｌ，ＣＯＲＩＳａ，上玎７们。尺怒‘碰）２鲥在冷胁迫条件

下的诱导表达几乎完全被抑制，在渗透胁迫以及ＡＢＡ处理的条件下，这些基因在ｓｐａ

突变体中的诱导表达也受到一定程度的抑制。已知这些基因的启动子区都含有

ＣＲＴ／ＤＲＥ元件。启动子缺乏ＣＲＴ／ＤＲＥ元件的冷诱导基因ＣＢＦｌ，ＣＢＦ２，ＣＢＦ３和

ＡＴＰ５ＣＳＩ在低温胁迫条件下的诱导表达未受影响。这些研究表明，ＳＦＲ６增强了ＣＢＦ

转录因子的作用”。

图Ｉ－４ＨＯＳＩ的作用模式”

ＨＯＳｌ在低温胁迫条件下负

调控许多胁迫反应基因的表达。

ＨＯＳＩ也可以在渗透胁迫条件下

正调控某些基因的表达．

ｈｏｓｌ．，突变体也表现出对低温的敏感性。但不同于上述的ｓｆｒ６突变体，在突变体

ｈｏｓｌ．Ｊ中渗透胁迫及冷胁迫反应基因，如ＲＤ２９Ａ，ＣＯＲ４７，ＣＯＲＩＳＡ，ＫＩＮｌ和ＡＤＨ，

在冷胁迫条件下表现出超诱导（ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）表达，但在渗透胁迫及ＡＢＡ处理条件

下，没有出现这种现象。ｈｏｓｌ．Ｊ突变体中的ＬＵＣ报告基因能在高达１９＂（２的条件下被诱

导，而野生型植物在高于ｌＯ℃条件下ＬＵＣ报告基因便不能表达。ｈｏｓｌ．，突变体耐寒

性比野生型差。然而，在２天的冷适应后，突变体和野生型表现出相同程度的耐冻性。

ｈｏｓｌ．，突变体还表现出早开花的特性，推测ｈｏｓｌ．』突变体可能在正常的生长温度下经

历了春化作用。这些结果表明，ＨＯＳＩ在低温胁迫信号转导途径中是一个重要的负调控

因子，在负调控低温胁迫条件下的基因表达，提高冷冻耐受性及控制开花时间等方面

发挥重要作用（图１．４）。此外，ＨＯＳｌ在渗透胁迫和ＡＢＡ处理条件下正调控ＲＡＢｌ８，

１７

中国农业大学博士学位论文

ＲＤ２９Ｂ．ＣＯＲｌ５Ａ和ＫＩＮｌ的表达”。

图ｌ－５

ＨＯＳＩ在低温胁迫信号

传递途径中的作用及对春化作

用的调控“‘

Ｈ０ｓ１负调控ＣＢＦ／ＤＲＥＢｌ

转录因子以及正调控开花抑制

基因ＦＬＣ的表达．

ＨＯＳｌ基因已被克隆，它编码的蛋白在靠近Ｎ末端有一个ＲＩＮＧ

ｆｉｎｇｅｒ结构域。利

朋ＨＯＳｌ－ＧＦＰ融合蛋白技术研究发现在正常生长条件下ＨＯＳｌ蛋白定位于细胞质，在

低温胁迫条件下ＨＯＳｌ蛋白积累于细胞核中。在野生型植物中异位表达ＨＯＳｌ基因导

致ＨＯＳＩ基因表达的共抑制，转基因植物的表现型与ｈｏｓｌ突变体的表现型相似”。一

些Ｒｉｎｇ·ｆｉｎｇｅｒ蛋白可以作为遍在蛋白Ｅ３连接酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＥ３ｌｉｇａｓｅｓ），在特异降解靶

蛋白方面发挥作用。ＨＯＳｌ可能通过将ＣＢＦ转录因子标记为降解的靶目标而起作用（图

Ｉ．５）。

在ｈｏｓ２突变体（包括ｈｏｓ２·』，ｈｏｓ２—２和ｈｏｓ２．３）中，ＲＤ２９Ａ和其它胁遮反应基因

在低温胁迫条件下的表达强于野生型，在渗透胁迫及ＡＢＡ处理条件下的表达类似于野

生型。当用非冷冻的低温处理时ｈｏｓ２．Ｊ突变体耐冻性弱于野生型。与ｈｏｓｌ突变体相比，

ｈｏｓ２一，突变体的春化反应未受影响。这些结果表明ＨＯＳ２是冷适应过程中低温信号传

递途径中的负调控因子”。

１．３交叉转导作用

近年来，从植物感受胁迫刺激到最后作出生理反应，细胞信号转导过程的研究取

得了很大的进展。随着研究的深入，人们发现的目前研究的线性的细胞信号转导过程

只不过是复杂信号传递网络的一部分，这个信号网络的许多分支之间相互交错，例如

许多基因受一种以上的刺激所诱导。任何一个线性的信号传递途径都包括特异性

（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）和交叉转导（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ）两个方面。信号传递途径的特异性是指信号传

递链中的组分能够将这些组分所在的信号传递途径与其它信号传递途径区分开来的现

象。特异的信号传递链的组分能将一个特定的刺激与特定的终端反应联系起来。交叉

８

陈其军：文献综述

转导作用是指来自不同刺激的两个信号传递途径交叉会聚的现象…。两个信号传递途

径可以通过交叉转导作用获得相同的终端反应，也可以通过交叉转导作用相互作用和

影响最终的结果，包括加和作用和负调控作用等。

图１－６ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ

不依赖的胁迫信号传递途径之

间的交叉转导作用２

各类突变体相应的基因产

物被放在信号传递途径中的推

测的位置处．ＡＢＡ依赖的和

ＡＢＡ不依赖的信号传递途径相

互作用并最后会聚到一处，激

活ＲＤ２９Ａ基因和其它ＯＲ基因

的转录．虚线表示那些本身不

足以激活ＯＲ基因转录的信号

传递途径。

ＲＤ２９Ａ，Ｋ．ＩＮＩ和ＣＯＲ４７基因既含有ＡＢＲＥ又含有ＤＲＥ／ＣＲＴ元件，在缺乏ＡＢＡ

的情况下这些基因能通过ＡＢＡ不依赖的途径受渗透胁迫诱导。在ＡＢＡ合成缺陷型突

变体Ｉｏｓ６／ａｂａｌ及ＡＢＡ不敏感型突变体ａｂｉ中确实如此４‘１０５。但ｌｏｓ５／ａｂａ３突变体却存

在不同的情况。在ｌｏｓ５突变体中渗透胁迫对ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ的诱导表达几乎完全受到抑

制。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，ＩｏｓＳｌａｂａ３突变体的ＣＯＲｌ５，ＫＩＮｌ，ＲＤ２２，ＰＳＣＳ和ＲＡＢｌ８

基因在高盐和干旱胁迫条件下的表达受到抑制，ＲＤ２９Ａ，ＣＯＲ４７和ＡＤＨ基因在这些

胁迫条件下的诱导表达受到严重影响。在盐胁迫处理的同时用ＡＢＡ处理发现，

ｌｏｓ５／ａｂａ３突变体植株中的ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ表达恢复到野生型的水平。这说明上述渗透胁

追诱导基因的反应性发生缺陷的确是由于ＡＢＡ的合成缺陷造成的。尽管不能完全排除

这种可能性：ＬＯＳ５／ＡＢＡ３不是通过ＡＢＡ的生物合成而是通过其它方式影响ＡＢＡ不依

赖的渗透胁迫信号传递途径，但至少ｌｏｓ５突变体的研究结果对ＡＢＡ不依赖的胁迫信

号传递途径是否完全不依赖于ＡＢＡ提出了疑问。尽管ｌｏｓＳ／ａｂｅｄ突变体对盐胁迫诱导

的ＤＲＥＢ２Ａ基因的表达没有影响，但ＤＲＥＢ２Ａ的活性可能受ＡＢＡ依赖的因子调控，

进而激活下游基因的表达”。以前的研究表明，ＤＲＥＢ２Ａ基因的异位表达不能激活下

１９

中国农业大学博士学位论文

游基因的表达，推测其需要转录后修饰方能激活下游胁迫诱导基因的表达”。有可能

ＤＲＥＢ２Ａ的磷酸化和去磷酸化作用或其辅因子的活性依赖于受ＡＢＡ调控的分子，例如

ＡＢＨ／２，ＣＤＰＫ或其它很多ＡＢＡ反应调控因子”。以前的一些研究也表明ＡＢＡ依赖

的和ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递途径彼此不是完全独立的，在两条信号传递途径之间

存在广泛的联系和相互作用。如前所述，朱健康实验室建立了通过ＲＤ２９Ａ．ＬＵＣ报告基

因筛选突变体的系统８。利用这套筛选系统，筛选了很多渗透胁迫基因的表达发生改变

的各类突变体，包括ｃ∞（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ）。ｌｏｓ

（１０ｗ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ）和ｈｏｓ（ｈｉｇｈ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓ）。其中，根据在各种不同的胁迫及ＡＢＡ处理条件下突变体的表型可

将ｚ∞和ｈｏｓ突变体分为１４类。这些突变体囊括了低温胁迫，盐胁迫及ＡＢＡ处理条件

的各种可能的组合。在三种处理条件下胁迫反应基因的诱导表达都受到抑制（１０ｓ。。Ｉ）

或增强（ｈｏｓｕｌ）的突变体本身就已说明在ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的胁迫信号传递

途径之间以及冷胁迫或渗透胁迫信号传递途径和ＡＢＡ信号传递途径之间存在着复杂

而微妙的相互作用（图１－６）。如前所述，Ｈｅｓｓ同时是ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的

渗透胁迫信号传递途径的负调控因子。夕），Ｊ突变体同时影响ＡＢＡ，渗透胁迫和冷胁迫

反应的信号传递通路，因此ＦＲＹｌ基因可能在ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的信号传递

途径之间充当联系纽带的作用”。总之，ＡＢＡ信号传递途径和渗透胁迫信号传递途径

相互依赖协同调控胁迫反应基因的表达８，４０。

２离子胁迫信号转导：ＳＯＳ途径及ｃ矿、钙调素和钙调磷酸酯酶途径

盐胁迫包括离子胁迫（ｉｏｎｉｃ）和渗透胁迫两个方面．离子胁迫明显不同于其它的

非生物胁迫，例如干旱和低温。植物体内存在专门对离子胁迫（例如过多的Ｎａ＋积累

和由此而产生的Ｋ＋匮乏）作出反应的信号传递途径“。土壤盐份破坏植物的离子稳态

（ｉｏｎｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ），造成细胞质中过多的毒性Ｎａ＋和过少的基本离子（如Ｃ）”７。各种

各样的离子转运器在限制Ｎａ＋离子进入细胞，促使Ｎａ＋离子流出细胞，调节Ｎａ＋离子在

液泡中的分室化作用以及选择性的导入Ｋ＋离子等方面发挥作用啪．．当遭受盐胁迫时，

植物需要激活一些离子转运器或需要增强它们的活性，另一方面需要抑制其它离子（如

Ｎａ＋内流转运器）的活性。此外，在对盐胁迫反应过程中许多转运器的转录水平升高或

降低１０７０近年来，通过遗传筛选ＳＯＳ（ｓａｌｔ

ｏｖｅｒｌｙ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）突变体，克隆ＳＯＳ基因以

及对ＳＯＳ蛋白的功能进行生化分析和鉴定。一个调控离子稳态和盐耐受性的信号传递

陈其军：文献综述

途径得到发现（图ｌ一７）”。拟南芥ＳＯＳ突变体是根据突变体幼苗的生长对ＮａＣｌ胁迫

过敏感这一现象进行遗传筛选得到的１１０，１１１。ｓｏｓｌ，ｓｏｓ２和ｓｏｓ３突变体特异性对Ｎａ＋和

Ｌｉ十离子过敏感。在没有Ｎａ＋和Ｌｉ＋离子的培养基中突变体的生长和发育类似于野生型

植物，所不同的是突变体的生长稍慢。ＳＯＳｌ基因编码质膜Ｎａ＋，Ｈ＋反向转运器”Ｊ１２。

因此可知，ＳＯＳｌ的生化和生理功能是从细胞质中移除Ｎａ＋到胞外空间或根间隙中。

ＳＯＳｌ在Ｋ＋吸收过程中的作用可能是间接的，可能通过Ｈ＋和Ｈ＋．Ｋ＋协同转运器

（ｃｏ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）的耦合来实现。ＳＯＳｌ转录本即使在没有盐胁迫的条件下也存在，其

转录水平受ＮａＣＩ胁迫升调节。与许多其它胁迫调控基因不同的是ＳＯＳｌ转录水平不受

ＡＢＡ或低温胁迫处理升调节。盐胁追导致ＳＯＳｌ转录本水平升高，其中的一部分原因

是受ＳＯＳ２和ＳＯＳ３基因控制的结果”。在ｓｏｓ２和ｓｏｓ３突变体植物中，ＮａＣＩ诱导的ＳＯＳｌ

转录本的水平大大降低。ＳＯＳ２基因编码一个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，有一个Ｎ末端

催化区和一个Ｃ末端的调控区”。在ＳＯＳ２蛋白内部催化区和调控区之间有一个相互

作用“３。这种分子内的相互作用似乎使ＳＯＳ２处于一种失活状态。删除调控区导致ＳＯＳ２

蛋白激酶组成性激活。通过将推测的环式激活结构域中的Ｔｈｒｌ６８氨基酸替换成Ａｓｐ也

能导致ＳＯＳ２蛋白激酶组成性激活。推测从Ｔｈｒｌ６８～Ａｓｐ的突变模拟了一个未知的上

游激酶的磷酸化作用过程。ＳＯＳ３基因编码一种肉豆蔻酰化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ）的ｃａ２＋结

合蛋白３３，１１４０推测ＳＯＳ３可以感受由盐胁迫引发的胞质Ｃａ２＋变化。已知盐胁迫可以触

发胞质自由态Ｃａ２＋浓度的瞬时升高．目前，尚不清楚盐胁迫触发的Ｃｄ＋信号与其它刺

激激活的ｃａ２＋信号有何不同以及ＳＯＳ３如何特异性地感受盐胁迫引发的ｃａ２＋信号。

ＳＯＳ３能够和ＳＯＳ２相互作用并激活ＳＯＳ２“５。ＳＯＳ３激活ＳＯＳ２需要ｃａ“的参与，这与

盐胁迫反应中ｃａ２＋是第二信使的结论是一致的。ＳＯＳ２和ＳＯＳ３的相互作用受ＦＩＳＬｍｏｔｉｆ

的介导。ＦＩＳＬｍｏｔｉｆ是一个具有２１个氨基酸的序列，定位于ＳＯＳ２调控区…。ＦＩＳＬｍｏｔｉｆ

也存在于拟南芥的其它２３个推测的蛋白激酶中，这些蛋白激酶的氨基酸的序列与ＳＯＳ２

类似。这些ＳＯＳ２蛋白激酶类似物（ＳＯＳ２－ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｓ，ＰＫＳｓ）似乎与某些ＳＯＳ３

钙结合蛋白类似物相互作用（ＳＯＳ３．１ｉｋｅ

ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｃａＢＰｓ）１１３

ａ因此，

某些ＰＫＳ蛋白可能与特定的ＳｅａＢＰ蛋白配对形成特殊的激酶复合物，进而在各种ｃａ２＋

信号传递途径中发挥作用。本质上，这些激酶复合物类似于非植物生命体的钙调素依

赖的蛋白激酶。这个家族的钙调激酶使本已复杂的蛋白激酶的钙调控变得更加复杂，

因为在植物体内，单就钙依赖的蛋白激酶（ｃａｌｃｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｓ，ＣＤＰＫｓ）

而言就是一个很大的家族。除了调控盐胁迫条件下的ＳＯＳＩ转录本的水平，ＳＯＳ３

２ｌ

中国农业大学博士学位论文

一ＳＯＳ２激酶复合物似乎还能在分离纯化的膜囊泡中激活Ｎａ＋／Ｗ反向转运器的活性１１２。

图１１７盐胁迫激活了几个蛋白激酶途径“。

培养基中过多的Ｎａ＋引发了细胞质的ｃａ２＋信号．ｃａ２＋信号为钙结合蛋白ＳＯＳ３所感受，ＳＯＳ

和蛋白激酶ＳＯＳ２相互作用并激活ＳＯＳ２．ＳＯＳ３－ＳＯＳ２调控包括ＳＯＳｌ（Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运器）在内

的离子转运器的转录本丰度和（或）转运活性，使胞质中维持低浓度的Ｎａ＋．盐胁迫也导致高渗

胁迫，高渗胁迫信号激活了蛋白激酶ＡＳＫＩ及多个ＭＡＰＫ途径．圈中显示其中的一条ＭＡＰＫ途径。

这条ＭＡＰＫ途径也可被许多其它信号激活．倒如，水杨酸，真曹引发子及伤害．ＳＩＰＫ，ＳＩＭＫ和

ＡＴＭＰＫ６分别是烟草、苜稽和拟南芥中的同源ＭＡＰＫｓ．ＳＩＰＫＫ和ＳＩＭＫＫ分别是和ＳＩＰＫ和Ｓ［Ｍ

相互作用的ＭＡＰＫＫｓ．问号表示渗透胁迫激活的激酶途径的靶目标尚不知道．

通过以鲫ｓ突变体为背景品系筛选抑制或增强ＳＯＳ突变体表型的遗传因子，通过筛

选与ＳＯＳ相互作用的蛋自以及通过ＳＯＳ突变体的基因表达谱分析，ＳＯＳ信号传递途径

中的其它组分和靶目标将会得到鉴定．最近，通过差异减法筛选（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ

ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。发现了几个在ｓｏｓ３突变体中高表达或低表达的基因“６。

除了ＶＥＧＥＴＡＴＩＶＥＳＴＯＲＡＧＥＰＲＯＴＥＩＮ２（ｖｓｅ２），所有这些基因在ｓｏｓｌ和￥ｏｓ３突变体

中表现出类似的盐诱导表达模式，暗示这些基因表达模式的改变可能是这些突变体对

盐的耐受性下降的结果。在ｓｏｓ２和ｓｏｓ３突变体中盐对ＶＳＰ２基因的诱导表达受到破坏，

但在ｓｏｓＩ突变体中盐对ＶＳＰ２基因的诱导不受影响。表明ＶＳＰ２的表达是ＳＯＳ３一ＳＯＳ２

激酶途径的靶目标。目前仍不清楚ＶＳＰ２是否以及如何在盐胁迫耐受性中发挥作用。

在酵母中存在一个特异的高盐胁迫信号传递途径，即钙，钙调素，钙调磷酸酶途

径“７’Ｉ”。酵母钙调磷酸酯酶的催化亚基超表达能够增强植物对ＮａＣｌ胁追的耐受性“９，

暗示植物中可能存在类似的机制参与ＮａＣＩ胁迫信号传递。在拟南芥中存在与酵母Ｃａ２＋

结合蛋白钙调磷酸酶Ｂ同源的蛋白家族，这些蛋白被命名为ＡｔＣＢＬ（Ａｔｈａｌｉａｎａ

ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ。ｌｉｋｅ

Ｃａ”．ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ）．其中的一个成员ＡｔＣＢＬｌ强烈受干旱，低温

陈其军：文献综述

和伤害诱导”ｏ。上述的ＳＯＳ３是ＡｔＣＢＬ家族的另一成员，在拟南芥盐胁迫信号传递中

起作用。此外，在拟南芥中存在一个小的ｃａ２＋结合蛋白ＡｔＣＰｌ，和钙调素具有一定的

氨基酸序列相似性，ＡｔＣＰｌ也受ＮａＣ｜胁迫诱导”１。其作用可能类似于ＳＯＳ３钙结合蛋

白与ＳＯＳ２激酶的作用”２。其它的ｃａ２＋结合蛋白也涉及ＮａＣＩ胁迫下游组分的激活。拟

南芥的ＡｔＧＳＫＩ与哺乳动物ＧＳＫ３同源，能够补救酵母钙调磷酸酶和ｍｃｋｌ突变体的盐

敏感表型。ＡｔＧＳＫｌ的表达受ＮａＣＩ或ＡＢＡ诱导”３。ＡｔＧＳＫＩ的转基因超表达拟南芥对

盐胁迫的耐受性增强，在盐胁迫条件下比野生型积累更多的Ｎａ＋和Ｃａ２＋。而且，ＡｔＧＳＫｌ

超表达诱导了盐胁迫反应基因的表达”‘。维持离子稳态的ＳＯＳ３／ＳＯＳ２／ＳＯＳｌ信号传递

途径似乎为植物所特有。尽管ＳＯＳ３与钙调磷酸酶的调控亚基的序列与有相似之处１０７

但是拟南芥基因组中看起来没有编码钙调磷酸酶催化亚基类似物的基因。可能其它类

型的蛋白磷酸酶参与了植物ＳＯＳ信号传递途径。

３参与逆境胁迫信号传递的ＭＡＰＫ级联途径

大量研究表明蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程在细胞的信号识别与转导中起重要

作用，它是生物体中普遍存在的一种调节机制，几乎涉及所有的生理和病理过程。多种

胞外刺激在胞内的传递中涉及蛋白质的磷酸化过程，包括光照、温度（冷、热）、风、雨、

触摸、盐胁迫、伤害、真菌激发子、水分胁迫和吸水等环境刺激１２５，１２６以及生长素、脱

落酸、乙烯、水杨酸（ＳＡ）、赤霉素和细胞分裂素等植物激素。蛋白质的磷酸化作用是

蛋白激酶将ＡＴＰ（其次为ＧＴＰ）Ｙ位的磷酸基团转移到底物氨基酸残基上的过程，蛋

白激酶共同点是催化区（一般含２５０～３００个氨基酸）都含１１个保守的亚区。根据其底物

蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可将它们分为５类：（１）丝氨酸／苏氨酸（Ｓｅｒｒｒｈｒ）蛋白激

酶，（２）酪氨酸（Ｔｙｒ）蛋白激酶，（３）组氨酸蛋白激酶，（４）色氨酸蛋白激酶，（５）天冬氨酰基

／谷氨酰基蛋白激酶。目前植物中发现的蛋白激酶以前３类为主。近年来，参与渗透胁

迫信号转导的许多植物蛋白激酶在分子水平上得到分离和鉴定１２７，“８。其中的一些激酶

与酵母中涉及渗透胁迫信号转导的蛋白激酶同源”９，”ｏ·…’１３２‘。

ＭＡＰＫｓ家族成员存在于所有真核生物中，在多种信号传递过程中起作用。它们是

一类丝氨酸，苏氨酸（Ｓｅｒｆｒｈｒ）蛋白激酶，Ｍｒ３８０００～５５０００，具有１１个保守的蛋白激酶亚

区。该家族成员包括分裂原激活蛋白激酶、分裂原激活蛋白激酶激酶（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＰＫＫｓ）和分裂原激活蛋白激酶激酶激酶（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ

ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＶＫＫＫｓ）３种类型。在真核细胞内，这３种类型的激酶

中国农业大学博士学位论文

构成一个ＭＡＰＫ级联系统（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｃａｓｃａｄｅ），通过ＭＡＰＫＫＫ—

ＭＡＰＫＫ—ＭＡＰＫ逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。ＭＡＰＫＫＫ位于级联

系统的上游，能够通过胁迫感受器或信号分子的受体或其本身直接感受胞外刺激而发

生磷酸化。ＭＡＰＫＫＫ磷酸化后变为活化状态，可以使ＭＡＰＫＫ磷酸化。ＭＡＰＫＫ又称

ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄ

ｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ），始终存在于细胞质中，ＭＡＰＫＫ磷酸

化后能够通过双重磷酸化作用将ＭＡＰＫ激活，磷酸化的位点是Ｔｈｒ和Ｔｙｒ残基。ＭＡＰＫ

又称ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ），被ＭＡＰＫＫ磷酸化后有３种可能的去向：（１）

停留在细胞质中，激活一系列其它蛋白激酶；（２）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化；

（３）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达。目前发现动物细胞存在至少

４条、酵母细胞至少５条不同的ＭＡＰＫ级联途径，它们在多种信号传递中起作用。

植物ＭＡＰＫ级联激酶的研究开始于９０年代初，现己发现了大量ＭＡＰＫ家族成员，

而且在植物中识别出的ＭＡＰＫ的数量比在动物和酵母中还多。不少编码ＭＡＰＫ和一

些编码ＭＡＰＫＫ与ＭＡＰＫＫＫ的基因也已从植物中分离到，它们主要来源于拟南芥、

苜蓿、豌豆和烟草等多种植物。目前在拟南芥中发现的ＭＡＰＫＫＫｓ包括ＣＴＲＩ，

ＡＴＭＥＫＫｌ，ＡＮＰｓ（ＡＮＰｌ～３），ＭＡＰＫＫ包括ＡＴＭＥＫｌ，ＭＡＰＫ包括ＡＴＭＰＫ２～７

等。植物ＭＡＰＫｓ与动物和酵母细胞的ＭＡＰＫｓ有相似的生化特点，但多数是从胞质组

分中分离到的，其Ｍｒ在４４０００～４８０００。植物ＭＡＰＫＫＫ和ＭＡＰＫ是Ｓｅｒ／Ｔｈｒ类蛋白激

酶，ＭＡＰＫＫ是Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｔｙｒ双重特异性蛋白激酶。ＭＡＰＫ的激活发生在该激酶的Ｔｙｒ

和ｎｒ两残基位点被磷酸化的情况下。同动物和酵母一样，ＭＢＰ（脊髓碱性蛋白）也是植

物ＭＡＰＫ的最适底物，使ＭＢＰ磷酸化的激酶是ＭＡＰＫ的特征之一。ＭＡＰＫ级联系统

也参与植物多种胞外信号在胞内的传递．已发现乙烯和生长素的信号转导均涉及

ＭＡＰＫ级联途径。例如，乙烯信号转导过程中的关键因子ＣＴＲＩ具有ＭＡＰＫ活性，生

长素诱导的烟草细胞分裂与ＭＡＰＫＫ的激活相关．此外，ＡＢＡ能诱导大麦糊粉层原生

质体中ＭＡＰＫ的活性，水杨酸（ｓＡ）可激活烟草中的ＭＡＰＫ。

在酵母和哺乳动物中，蛋白磷酸化是渗透胁迫信号转导的中心环节。在酵母中，

渗透调节要么始于包含ＳＨ３结构域的膜蛋白要么始于两组分的组氨酸激酶，这两种渗

透胁迫的感受器进而激活ＭＡＰＫ级联途径，促进渗透物质的合成和积累”３。在植物中，

许多蛋白激酶，包括两组分的组氨酸激酶，ＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ和ＭＡＰＫ等，受渗透

胁迫以及其它胁迫诱导。但目前仍不清楚植物是否象酵母那样利用膜感受器和ＭＡＰＫ

级联系统调控渗透物质的合成。在苜蓿细胞中，一个４６ｋＤａ的ＭＡＰＫ受高渗胁迫激

２４

陈其军；文献综述

活，命名为ＳＩＭＫ（ＳＡＬＴ－ＳＴＲＥＳＳ－ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ

ＭＡＰ

ＫＩＮＡＳＥ）”４。通过利用酵母双

杂交技术，与ＳＩＭＫ相互作用并激活Ｓ１ＭＫ的ＭＡＰＫＫ基因得到克隆”５。烟草细胞中

存在～个与ＳＩＭＫ类似的ＭＡＰＫ，命名为Ｓ１ＰＫ（ｓａｌｉｃｙｌｉｃ．ａｃｉｄ．ｉｎｄｕｃｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ）。

Ｓ１ＰＫ除受高渗胁迫激活外，也能被水杨酸或真菌激发子激活”６．”７。与ＳＩＰＫ相互作用

的ＭＡＰＫＫ也己得到克隆”５。

在拟南芥中至少有三个ＭＡＰＫｓ受盐胁迫，低温胁迫，伤害及其它环境胁迫激活”９。

以前的研究表明，拟南芥ＡＴＭＥＫＫｌ和ＡＴＭＰＫ３（编码ＭＡＰＫＫＫ激酶）在转录水平受

环境胁迫信号的诱导调控。在干旱、高盐和低温胁迫条件下，５分钟内ＡＴＭＥＫＫｌ和

ＡＴＭＰＫ３就被诱导表达，１小时内显著增加，随后表达持续增加，２４小时后达高峰。

利用酵母双杂交系统，Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ等…证明ＡＴＭＥＫＫｌ参与拟南芥植物中传递干旱、高

盐、低温和触伤胁追信号的ＭＡＰＫ级联途径，该途径可表示为：胁迫信号一一

ＡＴＭＥＫＫｌ（ＭＡＰＫＫＫ同源物）－－ＭＥＫＩ（ＭＡＰＫＫ同源物）～ＡＴＭＰＫ４（ＭＡＰＫ同源物）。

这条途径与酵母的类似。

在拟南芥中还存在一条Ｈ２０２依赖的ＭＡＰＫ级联途径，该途径可表示为：胁迫信

号一一Ｈ２０２一一ＡＮＰｌ（ＭＡＰＫＫＫ同源物）一ＭＡＰＫＫ（未知）一ＡＴＭＰＫ３和ＡＴＭＰＫ６

（ＭＡＰＫ同源物）。ＡＮＰ（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＮＰＫｌ一ｌｉｋｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ）是与烟草ＮＰＫＩ同源

的ＭＡＰＫＫＫ蛋白激酶。使用抗原决定簇标记（ｅｐｉｔｏｐｅｔａｇｇｉｎｇ）和原生质瞬间表达分

析研究表明，１－１２０２可以激活ＡＮＰｌ，ＡＮＴｌ可以导致ＡＴＭＰＫ３和ＡＴＭＰＫ６的磷酸化。

通过组成性激活ＡＮＰｌ可以摹拟Ｈ２０２产生的生理效应，诱导胁迫相关基因的表达。组

成性激活的ＮＰＫＩ转基因烟草对多种环境胁迫的耐受性得到改善…。

４其它参与逆境胁迫信号传递的蛋白激酶

除了上述的ＭＡＰＫ激酶级联途径外，与逆境信号传递关系密切的还有钙依赖而

钙调素不依赖的蛋白激酶（ｃａｌｃｉｕｍｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｅａｌｒｎｏｄｕｌｉｎｉｎ

ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，

ＣＤＰＫ）、受体蛋白激酶（ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ，ＲＰＫ）、核糖体蛋白激酶（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ）、转录调控蛋白激酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ）。

４．１受体蛋白激酶（ＲｅｃｅｐｔｏｒＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅ，ＲＰＫ）

蛋白激酶是真核细胞信号转导的重要组分，它们的共同点是催化区（一般含２ｓ０～

３００个氨基酸）都含１１个保守的亚区，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，

将蛋白激酶分成丝氨酸劣氨酸类和酩氨酸类两大类。位于细胞膜上的ＲＰＫ受体蛋白激

酶感应干旱、高盐、低温、脱落酸以及生长发育等信号，并将信号向胞内传递，引发

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一系列信号转导过程。ＲＰＫ蛋白的共同特点是由胞外配体结合区（ｅｘｔｒａｃｅＩＩｕｌａｒ

ｌｉｇａｎｄ·ｂｉｎｄｉｎｇ

ｄｏｍａｉｎ）、跨膜区（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ

ｄｏｍａｉｎ）和胞质激酶区（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃｋｉｎａｓｅ

ｄｏｍａｉｎ）３个结构域组成，通过配体结合区感受外界信号，经跨膜区传递给保质激酶区，

再由胞质激酶区通过磷酸化作用将信号传递给下一级信号传递体。近年来相继在多种

高等植物中分离出～系列受体蛋白激酶基因，它们在各种信号感受及传递中起作用。

干旱、高盐及低温诱导的受体蛋白激酶基因ＲＰＫｌ是从模式植物拟南芥中克隆到

的“２，序列分析表明，ＲＰＫＩ基因编码的氨基酸序列包含蛋白激酶中的１１个保守皿区，

属丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶类型，具备胞外配体结合区，跨膜区和胞质激酶区等全部受

体蛋白激酶的特征区。此外，ＲＰＫｌ激酶的胞外部分含有富亮氨酸重复序列（ＬＲＲ

ｌｅｕｃｉｎｅ—ｒｉｃｈ

ｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）。该序列参与蛋白质一蛋白质问的相互作用，与感受发育

和环境胁迫信号有关［ＩＩＩ。表达特性分析表明。ＲＰＫＩ在植物的根、茎、叶和花中都能

够表达。干旱或高盐（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ

ＮａＣＩ）胁迫处理条件下Ｉ小时内，ＲＰＫＩ的表达

显著增强，６小时后达到峰值并至少在此后的１８小时内保持稳定的高表达，此外，低

温处理（４℃）也能快速诱导该基因的表达。由于ＲＰＫＩ基因可被干早、高盐及低温３

种胁迫所诱导，可以认为ＲＰｋｌ激酶在干旱、高盐及低温要引起的水分胁迫的感受和信

号传递中起作用。芽殖酵母中渗透势变化的感应器是位于膜上的蛋白Ｓｌｎｌ和ＳｈｏＩ，其

中Ｓｌｎｌ由“感受器”和“反应调节器”两部分组成，接受信号后激活有ＭＡＰ激酶级

联反应参与的信号传递途径．虽然Ｓｌｎｌ是一个完整的“双组分系统”（ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ

ｓｙｓｔｅｍ）激酶，但信号转导离不开另外两个蛋白激酶Ｙ硼ｌ和Ｓｓｋｌ的参与，与ＳｉｎＩ不

同，ＲＰＫＩ激酶独立完成信号接受、转换以及对信号传递系统的激活。关于ＲＰＫＩ是引

起有ＭＡＰ激酶级联反应参与的信号传递途径，还是像Ｓｈｏｌ一样直接作用于信号传递

途径的下游传递体，尚待迸一步实验确定。ＡＢＡ处理Ｉ小时虽然引起ＲＰＫＩ表达明显

增加，但对ＡＢＡ不敏感的拟南芥突变型的研究表明，在各种胁迫条件处理条件下突变

型植株ＲＰＫＩ基因的表达与野生型相同，说明该基因的水分胁迫诱导表达不依赖于

ＡＢＡ作用，ＲＰＫｌ基因的表达特性与拟南芥ＲＤ２９Ａ基因的表达特性有些相似。

４．２核糖体蛋白激酶（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎｓｅ）基因

ＡＴＰＫ６和ＡＴＰＫｌ９是从拟南芥中分离的另一类蛋白激酶基因“３，两者的核昔酸序

列有８２．０％的同源性。基因表达特性研究表明，它们均被干旱、高盐及低温诱导、仅

在诱导的表达时间上略有差异，其区别主要表现在ＡＴＰＫｌ９被诱导和到达表达高峰的

时间较短。低温处理时间上略有差异。其区别主要表现在ＡＴＰＫｌ９被诱导和到达表达

陈其军：文献综述

高峰的时间较短。低温处理１小时，ＡＴＰＫｌ９的表达量就有明显增加，２小时达到峰值

（８．８倍），而ＡＴＰＫ６的表达量是在低温处理２小时后才有明显增加，ｌＯ小时后达到高

峰（６．８倍），然后逐渐下降，用高盐（２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ）处理时，１小时内，ＡＴＰＫｌ９

的表达量开始增加，ｌＯ小时后达到峰值（６．３倍）ＡＴＰＫ６在２小时内表达量开始增加，

１０小时后达到峰值（４．８倍），两者表达量的升高均持续２４小时。此外，施加２，４．Ｄ亦

叫引起ＡＴＰＫｌ９表达量少量增加，但该基因不被ＡＢＡ诱导，而ＡＴＰＫ６却可同时被２，４．Ｄ

和ＡＢＡ所诱导。

ＡＴＰＫ６和ＡＴＰＫｌ９所编码的氨基酸序列与动物核糖体蛋白ｓ６激酶Ｐ７０“和ＰＰ９０“

的同源性很高。目前尚未发现Ｐ７０妣的直接上游激活物质，但Ｐ７０“ｋ在动物中能通过

磷酸化４０Ｓ核糖体蛋白ｓ６而激活蛋白质的合成，因此ＡＴＰＫ６和ＡＴＰＫ１９可能通过增

加某些特定蛋白的合成使植物对外界胁迫作出反应。研究表明，ＭＡＰ激酶所催化的磷

酸化能够激活ＰＰ９０“，且ＡＴＰＫｌ９的表达方式与编码ＭＡＰ激酶的ＡＴＭＰＫ３和ＡＴＭＥＫＫｌ

存在相似之处，如：（１）在干旱、高盐或低温诱导下，３种基因的表达在５分钟内即开始

增加：（２）它们都不被外源ＡＢＡ诱导，可以认为ＡＴＰＫｌ９可能在由渗透胁追引起的不依

赖ＡＢＡ的信号传递中起作用，从目前的研究进展分析，ＡＴＰＫ６和ＡＴＰＫｌ９在信号传导

途径中位于ＭＡＰＫ的下游，在干旱、高盐或低温诱导下激活核糖体蛋白ｓ６，增加细胞

内与这些胁迫耐性相关的蛋白质的合成，或作为细胞在逆境胁迫下的应激反应，促进

所有蛋白质的合成。

４．３转录调控蛋白激酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎＡｓｅ基因

转录调控蛋白激酶基因是最近从拟南芥果实中分离鉴定出的一种新的蛋白激酶

基因”４，序列分析表明，它编码的氨基酸序列与酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＢＦ２

基因编码的氨基酸序列具有很高的同源性，且该基因能补偿酵母ｄｂｐ突变体的功能缺

陷，因此定名为Ａｔ－ＤＢＦ２。拟南芥Ａｔ－ＤＢＦ２激酶亦属丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类，同样

包含有１１个蛋白激酶的保守亚区。高盐、低温及脱水均能很快诱导Ａｔ－ＤＢＦ２基因的表

达，但该基因不受过氧化物诱导。转化实验也显示同样的结果，Ａｔ－ＤＢＦ２超表达的酵

母ＤＹ株系的抗高盐、低温及脱水能力均比对照有所提高，但抗氧化能力却无明显变

化，分别将Ａｔ－ＤＢＦ２及其反义ＲＮＡ转入烟草ＢＹ２细胞系，使它们在烟草细胞中过量

表达，经高盐、干旱、低温或高温处理２周后发现，稳定表达Ａｔ－ＤＢＦ２基因的烟草细

胞系抗胁迫能力明显强于转入反义ＲＮＡ的细胞系。

Ａｔ－ＤＢＦ２激酶在拟南芥信号传递中的功能目前尚不了解。Ａｔ－ＤＢＦ２的同源酵母

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ＤＢＦ２蛋白激酶是酵母ＣＣＲ４转录复合物的重要组分。该转录复合物参与酵母生长、细

胞周期、染色体正常结构维持、氨基酸合成等多种生命活动相关基因的表达，同时还

影响一系列转录因子如：ＴＦＩＩＢ，ＲＰＢＩ，ＳＲＢ２，ＳＲＢ４等的活性，另一方面，ＤＢＦ２和

ＣＣＲ４转录复合物中唯一的蛋白激酶，假可能是其活性的限制因子。目前还没有发现

Ａｔ－ＤＢＦ２激酶的直接激活物质或它的作用底物，而且ＣＣＲ４转录复合体在真核生物中

较为保守，因此Ａｔ－ＤＢＦ的作用可能与ＤＢＦ２激酶相类似。位于信号传递的下游，作为

拟南芥中转录复合物的重要组分在转录水平上调节多种基因的表达，使细胞产生相应

的生理生化调节，基因组杂交显示ＤＢＦ２基因在烟草，番茄等植物中存在且相对保守。

ＤＢＦ２基因可能与ＭＡＰ激酶基因一样，普遍存在于各种真核生物中。

４．４钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（ｃＤＰＫ）

胞质游离钙离子是植物细胞信号转导中最基本的第二信使，它几乎介导植物生长

发育的所有反应。细胞内钙的分布是严格区隔化的，其中胞质游离钙离子浓度最低，

而且保持钙的恒稳态是细胞正常生长发育的前提。只有当细胞感受到刺激信号时，胞

质游离钙离子浓度才会发生短暂而复杂的变化，产生第二信使，将刺激信号以独特的

方式传递下去。钙信号的进一步传递，是经钙离子的受体蛋白、ＣａＭ、钙依赖蛋白激

酶和钙调控的磷酸酶等完成的。动物中钙依赖蛋白激酶为Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖的蛋白激酶

ＣａＭＫ和ｃａ２Ｖ磷脂依赖的蛋白激酶ＰＫＣ。植物中Ｃａ２＋ＩＣｍＭ依赖的蛋白激酶已有报道，

传统意义上的ＰＫＣ在植物中的存在也有报道，但植物中还存在着一种独特的钙依赖蛋

白激酶—钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（ＣＤＰＫ）或类似钙调素结构域的蛋白激酶

（ｅａｌｍｏｄｕｌｉｎｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）．它是目前植物中研究较多、了解较为清楚的一类蛋白

激酶，广泛分布于植物、藻类和一些原生动物中，但高等动物中没有。在植物中，从

根到茎、叶，包括果实、种子，都可检测到ＣＤＰＫ的存在。ＣＤＰＫ在细胞内的亚细胞

定位也几乎涉及了所有的细胞器，包括质膜、共生膜、微粒体膜、细胞骨架、胞质、

细胞核和叶绿体、线粒体等。ＣＤＰＫ在结构上具有明显的特征．分析ＣＤＰＫ的氨基酸

序列，它具有３个功能区，从Ｎ端起依次为催化区、连接区和调控区。催化区由２００

多个氨基酸残基组成，具有典型的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶催化保守序列；连接区由２０～３０

个氨基酸组成，在各类功能区中最为保守，富含碱性氨基酸，紧靠催化区而以拟底物

的方式与催化区结合起自抑制作用，所以该区又称自抑制区；调控区是ＣＤＰＫ有别于

其它激酶类型的特有区域，有一段结构和功能类似于ＣａＭ的氨基酸序列组成，区内共

有４个与ｃａ２＋结合的ＥＦ手型结构，这是ＣＤＰＫ对ｃａ２＋高度亲和而不依赖于ＣａＭ的原

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因。调控区的氨基酸序列保守性最差，不同的ＣＤＰＫ在钙结合区的结构上有差异。ｃａ２＋

与ＣＤＰＫ的调控区结合后，ＣＤＰＫ被活化。活化机制有两种，一种是结合后诱导了调

控区与连接区的结合，从而解除了连接区与催化部位的结合，也就解除了自抑制作用，

这是一种与Ｃａ２＋／ＣａＭ依赖的蛋白激酶相似的作用方式；另一种作用机制是使ＣＤＰＫ的

ＣａＭ类似区发生了构象变化，这一变化直接将连接区“挤出”或“拖出”了自抑制位

点，而解除了自抑制作用。植物可能同时利用上述两种机制介导着不同的ｃａ２＋信号。

另外，从拟南芥中克隆出的８种ＣＤＰＫ，在催化区前端都带有一段长短不一的序列，

称为可变区，８种ＣＤＰＫ在此段很少有同源关系，目前还未弄清这段序列对ＣＤＰＫ作

用的生理意义。据推测，编码ＣＤＰＫ的基因是由原有的２个基因融合而成的，一个是

编码Ｃａ２ＶＣａＭ蛋白激酶催化区和自抑制区的基因，一个是编码ＣａＭ的基因。ＣＤＰＫ

可以像ＣａＭ一样受ＣａＭ的拮抗剂如ｗ７、氯丙嗪、三氟拉嗪、Ｃａｌｍｉｄｚｏｌｉｎ等抑制。但

ＣａＭ拮抗剂抑制ＣＤＰＫ的浓度要比抑制ＣａＭ依赖酶的浓度大，如Ｗ７抑制纯化的ＣＤＰＫ

的半抑制浓度（ＩＣ５０）为１

１０｝Ｌｍｏｌ／Ｌ，抑制不纯的ＣＤＰＫ的Ｉｃ５０为４００

ｐｍｏｌ／Ｌ，而抑

制ＣａＭ依赖酶的Ｉｃ∞在５０

ｐｍｏｌ／Ｌ左右。ＣＤＰＫ与Ｃａ２＋结合后，可将其琉水基团暴露

出来，而以钙依赖的方式与疏水介质如苯琼脂糖（ｐｈｅｎｙｌ

ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）结合。此外，一

些脂类和碱性多肽也会影响ＣＤＰＫ的活性，碱性多肽抑制ＣＤＰＫ的活性，而一些脂类

如磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱则激活ＣＤＰＫ。ＣＤＰＫ的自抑制区（也即连接区）极

富碱性，碱性多肽的抑制作用可能类似于自抑制区的作用；而带负电荷的脂类可能中

和了ＣＤＰＫ的带正电荷的碱性抑制，从而激活了ＣＤＰＫ活性，而且脂类的激活作用小

于钙的激活效应。经纯化的ＣＤＰＫ为单体酶，Ｍｒ在４００００～９００００。Ｍ矿是激酶的重

要辅助因子，在体外检测ＣＤＰＫ活性时，要求反应介质中有５～１０ｍｍｏｌ／ＬＭ矿＋存在。

纯化的ＣＤＰＫ

ｍｍｏｌ／Ｌ级Ｍ９２＋存在的情况下，受Ｉｌｍｏｌ／Ｌ级ｃａ２＋的激活，２肛ｍｏｌ／Ｌ就可

使酶活达最高值的一半，受ｃａ２＋激活的程度在５０～１００倍。有时所测得的ＣＤＰＫ活性

对ｃａ２＋的敏感性不高，可能是酶的纯度不高或纯化时发生部分水解而丧失了调控区造

成的。Ｃａ２＋激活ＣＤＰＫ是与其直接结合起作用的，ＣＤＰＫ活性达到最高时原则上只受

ｃａ２＋的激活而不需要ＣａＭ或磷脂和ＤＡＧ的作用。组蛋白ＩＩＩ－Ｓ是绝大部分ＣＤＰＫ的最

适外源底物，由于它被ＣＤＰＫ磷酸化的作用受生理浓度范围内的ＫＣＩ的抑制，所以推

测它可能不是ＣＤＰＫ的体内底物。此外，不同来源的ＣＤＰＫ对组蛋白ＩＩＩ．Ｓ的亲和力不

同，如大豆和水稻中ＣＤＰＫ对其亲和力强，而杜氏盐藻的亲和力则要差些。

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Ｃｏ．１ｄ

Ｓａｌｔ／ＤｒｏｕｇｈｔＣ＋ａ：Ｏａ。ｓ删ＣＤＰＫ７基＞一ａｎ砌㈣矗“／…。

ｙＸ

ＯｓＣＯＰＫ７

（Ａｃｔｉｖｅ）喜

●

●

Ｃｏｌｄ－Ｔｏｌｅｒｍ∞ｅ

Ｓａｌｔ／Ｄｒｏｕｇｈｔ．

（ＡＢＡ４ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ？）Ｔｏｌｅｒａｎｃｉ

图Ｉ－８

ＯｓＣＤＰＫ７调控低温及商盐或干旱胁迫信号转导的模式”２

虽然ＣＤＰＫ普遍存在，生物特性研究也比较多，然而人们对它在植物信号转导中

的生理功能却了解甚少。近年来的研究表明，ＣＤＰＫ与植物的胁迫反应有密切关系。

水稻中一个编码ＣＤＰＫ的基因ＯｓＣＤＰＫ７的表达受低温和盐胁迫诱导。ＯｓＣＤＰＫ７超表

达的转基因水稻对低温、高盐和干旱胁迫的抗性增强。ＯｓＣＤＰＫ７超表达的转基因水稻

在盐和干旱胁迫条件下也增强了一些胁迫诱导基因的表达，但在低温胁迫下则不能增

强这些胁迫诱导基因的表达。这提示，导致高盐和干旱耐性的下游信号传递途径不同

于导致低温耐性的下游信号传递途径，而ＯｓＣＤＰＫ是两条信号传递途径的交叉点（图

１．８）１３２０利用报告基因和效应基因共表达的方法，发现玉米原生质体ＣＤＰＫｌ和ＣＤＰＫｌａ

能激活可被干旱和高盐胁迫诱导的启动子，去除ＣＤＰＫｌ激酶区的突变体对胁迫和ＡＢＡ

刺激没有反应“５。Ｐｅｓｔｅｎａａｃｚ等“６发现玉米和高粱根中的ＣＤＰＫ经ＰＥＧ处理】小时后，

活性明显升高。Ｕｒａｏ等“７从拟南芥中分离了编码ＣＤＰＫ的２个ｅＤＮＡ克隆（ｃＡＴＣＤＰＫｌ

和ｃＡＴＣＤＰＫ２；Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明在干旱和高盐胁迫下，这两个基因的ｍＲＮＡ被

迅速诱导。ＣＤＰＫ体内底物的识别是了解其生物功能的重要线索，迄今推测的ＣＤＰＫ

底物主要有：一是结瘤素（ｎｏｄｕｌｅ）２６，它是一种跨膜运输蛋白，是通道蛋白的同系物，

町能在代谢物跨越豆科根瘤共生膜运输时起作用；二是质膜质子泵（旷ＡＴＰａｓｅ），由

它产生对细胞生长所必需的ｐＨ梯度和电势梯度，ＣＤＰＫ对其产生的磷酸化可能发生在

Ｃ末端区域，也可能不在ｃ末端，并不排除多种调节机制存在的可能性；三是细胞骨

甲甲

陈其军：文献综述

架，这是植物细胞中发现的ＣＤＰＫ的最有意义的功能。免疫细胞化学研究证明，ＣＤＰＫ

在花粉管和节间细胞中与肌动蛋白微纤丝定位在一起，这两种细胞中钙依赖的肌动肌

球蛋白与器官或囊泡的定位移动有关；玉米花粉萌发和花粉管的伸长需要花粉特异的

ＣＤＰＫ参与；ＣＤＰＫ还参与了植物细胞肌动张力的调节。这些研究表明ＣＤＰＫ与胞质

环流、器官运动关系密切。另外，还发现叶片硝酸还原酶、磷脂酰肌醇．４．激酶、氯离

子通道、钾离子内向通道（ＫＡＴｌ）、水孔蛋白以及逆境诱导的启动子ＨＶＡｌ等也可能

是ＣＤＰＫ作用的底物。而钾离子和氯离子通道、水孔蛋白以及质子泵，在逆境胁迫尤

其是盐胁迫反应中起重要作用。

５参与逆境胁迫信号传递的磷酸肌醇信号级联途径

在植物对胁迫的适应性反应过程中也涉及磷酸肌醇信号途径。当用ＡＢＡ处理时，

向，Ｊ突变体比野生型积累更多的１，４，５．三磷酸肌醇（ｉｎｏｓｉｔｏｌ

１，４，５－ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｉ＾）。

ＦＲＹｌ编码多磷酸肌醇１一磷酸酯酶，在口３的代谢中起作用。这些结果第一次从遗传学

上证明磷酸肌醇介导植物ＡＢＡ和胁迫信号转导，磷酸肌醇的代谢更新对于关闭或减弱

ＡＢＡ和胁追信号是至关重要的３７。在植物对渗透胁迫反应过程中也存在着ＡＢＡ不依

赖的的磷酸肌醇信号途径。以拟南芥细胞培养物为材料研究发现，高渗胁迫诱导ＩＰ３

快速而瞬间地升高，该过程不依赖于ＡＢＡ。ＩＰ３的瞬间提高是由于磷酸肌醇特异的磷

脂酶ｃ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｓｐｖｃｉｆｌｅｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ

ＣｔＰＩ·ＰＬＣ）的激活。该酶催化磷脂酰

肌醇－４，５．二磷酸水解产生ＩＰ３和ＤＡＧ（二酯酰甘油）两个第二信使，在动物中分别介

导细胞内Ｃａ２＋释放和激活蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）。ＰＩ－ＰＬＣ抑制剂抑制由

高渗胁迫造成的ＩＰ３的升高。一些受脱水诱导表达的基因。例如ｒｄ２９Ａ（１ｔｉ７８／ｃｏｒ７８）和

ｒｄｌ７（ｃｏｒ４７）在高渗胁迫条件下的诱导表达受ＰＩ－ＰＬＣ抑制剂的抑制，但一些受ＡＢＡ诱

导表达的基因，、例如ｒｄ２０在胁迫条件下的诱导表达不受ＰＩ．ＰＬＣ抑制剂的抑制“８。编

码ＰＩ．ＰＬＣ的拟南芥基因本身也受干旱和盐胁迫诱导“９。盐和高渗胁迫也诱导拟南芥细

胞中的磷脂酰肌醇－４，５－二磷酸。ＤＡＧ焦磷酸盐，卵磷脂的快速升高”ｏ。磷脂酰肌醇４．

磷酸５．激酶可以磷酸化磷脂酰肌醇４．磷酸产生磷脂酰肌醇－４，５一二磷酸，磷脂酰肌醇

－４，５．二磷酸不仅是ＩＰ３和ＤＡＧ两个第二信使的前体，其自身在信号转导和细胞骨架组

装中还可作为许多胞内蛋白的调节剂。拟南芥存在两个编码磷脂酰肌醇＿４．磷酸５．激酶

的基因，其中一个基因ＡｔＰＩＰＳＫｌ受干旱，盐和ＡＢＡ快速诱导”‘。在盐胁迫的拟南芥

中磷脂酰肌醇－４。５．二磷酸和ＩＰ３的快速积累与钙动员有关”２。所有这些研究表明，植物

中磷酸肌醇信号传导途径与植物的胁迫反应密切相关。

中国农业大学博士学位论文

尽管有关胁迫信号转导途径的研究近年来取得了很大的进展，但要搞清楚胁迫信

弓转导的复杂网络仍需要进行大量的工作１０４．１５３

ｏ与胁迫相关的许多新基因和功能未知

的基冈有待发现，他们在胁迫信号传递链中的作用也有待研究。功能基因组时代的来

临为阐明胁迫信号转导的复杂网络带来了新的希望和机遇。

Ｉ寻找新基因

大规模的表达分析

突变体筛选卜特翠一因（ｃＤＮＡ微阵列厦基因芯片）

（Ｔ－ＤＮＡ及转座于随机插入突变，

酵母定卡突变’

Ｉ

ｌＩ

Ｉｒ…瓣Ｉｒ叶

，

◆

基因竟隆和测序

ＩＶ

◆

（图位克隆和插入标签克隆）

Ｉ

ｆＩ。酵母要茹纂纛台，·功能分析＋

◆（酵母互补．拙南莽基西敲除，超

原位表达衰选．正义，反义抑制）

遗传学研究

（等位性伽和作用：上位性／抑制

（转录／翻译：ＧＦＰ融合基因；共作用）

表达ｔ启动子选择）

●一◆

ｌ

ｌＩ

ｌ

ｌＶＶ◆

ｌ复合墼转基因ｔ体

ｆ（模式柱物．作糖】

图Ｉ－９功能基因组研究的策略”３

６植物逆境胁迫耐受性功能基因组的研究

造成缺水胁迫的环境因子，如干旱、高盐和极端的温度是限制植物生产力的主要

因子。为了应付日渐膨胀的人口，需要培育出更多耐受胁迫的作物以克服这些限制，

提高生产效率比起传统的育种技术和用标记物辅助进行筛选的方法，通过基因工程的

方法直接导入少数基因似乎是提高植物耐受性的更具吸引力的捷径”３．９４。但是由于逆境

胁迫响应在遗传上和生理上的复杂性使得人们对逆境胁迫的耐受机制如逆境信息传

递、代谢途径、分室化作用等认识还远远不够，限制了基因工程技术的应用。这就需

要在全基因组水平上对各类胁迫耐受机制进行整合性研究。植物逆境胁迫耐受性的功

能基因组学研究策略可概括为：利用胁迫特异性的ＥＳＴＪ；及ｃＤＮＡ微阵列（或基因芯片）

技术筛选与胁迫相关的候选基因，然后，利用正向和反向遗传学（如基因敲除）等技

术对候选基因进行功能研究，利用正向遗传学和酵母双杂交等技术对基因间相互关系

陈其军：文献综述

及基因产物间的相互作用进行研究。通过这些研究就可以全面地了解胁迫（渗透、干

旱、极端温度）耐受机制的复杂性和相互作用，以及相应的信号转导途径，从而为更

加合理地、高效地利用基因工程方法培育抗逆植物奠定基础（图１－９）。

６．１利用表达序列标签寻找胁迫相关基因

表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｔａｇｓ，ＥＳＴ）就是用一个基因（ｅＤＮＡ）的５，或

３’部分序列代表该基因（ｃＤＮＡ），换句话说，就是用一个基因的５’或３’部分序列作为

该基因的标签。ＥＳＴ技术为寻找新基因和未知基因提供了一个高效的工具。利用ＥＳＴ

技术克隆基因的步骤大体上是：①构建ｅＤＮＡ文库；②随机挑选ｅＤＮＡ克隆：⑧每个克

隆从５’或３’进行一次测序；④与同种和异种生物已知的核酸和蛋白数据库进行比较分

析；⑤在基因库（ＧｅｎＢａｎｋ）中登记新基因及未知基因。

甜土植物的胁迫相关基因。为了对非生物胁迫响应的复杂机制进行全面的、整合

性的研究，首要的任务是通过对随机选择的ｅＤＮＡ克隆进行大规模的部分测序寻找各

类胁迫响应相关的ＥＳＴ。目前，拟南芥和水稻的大规模的ＥＳＴ数据库已经建立，各种

作物（包括棉花，玉米，大豆，土豆和高梁等）的大规模测序工作也已在进行之中（ｈｔｔｐ：／／

ｗｗｗ．ｎｓｆ．ｇｏｖ／ｌｆｉｏ／ｐｕｂｓ／ａｗａｒｄｓ／ｇｅｎｏｍｅ

９９．ｈｔｍ）。公共ＥＳＴ数据库在快速增长，序列标签

数目可在ＧｅｎＢａｎｋ的ｄｂＥＳＴ部分找到（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳＴ／ｄｂＥＳＴ

性的ｅＤＮＡ文库进行了大规模的ＥＳＴ测序。有关ｅＤＮＡ文库公布在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．

ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｂｏｈｎｅｒｔ／ｆｕｎｅｔｇｅｎｏｍｉｃｓ／丹ｏｎｔ２．ｈｔｍｌ网站上，最新的ＥＳＴ数据库可在胁迫功

能基因组协会（ＳｔｒｅｓｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）的网站（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｅｓｓ

ｇｅｎｏｍｉｅｓ．

ｏｒｇ）在线浏览和搜索。作为玉米基因组研究的一部分，来自盐胁迫玉米根和茎ｅＤＮＡ

的ＥＳＴ库也正在建立之中（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｍｄｂ．ｉａｓｔａｔｏ．ｅＡｕ／ｚａｎｄｂ／ＥＳＴｐ删ｅｃｔ．ｈｔｍｌ）。

胁迫耐受性模式植物的胁迫相关性基因。胁迫耐受性模式植物包括盐生植物（如

冰草）、耐干燥植物（如更苏植物）等。尽管在甜土植物中功能性适应盐胁迫的机制可

能在很大程度上是保守的，但盐生生物在进化中已额外形成了结构上或调控上的不同

机制以抵制严重的渗透胁迫或离子胁迫。为了搞清楚这些潜在的机制，以盐生植物冰

草和盐生绿藻为材料进行的大规模ＥＳＴ测序工作已经展开。分别取相等数目的来自盐

胁迫和非盐胁迫叶片组织的ＥＳＴ（各约１２００个）进行抽样比较发现，受胁迫植物比未

受胁迫植物多表达约１５％未知功能的基因。这个结果说明，当前的非冗余性的ＧｅｎＢａｎｋ

数据库中登录的ＥＳＴ序列不足以代表所有与胁迫相关的ＥＳＴ，换句话说就是，有待于

中国农业大学博士学位论文

进一步寻找与胁迫相关的ＥＳＴ序列。在上述相对较小的冰革ＥＳＴ库中只有１３％的非

冗余的ＥＳＴｓ同时在受胁迫植物和未受胁迫植物中表达，表明伴随着胁迫处理，基因表

达模式发生了剧烈的变化”４。

一些苔藓植物（如土生墙藓”５）和维管植物（如更苏植物，包括鳞叶卷柏”６，玄

参科的Ｃｒａｔｅｒｏｓｔｉｇｍａ

ｐｌａｎｔａｇｉｎｅｕｍ”７和禾本科鼠尾粟属植物Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ

ｓｔａｐｆｉａｎｕｓ”８

等），它们的营养组织逐渐形成了对干燥胁迫的耐受性，推测它们可能拥有利于耐受干

燥的特异的基因或调控过程。土生培藓的配子体在缓慢的干燥过程中，营养细胞中形

成了较大（＞１５０

ｋＤ）的核蛋白颗粒（ＲＮＰ），这有利于在水份恢复后快速地恢复蛋白

合成，从而有利于干燥组织的复活４。不同于苔藓植物，当鳞叶卷柏，Ｃｒａｔｅｒｏｓｔｉｇｍａ

ｐｌａｎｔａｇｉｎｅｕｍ和Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓｓｔａｐｆｉａｎｕｓ被ＡＢＡ和（或）干旱诱导时通过积累渗透保护物

质（如蔗糖，棉子糖或海藻糖）在干燥前建立细胞的保护系统。用干燥的土生墙藓的

多聚核蛋白颗粒（ＲＮＰ）构建ｅＤＮＡ文库，从中取出１５２个ＥＳＴ样品进行测序发现，

约７０％的ＥＳＴ代表新的基因序列１５９０一种模式苔藓植物展叶剑叶藓的ＥＳＴ库也已开始

建立。

６．２利用基因芯片技术高通量地分析胁迫特异基因的表达

在拟南芥中，约半数根据氨基酸序列信息推测为编码蛋白的基因，其精确功能仍

不祥。在缺乏其它信息的情况下，差异表达模式通常能提供基因表达的线索。对个别

ＥＳＴ标签出现的频率进行分析可以发现相应基因的差异表达称为“数字化的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ”

方法。快速定量分析一个特殊群体的大量转录本出现频率的方法—基因表达的系列分

析（Ｓｅｒｉａｌ

ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ）技术已经得到应用…。

尽管用上述方法可以获得部分基因的差异表达模式，但要得到全面的基因表达谱

信息，上述方法远远不够。基因芯片技术的出现为获知全面的基因表达谱信息带来了

光明的前景。基因芯片（ｇｅｎｅｅｈｉｐ）又称ＤＮＡ芯片或ＤＮＡ微阵列（ＤＮＡｍｉｅｒｏａｒｒａｙ）。基

因芯片的制备有两种方式，一种方式为化学合成的方法（光蚀刻技术与固相化学相结

合），合成ＤＮＡ寡聚片段（２０～２５

ｂｏ）并固化于硅芯片表面，形成致密、有序的ＤＮＡ

分子点阵，这种方式制备的基因芯片称为寡聚ＤＮＡ微阵列。又由于该技术将ＤＮＡ分

子合成于硅芯片的表面，因而又被特称为ＤＮＡ芯片；另一方式则采用自动化快速打印，

将纯化的ＤＮＡ样品打印至常规纤维素膜或玻片的表面，形成致密ＤＮＡ微集阵列，这

种方式制备的基因芯片称为ＤＮＡ微阵列。目前，后一种ＤＮＡ芯片应用较成熟。

拟南芥基因组已全部完成序列测定，在大约２５，０００个拟南芥基因中３０％以上的基

陈其军：文献综述

因与已知功能或可以推测功能的基因没有同源性，成千上万的基因只能被鉴定为某一

大类（如蛋白激酶、转录因子）的成员，而无法获知其特异的功能。ｃＤＮＡ微阵列技

术为了解与胁迫响应相关的基因的功能和调控机制，提供了一种高通量的方法”－。它

可以在一个实验中提供成千上万个基因的表达模式的信息，这些信息除能够对未鉴定

基因的功能提供线索外，还可以对已经描述的基因提供新的认识。在冰草、水稻和拟

南芥中利用ｅＤＮＡ微阵列大规模地分析盐胁迫相关基因表达谱已在进行中。

利用各种发育时期（从种子发芽到成熟）的，经不同处理（例如经干旱、冷胁迫

处理及未经胁迫处理）的拟南芥构建ｅＤＮＡ文库，从中得到１３００个全长的ｅＤＮＡ并制

作成微阵列。用经胁迫（干旱、冷）处理和未经胁迫处理的拟南芥的ＲＮＡ，以及用野

生型及ＤＲＥＢｌＡ／ＣＢＦ３转基因拟南芥的ＲＮＡ与这种微阵列杂交，结果微阵列中的１３００

种ｅＤＮＡ中有４４种受干旱诱导，１９种受冷诱导，其中的３０种和ｌＯ种是未报道过的

新的胁迫诱导基因。１２种胁迫诱导的基因被鉴定为受ＤＲＥＢＩＡ调控的靶基因，其中的

６种是未报道过的新基因，其中的１１种基因的基因组序列已在ＧｅｎｅＢａｎｋ中登记，它

们的启动子区域含有ＤＲＥＢ／ＣＢＦ类转录因子特异性结合并作用的顺式作用元件即ＤＲＥ

元件或ＤＫＢ相关的ＣＣＧＡＣ核心序列…。

用经盐胁迫处理的一种耐盐水稻的根构建ｅＤＮＡ文库，从中得到１７２８个ｅＤＮＡ制

作成微阵列。微阵列研究表明在盐胁迫１５分钟后该耐盐水稻品系的转录本表现出升调

节，约有ｌＯ％的转录本在盐胁迫ｌ小时内显著受到升调节或降调节。随着植株对盐胁

迫的适应，对照和盐胁迫水稻转录本的差异在持续数小时后变小，一周后盐胁迫植株

中受到升调节的转录本恢复到对照水平。与耐盐水稻品系相比，盐敏感水稻在受到盐

胁迫时转录本受到的升调节明显滞后，随后转录本受到降调节，植株死”３。

目前，至少有两个公众资助的项目提供世界范围的微阵列服务：美国的ＡＦＧＣ项

目和英国的ＧＡＲＮｅｔ’ｓ项目．前者已于２０００年投入服务，后者计划于２００１年上半年投

入服务。ＡＦＧＣ项目由拟南芥功能基因组协会（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ

Ｇｅｎｏｍｉｃｓ

Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＡＦＧＣ）承担，该项Ｉｆｌ正在完成不同组织（包括根、叶、角果、花和茎），

不同的发育阶段（从种子萌发到种子成熟），不同的基因型的基因表达谱分析。该项目

的对外服务接受来自世界各地的研究者的ＲＮＡ样品完成微阵列分析（包括标记、杂交

和数据收集）。ＡＦＧＣ得到的全部实验数据存放于斯坦福微阵列数据库（Ｓｔａｎｆｏｒｄ

ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＤａｔａｂａｓｅ，ＳＭＤ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ－ｗｗｗ４．Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ．ＥＤＵ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ＳＭＤ／）中，

研究者可以利用该数据库搜索基因表达情况…。ＡＦＧＣ承担的任务是利用Ｔ－ＤＮＡ或转

中国农业大学博士学位论文

座子插入突变技术（基因敲除）进行功能研究。

基因芯片技术在植物逆境胁迫耐受性研究中的应用可大致归纳为以下几个方面：

①不同的组织在不同的发育阶段对不同环境胁迫因子响应的敏感性不同。通过详细研

究基因表达谱，我们可以理解植物如何在不同的发育阶段和分类复杂的组织中整合胁

迫响应。②利用微阵列技术可以在一种或更多种甜土的（如拟南芥和水稻），盐生的（如

冰草）和耐干燥的（如一些更苏植物）模式植物间进行比较，可以鉴定到表达谱的相

同和不同之处，以及与胁迫（如高盐、干旱及极端温度）耐受性有关的特异基因。③

通过检测突变体和野生型在胁迫条件下转录本的不同，微阵列技术为鉴定胁追耐受性

的决定性基因提供了一种快速而全面的技术。④通过对蓝细菌、真菌和植物基因组进

行比较，可以找到能够解释细胞耐受机制的一群基因。

然而，单凭表达模式，对于获知植物受胁迫诱导的未知基因的功能还远远不够，

未知基因的功能尚需利用正向和反向遗传学的方法进行研究。

６．３利用正向和反向遗传学进行功能研究

随着植物基因组计划的实施和完成，新的、更多的基因组数据库和ＥＳＴ数据库得

以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。为

此，利用正向和反向遗传学的手段对所有与胁迫有关的候选基因进行功能研究。正向

遗传学的策略是从功能（表型）一突变体一基因，最后得到具有相关功能（如对盐敏

感或耐盐）的基因；反向遗传学的策略是从基因一（突变体）一功能，最后得到未知

基因的功能。经典分子遗传学利用正向遗传学的方法（即通过筛选突变体进而克隆相

关基因）研究参与胁迫响应过程中的信号转导级联反应及代谢变化的基因。例如，随

着拟南芥盐敏感性突变体（Ｓａｌｔ

ＯｖｅｒｌｙＳｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｏｓ）的筛选，发现了几个在胁迫耐受

中起关键作用的新基因”。相反地，通过筛选拟南芥耐冻突变体…和耐盐突变体”５分

别发现了参与脯氨酸合成和降解的调控基因及参与解除活性氧毒害作用的调控基因。

尽管利用生物信息学的方法和技术能够推测未知基因的功能，但最终的答案还是

要来自对突变体进行的生物学鉴定“。相应地，对于胁迫耐受性的基因组研究而言，

为了补充从基因筛选（ＥＳＴ技术）和表达谱分析（基因芯片技术）中获得的信息，需

要系统化地突变所有胁迫相关的基因。拟南芥和水稻大规模的Ｔ－ＤＮＡ或转座子突变体

库的建立和筛选可为胁迫相关基因的功能研究提供基本资源。可以使用正向遗传学和

反向遗传学的方法从大规模的Ｔ－ＤＮＡ或转座子突变体库分离耐受胁迫或对胁迫敏感

的敲除突变体。反向遗传学筛选突变体的原理是：当随机插入的Ｔ－ＤＮＡ或转座子突变

陈其军：文献综述

体品系达到足够数量时，理论上，任何目的基因（致死基因除外）都有可能在其中的

某个品系发生插入突变（即被敲除掉），用ＰＣＲ的方法即可检测出目的基因发生突变

的品系。为了用ＰＣＲ的方法检测发生突变的品系，需要将各种突变体品系按照一定的

规则或阵列混合成由小到大的亚库、库及超级席，分别根据目的基因和Ｔ．ＤＮＡ或转座

子序列设计引物，先后以各种库（按由大到小的顺序）的混合ＤＮＡ为模板进行扩增，

根据扩增结果可将目的基因发生突变的品系定位于某一个超级库、库及亚库内，最后

从亚库中找出相应的敲除突变体。现在，各国的研究人员可以利用国际上的突变体库

筛选敲除目的基因的突变体，而不必亲自建立突变体库。前面提到过ＡＦＧＣ除承担利

用微阵列技术研究基因表达谱外，还承担利用基因敲除突变技术进行功能研究。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学生物技术中心敲除植物的服务机构（ＫｎｏｃｋｏｕｔＰｌａｎｔＦａｃｉｌｉｔｙ）即隶属于

ＡＦＧＣ。除了现有的突变体库，他们计划在将来用包含转座子的Ｔ－ＤＮＡ产生突变体品

系，这样的突变体品系（Ｔ．ＤＮＡ插入突变）由于转座子（位于Ｔ—ＤＮＡ内）的转座可

以使邻近的基因发生转座子插入突变从而可以创建双突变体。该机构计划利用热不对

称交错ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ

ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ

ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲ）技术鉴定所有突变体品系的Ｔ．ＤＮＡ

或转座子两侧的序列并建立数据库，将来研究人员只需根据目的基因的序列检索数据

库，根据检索结果索要敲除目的基因的突变体”７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｗｉｓｃ．Ｅｄｕ

／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。

就研究逆境胁迫耐受性相关基因功能而言，有另一套突变体库可以利用。以转基

因拟南芥为材料。产生激活性的Ｔ－ＤＮＡ（ｂｉａｌａｐｈｏｓ抗性标记物和４Ｘ３５Ｓ增强子）标记

的突变体库用于分离影响胁迫信号转导的突变位点。转基因拟南芥的外源基因为嵌合

基因，是将对渗透势、冷、胁迫和ＡＢＡ起反应的启动子（如ＲＤ２９Ａ）与萤火虫的荧

光素酶基因（三ｕｅ）的编码区融合‘。荧光素酶的活性可以用来快速鉴定启动子活性，

而启动子活性在突变体中可能增强、减弱或不再被胁迫激活，可据此用正向遗传学的

方法筛选相应的突变体并克隆相应的基因。到目前为止，以ＲＤ２９Ａ－ＬＵＣ转基因植物为

材料建立了约９０，０００个Ｔ－ＤＮＡ标记品系，胁迫信号转导或对胁迫的敏感性发生改变

的突变体己经分离出来。标记群体的ＤＮＡ库的构建工作正在进行中，将来可以通过

Ｏｈｉｏ州立大学的拟南芥库存中心获得用于反向遗传学的研究中。

反向遗传学还包括基因的互补实验、超表达实验及利用反义技术进行的抑制实验

等。可通过定点敲除和随机插入在单细胞的模式生物（如集胞藻属植物ＰＣＣ６８０３，酵

母和构巢曲霉）中产生胁迫敏感性的突变体，用这些突变体与拟南芥、水稻、烟草和

３７

中国农业大学博士学位论文

冰草的表达文库进行互补实验，可分离相关基因在植物中的定向进化同源基因”８

（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）。可通过在野生型中转入目的基因或通过在盐敏感突变体中转入目的基因

的反义序列来评估盐胁追耐受性的决定因子。最后，可以构建目的基因与ＧＦＰ融合表

达载体，观察个体基因的时空表达模式和基因产物的亚细胞定位。

７改善植物逆境胁迫耐受性的基因工程

表１改善植物逆境胁迫耐受性基因工程的策略”３

目标

例子

可能的作用模式

渗透保护物质

氨基酸（脯氨酸等）；二甲基锍复合物

渗透保护：蛋：ｔ／膜保护；活

（甜菜碱，ＤＭｓＰ）；多羟基化台物（甘性ＯＨ蒲除。

露醇，山梨醇等）；糖类（蔗糖，海藻

糖，果聚糖）

活性氧清除剂

酶类（过氧化氢酶，Ｆｃ／Ｍｎ超氧化物岐化

活性氧清除．

酶．抗坏血酸过氧化物酶，谷胱甘肽循

环酶，谷耽甘肽Ｓ．转移酶，谷胱甘肽

过氧化物酶，Ｙ－谷氨酰半胱氨酸合成

酶．交替氧化酶１；非酶类（抗坏血酸。

黄酮，类胡萝ｈ素。花青素）

胁迫蛋白

胚胎晚期丰富蛋白ＬＥＡ

机理不祥，可能参与调节蛋白

膜稳定性，束缚水分．充当

分子伴侣及隔离离子．

热击、冷击和盐击蛋白位于几个亚细胞组分的各类热击、冷击逆转或阻止蛋白的去折叠过

和盐击蛋白

程；翻译调节

离子／质子转运器高亲和性Ｋ＋转运嚣；低亲和性Ｋ＋通道；

Ｋ＋／Ｎａ＋吸收和转运；质子梯度

质膜，液泡前体，液泡和细胞器以及离

的建立；毒性离子的去除和隔子转运嚣（ＩＩ仲Ｂ∞．Ｎａ＋／Ｈ＋反向

离．

转运嚣１

膜流动性

腊肪酸去饱和酶

增强膜流动性；提高抗冻性．

水分状况水通道蛋白（溶质促进荆：尿素，甘油，差异调节质膜和液泡膜上的

Ｃ０２．其它可能的物质例如离子），ｃ吼ＡＱＰ数量；调节膜定位：调节

浓度气孔运动．

信号组分

组氨酸激酶（ＡｔＲＲＩ／２）的同源物；ＭＡＰ启动Ｃａ２＋感受器或磷酸化介

激酶０＇ｓＭＡＰＫ，ＨＯＧ）；Ｃ８抖．依赖的导的信号转导，对环境胁迫作

蛋白激酶ｌＳＮＦＩ激酶：蛋白磷酸酶出必要的反应．

（ＡＢＩＩ／２）；ＣＮＡ／Ｂ信号系统；Ｃａ２＋

感受嚣（ＳＯＳ３）；肌醇激酶

转录调控转录因子ｌ

ＥＲＥＢＰ／ＡＰ２（ＤＲＥＢ。ＣＢＦ）Ｉ

升调节或转录激活胁迫相关

ｂＺＩＰ（ＡＲＥＢ／ＡＢＦ）；锌月耵下（Ａｌｆｉｎ”；基因．

Ｍｙｂ（ＡｒＭｙｂ２，ＣｐＭｖｂｌＯ）

生长调节物质改变ＡＢＡ，细胞骨架和，或油菜素内固改变激素的稳态平衡．对环境

醇的生物合成途径或结合水平胁迫作出必要的反应．

造成缺水胁迫的环境因子，如干旱、高盐和极端的温度是限制植物生产力的主要

因子。为了应付日渐膨胀的人口，需要培育出更多耐受胁追的作物以克服这些限制，

提高生产效率。由于胁迫耐受性状的复杂性，在胁迫条件下产量的遗传方差较低，缺

乏有效的选择技术使传统的育种方法受到局限。而且，由于在不同的发育阶段与胁迫

３８

陈其军：文献综述

耐受性连锁的数量性状位点（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ，ＱＴＬｓ）可能不同，有利的ＱＴＬｓ位

点一黾得到鉴定，就需要进行大规模的育种来恢复与耐受性状连锁的有利的性状。随

着主要农作物的遗传图谱和物理图谱的分辨率逐步提高，用标记物辅助筛选间接与产

量相关的特异的二级性状（如花药和花丝间的间距，渗透调节，膜稳定性或生理耐受

性指标）将会越来越有用。

比起传统的育种技术和用标记物辅助进行筛选的方法，通过基因工程的方法直接

导入少数基因似乎是提高植物耐受性的更具吸引力的捷径。目前的遗传工程策略依赖

于将一个或几个生化途径中的基因或信号转导途径的终点基因连上组成性表达的启动

予进行转化。这些基因产物直接或间接的保护植物免受环境胁迫。例如，渗透保护物

质的生物合成酶、活性氧的清除剂”、胁迫诱导的蛋白４，１７０（如冷调节蛋白ＣＯＲ、后

期胚发生丰富蛋白ＬＥＡ）、离子运输载体（如Ｎａ＋／Ｈ＋反向运输载体”‘）等。用基因工

程的方法导入胁迫特异性的转录因子已用于提高植物对盐、干旱和低温的耐受性

９６，９０，１７２，９４。同样地，胁迫信号转导途径中的组分（如组成性表达的酵母钙调磷酸酶）已

用于生化途径的基因工程“９，这些组分通过提高离子内环境稳定态而作用于盐耐受胁

迫反应的多个靶子。但是由于缺乏对代谢途径、分室化作用及功能的全面了解，上述

方法仍然存在很大的局限性。随着功能基因组研究的进展，这些基因转化的局限性会

得到克服，人类会更加合理地利用遗传工程的方法操纵和优化胁迫耐受性状以改善作

物的生产力。

８总结与展望

正在进行中的基因组测序和基因组规模的ＥＳＴ测序以及ｃＤＮＡ微阵列分析有望快

速地分离和鉴定与渗透势、干旱、温度胁迫相关的所有的候选基因。然后，大型的数

据库经过整合及在不同的细胞模型和各类植物模型（甜土的、盐生的和旱生的）中进

行比较可以发现进化上保守的细胞耐受机制。通过对大型数据库中的资料进行分析、

比较、归纳，结合微阵列分析，利用Ｔ－ＤＮＡ或转座子标记的突变体库、互补实验和超

表达实验所进行的功能分析及遗传学分析，就可以找到特异的信号组分与下游的效应

基因之间的级联关系。利用酵母双杂交技术构建蛋白质连锁图谱可以了解蛋白与蛋白

间的特异性的相互作用。利用蛋白质组的方法可以搞清楚蛋白质的结构信息，估测与

胁追耐受性有关的蛋白质修饰作用和蛋白质与配基的相互作用。最后，随着参与胁迫

适应性或耐受性反应的所有基因的功能得到鉴定，人们就可以综合地理解植物对胁迫

响应的生理和生化基础。利用这些来自模式生物的信息，用遗传工程的方法合理地操

中国农业大学博士学位论文

纵和优化胁迫耐受性状以改善作物的生产力将成为可能。

９本课题的研究意义及技术路线

尽管有关胁迫信号转导途径的研究近年来取得了很大的进展，但要搞清楚胁迫信

号转导的复杂网络仍需要进行大量的工作。与胁迫相关的许多新基因和功能未知的基

因有待发现，他们在胁迫信号传递链中的作用也有待研究。诸如基因芯片等功能基因

组学研究手段为研究胁迫信号传递链提供了大规模、高通量的方法，但功能基因组学

的研究手段也有一个不断发展和完善的过程。功能基因组学的研究与传统的分子生物

学和遗传学研究相互补充，相互促进，相互深化。在本研究中我们利用传统的分子生

物学手段－－ｍＲＮＡ差异显示的方法，以期发现与盐胁迫相关的新基因或功能未知的基

因。我们首次报告两个编码１，３，４．三磷酸肌醇５／６．激酶类似物的拟南芥基因以ＡＢＡ依

赖的和（或）ＡＢＡ不依赖的方式参与了渗透和低温胁迫反应。

研究思路和技术路线如下：利用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选与盐胁迫相关的新基

因或功能未知的基因：分析ｍＲＨＡ差异显示技术筛选到的目的基因在其它胁迫条件下

的表达情况；在大肠杆菌或酵母中表达目的基因的融合蛋白，纯化融合蛋白，进行活

性分析，同时制备抗体；创建目的基因超表达的转基因烟草和转基因拟南芥，在生理

水平上对转基因植物的胁迫耐受性进行分析以及在分子水平上分析目的基因超表达后

对其它胁迫诱导基因表达的影响；在基因组水平上对拟南芥基因组中所有的与目的基

因同源的基因进行表达分析，必要时进行更深入的分析和研究。最后，根据我们的研

究结果，结合前人的研究结果提出目的基因在胁迫信号转导链中的作用模式图。

陈其军：材料与方法

第二章材料与方法

ｌ实验材料

１．１宿主菌

大肠杆菌Ｎ１５

ａ．Ｊｌ＊１１０９，ＪＭｌ０９一Ｉ）Ｅ３以及根癌农杆菌ＧＶ３１０１及ＬＢＡ４４０４来自农业

生物技术国家重点实验室以及植物生理生化国家重点实验室。

１．２质粒载体

克隆载体：ｐＧＥＭ—Ｔ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ｓＫ质粒来自清华大学植物分子生物学

实验室。表达载体：原核表达载体ｐＥＴ一３０ａ（＋）及真核表达载体ｐＢｌｌ２１来自植物生

理生化国家重点实验室。

１．３各种酶及试剂

实验中所使用的各种限制性内切酶、ＲＮａｓｅ

Ａ、Ｔａｑ

ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、蛋白酶Ｋ等

购自Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔａｋａｒａ、华美、鼎国、原平皓等生物工程公司；氨苄青霉素（Ａｍｐ）、

羧苄青霉素（ｃｂ）、卡那霉素（Ｋａｎ）、链霉素（ｓｍ）、硫酸庆大霉素（Ｇｅｎ）、利福

平（Ｒｉｆ）等抗生素以及ＩＰＴＧ、Ｘ－ｇａｌ、植物激素６－ＢＡ、ＮＡＡ等购自Ｓｉｇｍａ公司；

放射性同位素ｎ一”Ｐ－ｄＣＴＰ购自亚辉生物工程公司；尼龙膜、硝酸纤维素膜购自

Ａｍｅｒｓｈａｍ公司。

１．４植物材料

实验中使用的烟草品系为Ｋ３２６，使用的拟南芥为Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型。

２常用培养基和溶液的配制

２．１培养基配制

ＬＢ培养基（１升）：蛋白胨ｌｏｇ，酵母提取物５９，ＮａＣｌｌｏｇ，ｐｎ７．０（固体培养基

每升加１５９琼脂粉），高压灭菌。

ＹＥＢ培养基（１升）：酵母提取物ｌｇ，牛肉膏５９，蛋白胨５９，蔗糖５９，ＭｇＳ０４．７ｔ１：０

０．５９，ｐＨ７．０（固体培养基每升加１５９琼脂粉），高压灭菌。

Ｍｓ培养基（１升）：ＭＳ大量元素、微量元素、有机物，３０ｇ蔗糖，８

ｇ琼脂，ｐＨ５。８。

烟草分化培养基：Ｍｓ培养基＋３ｍｇ／Ｌ

６－ＢＡ＋Ｏ．２ｍｇ／Ｌ

ＮＡＡ，ｐｉｔ５．８。

烟草诱导生根培养基：Ｍｓ培养基

２．２溶液的配制

朗储备液（１０ｍｇ／ｍ１）：ｌｇ

ＥＢ溶于ｌＯＯｍｌ水中，４＂Ｃ避光保存。

４

中国农业大学博士学位论文

ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍ１）：称取０．１９ＲＮａｓｅＡ溶于１０ｍｌ１０诚Ｔｒｉｓ·ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５ｍＭＮａＣｌ

中，１００＂Ｃ煮沸１５ｍｉｎ，冰浴冷却，－２０＂Ｃ保存备用。

氨苄青霉素（Ａｍｐ）贮液（１００ｍｇ／ｍ１）：１００ｍｇＡｍｐ溶于ｌｍｌ

０．４ＭＮａＯＨ中，～２０＂Ｃ保存。

ＴＥ：含１０ｍＭＴｒｉＳ·ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｒａｍＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），高压灭菌。

５×ＴＢＥ：Ｔｒｉｓ５４９，硼酸２７．５９，０．５Ｍ

ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍｌ，加水定容至１升。

１０×ＴＡＥ：Ｔｒｉｓ４８．４９，冰醋酸１１．４２ｍｉ，０．５Ｍ

ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍ１．加水定容至１

升。

６×ＤＮＡ

ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：０．２５％溴酚蓝，４０％甘油水溶液，４＂Ｃ保存。

３实验所需试剂配制

３．１质粒ＤＮＡ的提取：

溶液Ｉ：５０ｍＭＴｒｉｓ·ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ｌＯｍＭ

ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），高压灭菌。

溶液ＩＩ：０．２ＭＮａＯＨ，Ｉ％ＳＤＳ，现用现配，贮备液０．４Ｍ

ＮａＯＨ和２％ＳＤＳ分开配制。

溶液ＩＩＩ：１．３２Ｍ醋酸钾（ｐＢ４．８），高压灭菌。

３．２基因组ＤＮＡ提取缓冲液：

５０ｍＭＴｒｉＳ·ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１００ｎ】１４

ＮａＣｌ，５０ｍＭ

ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ，１０ｍＭＢ一巯基乙

醇（可加也可不加）。

３．３Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交：

２０ｘＳＳＣ：称取１７５．３

ｇ

ＮａＣｌ，８８．２ｇ柠檬酸三钠，调ｐＨ至７．０，定容至１升后高

压灭菌。

Ｃｈｕｒｃｈ缓冲液：含１％ＢＳＡ，ｌｍＭＥＤＴＡ，０．２５ＭＮａ２ＨＰＯ＋－ＮａＨ２Ｐ０４（ｐＨ７．２）

１０ｘＭＯＰＳ电泳Ｂｕｆｆｅｒ：称取２０．６

ｇＭＯＰＳ，３．４ｇＮｏＡｃ·３１１２０，用Ｎａ０Ｈ调ｐＨ至７．０

后，加入１０ｍｌ０．５

ＭＥＤＴＡ，定容至５００ｍｌ，高压灭菌。

ＩＯｘＲＮＡ

Ｌｏａｄｉｎｇ

Ｂｕｆｆｅｒ：５０％甘油，１ｍＭＥＤＴＡ，０．２５％溴酚蓝。

４实验方法

４．１ｍＲＮＡ差异显示

①材料处理种子在７０％乙醇和１％次氯酸钠中分别浸泡２分钟和ｌＯ分钟，用灭

菌的重蒸水漂洗５次×２分钟，播种于ＭＳ培养基中。２２＂Ｃ、２４小时光照培养，

光强为３０．４０ｕｔｏｏｌ·ｍ－２．ｓ～。２～３周后将幼苗从平板上移入含２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的

水溶液以及蒸馏水中，处理３小时。收获整株植物，液氮速冻，－７０＂Ｃ冰箱中保

存，直至用于ｍＲＮＡ差异显示。

陈其军：材料与方法

②总ＲＮＡ提取分别取２００

ｍｇ经ＮａＣＩ处理和未经ＮａＣＩ处理的拟南芥材料提

取总ＲＮＡ。总ＲＮＡ的提取按Ｇｉｂｉｃｏｌ的ＴＲｌｚｏｌ

Ｒｅａｇｅｎｔ的产品说明书进行。

③ｍＲＮＡ的反转录２个ＲＮＡ样品（ＮａＣＩ处理与对照）用３种锚定引物（Ｔ１１Ａ、

Ｔ１１Ｃ和ＴｌＩＧ）共建立６个反转录体系。每个反应体系如下：

上依

５ｘＲＴＢｕｆｉｅｒ

５．０

ｐｌ

５０

Ｕ／ｌｄ

ＲＮａｓｉｎ

０．５

ｐｌ

１ｍｍｏｌ／ｌｄＮＴＰｓ５．０Ⅲ

２００Ｕ／ＩＭ—ＭＬＶＲＴ

１．０

ｐｌ

Ｔｏｔａｌ

２５．０“１

混匀，离心，将管内液体收集至管底，在ＧｅｎｅＡｍｐ９７００

ＰＣＲ仪中，进行如下反

应：３７℃６０ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ。反应完成后取出２

ｐ，Ｉ用于ＰＣＲ扩增。

＠ＰＣＲ扩增６个反转录ｅＤＮＡ样品分别用６个随机引物（ＡＰｌ；ＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡ；

ＡＰ２：ＧＴＴＧＣＧＡＴｃｃ；ＡＰ３：ＣＴＧＣＡＴＣＧＴＧ；ＡＰ４：ＴＣＡＣＣＡＧＣｃＡ；ＡＰ５：ＧＡＴＧＣＧＡＴＧＧ；ＡＰ６：

ＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧ）进行扩增，共有３６个ＰＣＲ反应体系。每个反应体系的组成如下：

１０ｘｐＣＲｂｕ仃ｅｒ

ｄＮＴＰｓ００ｍｍｏｌ／１）

ＡＰｐｒｉｍｅｒ（１０ｔｕｎｏｌ／１）

ＴｌｉＭ（１０ｌｕｎｏｌ／Ｉ）

ＰｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲＴ

５

Ｕ／ＩｘｌＴａｑ

ｄｄＨ２０

２．５Ｉｔｌ

０．５

ｐ，ｌ

１．０Ｉｘｌ

１．０

ｐ，Ｉ

１．０Ｉｘｌ

０．５ｕｌ

１９．５Ｉｘｌ

Ｔｂｔａ

２５．０

ｎＩ

扩增反应在ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲ仪进行，循环程序如下：９４＂Ｃ，３０ｓ；４０＂Ｃ，２ｍｉｎ

中国农业大学博士学位论文

７２℃，３０ｓ，４０

ｃｙｃｌｅ：７２℃，５ｍｉｎ·

⑤６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测序凝胶的制备根据Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８８），胶凝

后，先６０Ｗ功率预电泳约４０ｍｉｎ。使凝胶均匀产热，上样前用缓冲液冲洗每个

上样孔。上样时将３．５山ＰＣＲ反应产物与２

ｐ，ｌ加样染料（９８％甲酰胺，１００

Ｉｔｍｏｌｌｌ

ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．１％－－－－甲苯青和溴酚兰）混匀，并于８０℃孵育２

ｒａｉｎ，冰上冷

却后加样。以６０Ｗ功率恒定电泳约３．５

ｈｒ，待二甲苯染料迁移至凝胶下缘时停止

电泳。

⑥染色采用银染法。将胶板置于固定液中（１０％７．酸）２０

ｍｉｎ，双蒸水冲洗３

×２ｍｉｎ，染色液（ＡｇＮ０３ｌｇ，Ｌ：

３７％甲醛１．５

ｍｌ／Ｌ）染色３０

ｍｉｎ，双蒸水冲洗

２０ｓ，置于预冷的显色液（Ｎａ２Ｃ０３３０ｇ／Ｌ，３７％甲醛１．５ｍｌ

ＩＬ：Ｎａ２Ｓ２０３·５Ｈ２０

２

ｍｇ／Ｌ）２～５ｍｉｎ，至影像出现，１０％７．酸固定５ｒａｉｎ，双蒸水漂洗２次。

⑦差异显示ｅＤＮＡ片段的回收与再扩增将染色后的胶板置于灯箱上观察，直接

从胶上切取差异片段，浸于５０¨ｌ重蒸水中，封闭离心管盖煮沸２０ｍｉｎ，离心收

集冷凝液。上清可直接作为模板用于ＰＣＲ再扩增。再扩增时反应体积为５０ｕ１，

模板量２¨ｌ，其它条件与第一次ＰＣＲ相同。

⑧差异显示片段的反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交每个差异条带再扩增样品分别在１．４％琼脂

糖凝胶中重复上两个样（２０山），电泳完毕后，转到尼龙膜。探针标记同第一链ｃＤＮＡ

合成，只是将ｄＣＴＰ替换成一２Ｐ的ｄＣＴＰ。体系如下：Ｅｐ管中加入总ＲＮＡ样品（２．０

ｐｇ，山）２ｐ．１，ＯｌｉｇｏｄＴ引物（Ｔｌｓ）（１．Ｏｐｇ，ｍ）１．０ｌａｌ，ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／ｐ１）１．０ｒｔｌ，

ｄｄＨ２０

２６ｐ，Ｉ，混匀后先于７０＇１２水浴１０ｍｉｎ，使ＲＮＡ变性，然后冰浴５ｍｉｎ，１００００

ｒｐｍ离心１０

ｓ，将管内液体收集至管底，再在冰上加入以下物质：５ｘＲＴｂｕｆｆｅｒ１０

山，ＤＴＴ（１００ｍｍｏｌ／１）５

ｐ，ｌ，ｄＮＴＰｓ（Ａ，Ｔ，Ｇ各１０ｍｍｏｌ／１）ｌ｝ｄ，ａ－”Ｐ－ｄＣＴＰ３

ｕＩ，混匀，４２＂Ｃ放置２ｍｉｎ，最后加入ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｌＩ反转录酶ｌｒｔｌ，４２＂Ｃ水浴５０ｍｉｎ，

进行反转录，反应完毕后，探针经热变性后用于杂交。预杂交和杂交方法见

Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ或Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ。

４．２ＨＡ差异显示片段的克隆

①从琼脂糖凝胶中回收纯化ＤＮＡ使用北京博大公司的玻璃奶法ＤＮＡ回收纯化试剂

盒或者北京鼎国公司的离心柱法ＤＮＡ回收纯化试剂盒均可取得满意的结果。有关方

法在相关产品的说明书及试剂目录中均有说明。

②目的ＤＮＡ片段与Ｔ＿载体的连接反应克隆载体使用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的ｐＧＥＭ－Ｔ载体，

４４

陈其军：材料与方法

将回收纯化的ＤＮＡ与Ｔ一载体进行连接反应。方法见相关试剂盒的说明书。随后，将

连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。

③大肠杆菌感受态细胞的制备挑取大肠杆菌单菌落，接种于ＬＢ液体培养基中，

３７＂Ｃ培养过夜；取５００“ｌ菌液加到５０ｍｌＬＢ液体培养基中，３７。Ｃ振荡培养２～３ｈｒ，

至ｏＤ一为０．３～０．５；冰浴２０～３０ｍｉｎ，４，０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心３ｍｉｎ收集菌体，用

预冷的ｉ０～２０ｍｌ８０ｍＭＣａＣｌ２悬浮：冰浴２０～３０

ｍｉｎ，４，０００ｒｐｍ，４＂Ｃ离心３ｍｉｎ

收集菌体，仍用预冷的２ｍｌ８０

ｍＭＣａＣＩｚ悬浮，置于冰浴中备用（１２～２４

ｈｒ内

转化效率最高），或者加入１５％～２０％甘油，２００ｍｌ每份分装，－７０。Ｃ保存备用。

④连接产物转化大肠杆菌感受态细胞取２００ｍｌ大肠杆菌感受态细胞，加入ｌＯ～

２０ｎｇ质粒或１０“ｌ连接反应产物，混匀，冰浴３０ｍｉｎ；４２＂Ｃ热激９０ｓｅｃ，冰浴２ｍｉｎ：

加入８００ｍｌＬＢ液体培养基，３７℃恢复培养ｌｈｒ后，菌液与Ｘ－Ｇａｌ和ＩＰＴＧ混匀涂

于含Ａｍｐ抗生素的平板，３７＂Ｃ培养ｌＯ～１６ｈｒ后观察结果。

⑤阳性克隆的筛选与鉴定挑取白色菌斑，摇菌，提取质粒，阳性质粒经ＰＣＲ及

酶切鉴定后，送交公司测序。

⑥质粒的提取碱裂解法少量提取质粒ＤＮＡ：（ａ）将单茵落接种于３ｍｌ含相应抗生素

的ＬＢ培养基中，３７℃摇菌过夜。（ｂ）１２，０００ｒｐｍ离·Ｌ，３０ｓｅｃ，集菌。（ｃ）２Ｕ２００ｍ

溶液Ｉ（含ＲＮａｓｅ＾１００

ｐｇｌｍｌ），振荡悬浮菌体。（ｄ）自ｆ１２００

ＩＬｌ新配制的溶液ＩＩ，颠

倒混匀。（ｅ）溶液澄清后立即加入预冷的２００１１１溶液ＩＩＩ，混匀后冰上放置５～１０

ｍｉｎ。（ｆ）４＂Ｃ、１２，０００ｒｐｍ离·ｂ１５ｍｉｎ，取上消，加Ｏ．７倍异丙醇混匀。（ｇ）１２，０００

ｒｐｍ离，ｂｌＯｍｉｎ，７０％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或ＴＥ，一２０℃保存备用。

４．３３个基因编码区的ＲＴ－ＰＣＲ扩增及克隆

①材料处理材料为ＮａＣＩ处理的拟南芥２周龄幼苗。处理方法同４．３①。

②总ＲＮＡ提取同４．３②。

③ｍＲＭＡ的反转录反转录体系除以Ｔ１８锚定引物代替ＴＩＩＭ锚定引物外，其

它同③。反应条件为：４２℃，６０ｒａｉｎ，９５℃，５ｒａｉｎ。

谨）ＰＣＲ扩增扩增３个基因的ＣＤＳ用到的３对ＰＣＲ引物分别为：＾Ⅳ丁Ｌ７ａ基因

的正向引物设计为（加框的部分为人为引入的ＢａｍＨＩ或ＳａｃＩ酶切位点）：

５’－ｃａｋｇａｔｃｄａｔｇａａｇｃｔａａｃｇｇａｃａａｃｇａａｇａｇａ一３’

Ａｔ／厂￡，茸

５’一ａｃｃ｝ｇａｇｃｔＱｔｔｔａａａｏｏａｏａｔｇｔｔｔｇｔｇａｔａｇｔｃｔａｔｔｇｃ一３’

５’一ｃａｋｇａｔｃｃ｜ａｔｇｔｃａｇａｔｔｃａａｔｃｃａｇｇａａａｇ一３’

ＡｔＩＴＫ

５’－ａｏｏｋａｇｏｒｏｔｃａｇａｏａｔｇａｔｔｃｔｔｃｔｔａｇｔｇ一３’

中国农业大学博士学位论文

５’一ａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａａｇｇｔｇａａｇａｇｃａｇｇ－３’

ＡｆＩＴＬ２

５’一ｔｔａｔａｔｔｔｇａｃｃｔｇｃｇｃｃａｇａ七ｔｔｔｇｇａａｇ一３’

以反转录的ｃＤＮＡ为模板建立如下的ＰＣＲ反应体系：

１ＯｘＰＣＲｂｕｆｆｅｒ

２．５

１１１

ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／１）０．５

１１１

Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（１０ｌｉｍｏｌ／１）１．０

Ｊ１１

Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（１０

ｐｍｏｌ／Ｉ）１．０

Ｊａｌ

ＰｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲＴ

１．０

ｌＩＩ

５Ｕ／ｐ．１

Ｔａｑ０．５山

ｄｄＨ２０１９．５

１１１

Ｔｏｔａｌ

２５．０

Ｊ１１

扩增反应在ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲ仪进行，循环程序如下：９４℃，３０Ｓ；５５＂（２，３０Ｓ：

７２＂（２，１

ｍｉｎ；３０

ｃｙｃｌｅｓ；７２＂（２，５ｍｉｎ。

＠ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的克隆及鉴定ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物从琼脂糖凝胶中的回收、纯化，

回收产物的连接转化以及阳性克隆的鉴定等见４．２。

４．４７个胁迫诱导基因片段的ＰＣＲ扩增与克隆

①材料拟南芥幼苗的培养方法见４．３①

②拟南芥基因组ＤＮＡ的提取（ａ）取２ｇ植物组织，加入石英砂、液氮，充分研

磨后，将粉末倒入５０

ｍＩ离心管中：（ｂ）待离心管中液氮挥发完全后，加入适量８

ｍｌＤＮＡ提取Ｂｕｆｆｅｒ，充分混匀后（可适当加热），室温下充分抽提１０－１５ｍｉｎ：（ｃ）

加入０．５倍体积苯酚，抽提５—１０ｒａｉｎ；再加入０．５倍体积氯仿，继续抽提１０－１５ｍｉｎ：

（ｄ）４，０００ｒｐｍ，室温离心２０ｍｉｎ；（ｅ）吸取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃

动离心管，使异丙醇与上清液充分混匀，可见白色絮状ＤＮＡ：（ｆ）将ＤＮＡ沉淀挑

入一新的１．５ｍｌ离心管中，加入１ｍｌ７０％的乙醇，洗涤沉淀；（ｇ）沉淀干燥后加

入０．５ｍｌＴＥ（含终浓度５０

ｖ．ｇｌｍｌ的ＲＮａｓｅＡ）溶解，３７０Ｃ消化ＲＮＡ０．５一ｌｈｒ：

（ｈ）等体积苯酚，氯仿、氯仿各抽提一次；（１）上清加入１／１０倍体积３ＭＮａＡｃ

（ｐＨ５．２）和２－２．５倍体积预冷的无水乙醇，混匀后。于－２００Ｃ放置３０ｍｉｎ，

１２，５００ｒｐｍ，４０ｃ离心１５ｍｉｎ，弃上清；（ｊ）７０％７，醇洗涤ＤＮＡ沉淀，干燥后溶

于适量ＴＥ或水中；（ｋ）取少许ＤＮＡ，琼脂糖凝胶上检查其质量并进行ＤＮＡ量的

４６

陈其军：材料与方法

标定，其余ＤＮＡ样品保存在一２００Ｃ备用。

（鸯ＰＣＲ扩增７个基因片段的引物设计如下（加框的部分为酶切位点）

５’一Ａ从＾｜ｃＴｃｇＡｄｃＡｃＡｇＡｃＡｃＡＴＭｃＡＴＡＴＭＴＡＴｇＴ从ｃｇＡ从ＴＭＡｃｇＴｃ．３’

Ｋ｛Ｎ１

５’一Ａ从＾｜ｃＴｃｇＡｄｃＡＴＴＡＴＴＴｇＡＡＴＡＴＡＡｇＴＴＴｇｇＣＴＣｇＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴｇＣ一３’

５’一～蚺＾ｌ从ｇＣＴＩ＿｜ｇＡＡＴＣＡｇｇＡｇＴＴｇＴＴＴＴＣＣＣｇｇＴｇｇ－３’

ＲＤ２９Ａ５。Ａ枞ｇＣＴＴＩｃＣＡＡＡｇＣＣｇＡＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＴｇＴＣＣ－３。

５’一ＡＭ＾｜ｃＴｃｇＡ出ｇＡｇＣｇＡＴｇＡＡｇＡＡｇｇＴｇＡｇｇＡＡＡＡｇ－３’

ＲＤ｛７

５’一Ａ从＾｜ｃＴｃｇＡ出ｇＡＴＣＡＡＡＴｇＣＡＡＴＣＡＡＧｇＡＡＡｇＣＯＡＣ－３’

５’一ＡＡＡ＾｜ｇＡＡＴＴｄｇＴＣｇＡｇＴｇＡＴｇＡＡｇＡＡｇｇＴｇＡＡｇＡＣｇ－３’

ＥＲＤｌｏ

５’一Ａ从＾｜ｇ从ＴＴｃ｜ｃＴＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＴｇｇＡｇＡＡＣＡｇＣ－３’

５’一ＡｇＡ从ｇ＾Ｉ＾＾ｇｃＴＴｌｃＡｇＡＴＴＴｃｇＴｇＡＣｇｇ＿３。

Ｏ。Ｒｆ５５·一＾＾＾＾Ｉｉ趸石ｉ司ｇ＾＾ＴｇＴｇＡＯｇｇＴｇＡＣＴｇＴｇｇＡＴＡＣＣ－３。

５’一从＾＾ｊｇ从ＴＴｃＩＧ＾ｃＡｃ＾１ＴＡＴｇ＾ｃＡＴＴＴＡＴｇＴ从＾ｇ＾ＡＴｇ从从ｇＴｃＴｌｃ＿３’

∞Ｒ６ｉｂ５’一心ＴＴｄＩｃＴＴＡＡＡＣＴＡｇＡＴＴＴＴｇＴＴｇＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡｇＴＴＣＣＡＡＡＣｇ－３’

５’一Ａ从＾ｌｃＴｇｃＡ出ｃＴＡｃＡＴｃＡｇｃｃＡＴ从ｃＴ从ｃＡＭｇｃＴＡＴＡｇｃ－３’

ＲＤ２９Ｂ

５’一从＾＾｜ｃＴｇｃＡ由ＴＴＣＡＣＡＡＡＣＡｇＡｇｇＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣｇＣ－３’

ＰＣＲ扩增体系及循环程序类似于４．３④，只不过模板替换为基因组ＤＮＡ．

④ＰｃＲ扩增产物的克隆及鉴定由于扩增７个基因片段的引物均引入了酶切位点，因

此采用ＳＫ克隆载体进行克隆。从琼脂糖凝胶中回收纯化ＰＣＲ扩增产物用相应的内切

酶酶切，酶切产物回收纯化后与使用相同内切酶酶切并经回收纯化的ｓＫ质粒进行连

接反应。从琼脂糖凝胶中回收纯化ＤＮＡ的方法见４．２①．各种内切酶由华美公司自产，

１＂４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。酶切反应在３７。Ｃ酶切３ｈｒ’连接反应于４。Ｃ连

接过夜。

酶切体系

连接体系

１０ｘＢｕｆｒｅｒｌｘＢｕｆｆｅ‘

Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（３

ｕ／ｐ１）０．６山

１０×ＢＳＡ

ｌｘＢＳＡ１０ｘＢｕｆｆｅｒ１叫

Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓ

０．２

Ｕ／¨．Ｉ

ＳＫｖｅｃｔｏｒｓ

２ｕ｜

ＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｒ

ＶｅｃｔｏｒｓＡｂｏｕｔ０．５¨∥ｐｌＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

５．４

ｐｌ

ｄｄ如ＯＡｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ

ｄｄＨ２０

１

ｕｌ

Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ

２０～６０

Ｈｌ

Ｔｏｔａｌ

ｖｏｌｕｍｅ１０ｕＩ

连接产物转化感受态大肠杆菌，根据蓝白斑初步筛选阳性克隆后。提取自斑，摇菌

４７

中国农业大学博士学位论文

提质粒，进行ＰＣＲ及酶切鉴定。鉴定为阳性的菌落送交公司测序。

４．５Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析

①材料处理材料培养见拟南芥幼苗的培养方法见４．３①。从平板上移取２周龄的拟

南芥幼苗进行如下处理：２００

ｍｍｏｌ／Ｉ的ＮａＣＩ溶液处理３

ｈｒ：４０Ｃ蒸馏水中处理３ｈｒ：

５０ｇｍｏｌ／Ｉ的ＡＢＡ水溶液中处理３ｈｒ．滤纸上自然干燥３ｈｒ；室温下蒸馏水中作为对照。

②总ＲＮＡ提取同４．３②。

③ＲＮＡ的甲醛的变性凝胶电泳及转膜

（ａ）配制含有甲醛的变性凝胶：琼脂糖

１．２％，１ｘＭＯＰＳ缓冲液，甲醛终浓度２．２

ｍｏｌ／Ｌ；（ｂ）处理ＲＮＡ样品（５０ｉｘｌ体系）：

总ＲＮＡ２０—３０ｇｇ（或ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ２－５旧），１０ｘＭＯＰＳ５山，甲酰胺１５９ｌ，甲

醛５

ｇｌ，ＤＥＰＣ水补足至４５Ⅲ，混合均匀后，６５。Ｃ加热５—１０ｍｉｎ，置冰上，加

入５Ⅲ１０ｘＲＮＡ

Ｌｏａｄｉｎｇ

Ｂｕｆｆｅｒ即可上样：（ｃ）１ｘＭＯＰＳ电泳缓冲液，进行电泳

分离：先较高电压，待溴酚蓝出加样孔约１ｅｒｆｌ后，降低电压至２—３

Ｖｌｅｍ，继续

电泳３－４ｈｒ；（ｄ）剪取与胶大小一致的尼龙膜，以１０ｘＳＳＣ为转移液，毛细管转

移法转膜过夜；（ｅ）转膜完毕后，用２ｘＳＳＣ漂洗尼龙膜，取出吹干或晾干：（ｆ）

将尼龙膜８００Ｃ烘３０ｍｉｎ—ｌｈｒ。

④探针标记探针标记按ＴａＫａＲａ公司的ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＶｅｔ．２．１设计

盒说明进行。

⑤预杂交与杂交５ｘＳＳＣ预湿的杂交膜放入杂交管中，带有ＤＮＡ片段的～面向

里，加入１５ｍｌ预热到６５１２的Ｃｈｕｒｃｈ缓冲液（含Ｉ％ＢＳＡ，ｌｍＭＥＤＴＡ，０．２５ｍｍｏｌ／ｌ

Ｎａ２ＨＰ０４－ＮａＨ２Ｐ０４（ｐＨ７．２），７％ＳＤＳ）预杂交５小时以上，加入变性好的探针，

于６５℃杂交１６小时。杂交结束后，分别用２ＸＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳ，ｌ×ＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳ，

０．５×ＳＳＣ＋０．５％ＳＤＳ和Ｏ．１ＸＳＳＣ＋０．Ｉ％ＳＤＳ在６５℃下洗膜，每次１５分钟，并不

断用ｍｏｎｉｔｏｒ检测信号。洗完后，用滤纸吸掉膜表面的水分，保鲜膜包好，放入

暗盒，－－７０℃放射自显影。

４．６Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析

①材料处理材料培养见拟南芥幼苗的培养方法见４．３①

②总ＤＮＡ提取同４．４②。

③总ＤＮＡ酶切、琼脂糖凝胶电泳及转膜按４．４④建立６０ｕＩ的基因组ＤＮＡ的酶

切体系，分别用ＢａａｋｌＩ、ＥｃｏＲＩ和／／ｉｎｄＩＩＩ内切酶酶切。取少量酶切产物电泳检测

酶切效果。对拟南芥基因组Ｄｂｌ／ｔ的３种酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度

陈其军：材料与方法

为０．８。５。电泳结束后，切下分子量标准，ＥＢ染色，凝胶条的一侧放一把透明的塑

料尺照像。依次对凝胶进行如下处理：Ｏ．２５ｍｏｌ／ＩＨＣＩ中浸泡胶２０

ｍｉｎ，凝胶中溴

酚蓝变为黄色；变性液中处理凝胶４５

ｍｉｒａ中和液中浸泡胶３０

ｍｉｎ。采用毛细管

转移方法将ＤＮＡ转移至尼龙膜。２ｘＳＳＣ漂洗尼龙膜，吹干或晾干后于８０。Ｃ烘

３０ｍｉｎ—ｌｈｒ。预杂交及杂交同Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ。

４．７融合蛋白的表达、纯化

①原核表达载体的构建按４．４④建立ｐＥＴ－３０ａ（＋）质粒以及含ＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡ的Ｔ

载体的双酶切体系（ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ．使用通用ｂｕｆｆｅｒ）。琼脂糖凝胶电泳后回收相

应的质粒及ｅＤＮＡ酶切片段，按４．４④建立连接体系。连接产物转化大肠杆菌感受

态细胞后，涂于Ｋａｎ板上。随机挑取菌斑提质粒进行ＰＣＲ鉴定及酶切鉴定。鉴定

为阳性的克隆送交公司测序。

②融合蛋白的诱导表达将阳性质粒转入大肠杆菌表达菌ＪＭｌ０９．ＤＥ３，挑单菌

落接种于含有５０斗ｇ／ｍＬ卡那霉素的ＬＢ液体培养基中，３７４Ｃ培养过夜。取

过夜培养物按１／５０的比例扩大培养至ＯＤ６００为Ｏ．５棚．６，吸取１

ｍＬ培养物，

收集菌体备用；加入ＩＰＴＧ至终浓度为Ｏ．２５

ｍｍｏｌ／Ｌ，３７。Ｃ继续摇菌４ｈｒ，

收集菌体，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳检测融合蛋白表达情况。

③融合蛋白的分离纯化分离纯化融合蛋白的试剂Ｎｉ－ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ购自ＱＩＡＧＥＮ

公司，操作按相关产品说明书进行。大量培养表达菌并诱导表达蛋白。离心集菌

后，用适量裂解缓冲液Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ脲、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＩ－１２Ｐ０４、０．０１

ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ

８．０）重悬，轻轻搅拌３０

ｍｉｎ。尽量避免泡沫产生；１２，０００

ｇ，４℃离心１５ｍｉｎ，

取上清；过Ｎｉ－ＮＴＡ

Ａｇａｒｏｓｅ亲和柱：再用适量洗脱液Ｃ（８ｍｏＦＬ脲、Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ

Ｎａｉｌ２Ｐ０４、Ｏ．０１

ｍｏｌ／Ｌ

Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ，ｐＨ

６．３）洗涤Ｎｉ柱两次；接着用洗脱液Ｄ（８ｍｏｌ／Ｌ

脲、０．１ｍｏｌ／Ｌ

ＮａＨ２Ｐ０４、Ｏ．０１

ｍｏｌ／Ｌ

Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ

５．９）洗涤Ｎｉ柱两次；最后用适量

洗脱液Ｅ（８

ｍｏｌ／Ｌ脲、０．１ｍｏｌ／Ｌ

ＮａＨｚＰ０４、Ｏ．０１

ｍｏｌ／Ｌ

Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ

４．５）洗涤

Ｎｉ柱。分别收集各洗脱液的洗脱组分。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测后，合并洗脱峰。

考马斯亮兰法测定分离纯化的蛋白浓度后，送交相关人员制备抗体。

４．８Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析

（１）装好电泳系统，加入电极ｂｕｆｆｅｒ，上样。１０和１５齿的２ｍｍ样品孔最大上样

量分别为３６和２８山。（２）稳压２００Ｖ，至溴酚兰刚刚跑出分离胶，约需１－１．５小

时。（３）卸下胶板，染色，室温染１—２小时，沸水脱色。（４）剪与胶等大的ＮＣ膜，

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四张滤纸，将ＮＣ膜，滤纸和海绵浸入转移ｂｕｆｆｅｒ中，至少５分钟。（５）按负极一

黑板一海绵一滤纸一胶块－－ＮＣ膜一滤纸一海绵一红板一正极的顺序安装好有关

装置，除尽气泡。（６）４＂Ｃ，１００

Ｖ转移１小时。（７）取出ＮＣ膜，浸入１０ｍｌ封闭

液中，３ＴＣ

１－１．５小时。（８）倒出封闭液，４℃可保存２周。（９）按效价加入一抗于

１０ｍｌＴＢＳＴ中，３ＴＣ

１小时。倒出一抗，４＂Ｃ可保存２周，２０ｍｌＴＢＳＴ清洗ｌＯ

分钟，重复３次。（１０）加入二抗于１０ｍｌＴＢＳＴ中，３７＂（２１小时，倒出二抗，４℃

刘’存２周，２０ｍｌＴＢＳＴ洗ｌＯ分钟，重复３次。（１Ｉ）】ＪＲ入１０ｍｌＡＰｂｕｆｆｅｒ，６６ｇｌＮＢＴ

母液，３３

ｐｌＢＣＩＰ母液，混匀显色２—５分钟至条带出现，取出ＮＣ膜，置于２０ｍｌ

重蒸水中，终止反应并清洗２－３次。（１２）晾干，保存于保鲜膜中。

４．９转基因烟草及转基因拟南芥的创建

①真核转基因载体的构建真核转基因载体使用ｐＢｌｌ２１，构建方法与原核表达载

体的构建方法类似。使用的ｐＢｌｌ２１载体采用大量碱裂解法提取。提取方法：（ａ）

将活化的菌体接种于５０ｍｌＬＢ液体培养基（加相应的抗生索），３７℃振荡培养过夜；

（ｂ）９，０００

ｒｐｍ、２

ｍｉｎ，离心收集菌体：（ｃ）２

ｍｌ溶液Ｉ（含ＲＮａｓｅＡ１００

ｌａｇ／ｍ１）

悬浮菌体；（ｄ）加入２

ｍｌ新配制的溶液ＩＩ，缓慢颠倒离心管混匀内容物，室温５ｍｉｎ，

促进菌体裂解；（ｅ）加入２

ｍｌ溶液ＩＩＩ（预冷），颠倒离心管混匀，冰浴１０ｍｉｎ：（ｆ）

１２，０００ｒｐｍ、４＂Ｃ离心１５ｍｉｎ，取上清，加入０．７体积的异丙醇，充分混匀，室温

放置１０

ｍｉｎ；（ｇ）１２，０００ｒｐｍ，离心２０

ｍｉｎ，弃上清，７０＊４７，醇洗涤沉淀，真空抽

干，溶解于适量水或者＂ｒＥ中，－２０℃保存备用。

②农杆菌感受态细胞的制备（ａ）挑取根癌农杆菌单菌落于３ｍｌ的ＹＥＢ液体培

养基（含相应抗生素：对ＬＢＡ４４０４而言是终浓度为１２５ｏｒ１００ｌａｅｇｍｌ的ｓｍ；对

ＧＶ３１０１而言是终浓度为１２５ｏｒ１００Ｉ．Ｌｇ／ｍｌ的ＲｉＤ中，２８０Ｃ振荡培养过夜；（ｂ）

取过夜培养菌液５００

ｌａｌ接种于５０ｍｌＹＥＢ（含相应抗生素）液体培养基中，２８０Ｃ

振荡培养至ＯＤ６００为Ｏ．５：（ｃ）５，０００ｒｐｍ，离心５ｍｉｎ；（ｄ）加ｌＯｍｌ

Ｏ．１５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣＩ

悬浮农杆菌细胞，５，０００

ｒｐｍ，离心５ｒａｉｎ；（ｅ）１ｍｌ预冷的２０ｍｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２悬浮细

胞，冰浴，２４小时内使用，或分装成每管２００

ｌａｌ，液氮中速冻１分钟，暨．７００Ｃ保

存备用。

③阳性农杆菌的制备及鉴定取２００

ｌａｌ感受态细胞，加入１

１ａｇ构建好的质粒ＤＮＡ，

液氮中速冻１分钟，３７０Ｃ水浴５分钟，然后加入１ｍｌＹＥＢ培养基，２８０Ｃ慢速振

荡培养４小时：１，０００ｒｐｍ离心３０

ｓ，弃上清，加入Ｏ．１ｍｌＹＥＢ培养基重新悬浮细

陈其军：材料与方法

胞，涂布于含有１００

ｐ，ｇ／ｍｌ

Ｋａｎ和１２５

ｐ，ｇ／ｍｌＳｍ的ＹＥＢ平板上，２８０Ｃ培养约４８

小时。挑取平板上长出的单菌落，接种于ＹＥＢ液体培养液（含有１００

ｐ－ｇ／ｍｌ

Ｋａｎ

及相应与该农杆菌菌株的抗生素）中，２８。Ｃ振荡培养过夜。小量提取质粒ＤＮＡ，

以质粒ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增鉴定。

④烟草的转化（ａ）将含有植物表达载体的ＬＢＡ４４０４农杆菌接种于ＹＥＢ液体培

养液（含有１００

ｐ．ｇ／ｍｌＫａｎ和１２５ｐｇ／ｍｌＳｉｎ）中，２８。Ｃ振荡培养至ｏＤ６００为ｏ．６￣ｏ．８；

４０００ｒｐｍ，室温离心１０分钟，用ＭＳ盐溶液（ＰＨ７．Ｏ）重新悬浮菌体，使用时采用

ＭＳ盐溶液稀释至原体积的２０～５０倍；（ｂ）烟草叶片的无菌处理取温室生长的烟

草叶片，流水下冲洗掉表面杂物，再用蒸馏水洗涤；７０％的乙醇灭菌３０秒后，无

菌水冲洗一次；２．５％次氯酸钠处理８—１０分钟；无菌水冲洗三次，备用；（ｃ）无菌

的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成０．４ｘＯ．６ｃｍ２大小；（ｄ）切好的外植体在农

杆菌菌液中浸泡ｌＯ分钟；（ｅ）用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺～

层滤纸的ＭＳ基本培养基，２８。Ｃ暗培养；（ｆ）三天后，将材料转到含有抗生素的

分化培养基（ＭＳ＋３ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．２ｍｇＡ－．ＮＡＡ＋Ｋａｎ

７５—１００ｐｇ／ｍｌ＋Ｃｂ

５００ｐ．ｇ／ｍ１）

中进行培养；（ｇ）待抗性芽生长至２－３ｅｍ高时，切下小芽转入生根培养基中诱导

生根，生根培养基配方：ＭＳ基本培养基＋Ｋａｒｌ

１００１．ｔｇ／ｍｌ＋Ｃｂ

５００ｐｇ／ｍｌ。

⑤拟南芥的转化将阳性ＧＶ３

１０１农杆菌接种于ｌＯｍｌＹＥＢ液体培养基（含相应

抗生素：１２５

ｐｇ／ｍｌ的ｇｉｆ，２５ＩＩｇ／ｍｌ的Ｇｅｎ，１００Ｉ．ｔｇ／ｍｌ的Ｋａｎ）中２８℃，２００

ｒｐｍ

振荡培养过夜，转化前一天接种于２００ｍｌ含相同抗生素的ＹＥＢ培养基中扩大培养

至ＯＤ㈣为１．２－１．６，５０００９，１５

ｍｉｎ离心集菌，重悬于渗入缓冲液，使ＯＤ㈣为０．８。

２００ｍｌ重悬菌液可重复使用３次。农杆菌可采用真空渗入法或Ｆｏｒａｌ

ｄｉｐ法侵染花

蕾期的拟南芥。具体方法见有关文献。收获种子后，在含１００

ｐｇ／ｍｌ

Ｋａｎ及５０

ｐｇ／ｍｌ

ｃｂ的ＭＳ盐上筛选阳性种子。每１５ｃｍ的平板上可以筛选１００

ｐｌ的拟南芥种子。

在置于２２℃光照培养箱培养前４＂１２处理３天。在光照培养箱中培养１周，将绿色

的幼苗转到土壤中繁种。收获的种子为转基因Ｔ２代种子。

４．１０转基因烟草的功能分析

①烟草无菌幼苗的培养烟草的３个转基因品系和野生型品系种子的消毒方法同

拟南芥。将１／４ＭＳ平板划分为４个相等的区域，并做好标记。将经消毒处理的３

个转基因烟草品系和野生型品系的种子分别播到同一平板的４个区域中。

②转基因烟草幼苗的耐盐性研究抗盐性实验：将６日龄的烟草无菌苗转至ｑ含３００

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ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的１／４

ＭＳ平板上胁迫处理３天。３天后，将胁迫处理的烟草无菌苗

转到正常的１／４ＭＳ平板上，生长１１天后，拍照。抗冻性实验：将１０日龄的烟草

无菌苗置于一ｌＯ℃处理３

ｈｒ，而后转到正常条件下培养。生长１ｌ天后拍照。抗热

击性实验：１０日龄烟草无菌苗于４８＂Ｃ处理４５

ｍｉｎ后，转到正常的生长条件下培养

１８天左右，拍照。

③转基因拟南芥植株的耐盐性研究土壤中实验：种子经消毒后，将３个拟南芥

转基因品系的Ｔ２代种子播种在含１００

ｐ．ｍｏｌ／ｌＫａｎ的ＭＳ平板上，野生型种子播种

于没有Ｋａｎ的ＭＳ平板上于光照培养箱中生长。ｌ周后将Ｋａｎ平板上的阳性转基

因苗及野生型幼苗移栽到土壤中生长。抗盐性实验：用３００

ｍｍｏｌ／Ｉ的ＮａＣＩ溶液浇

灌３周龄的Ｔ２代转基因拟南芥植株及野生型植株，每３天浇１次，１０天后拍照。

抗旱性实验：３周龄的拟南芥苗停止浇水，１０天后拍照。ＭＳ平板中实验：将３个

拟南芥转基因品系的Ｔ２代种子及野生型种子播在同一块事先做好分区及标记的

含１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的ＭＳ平板上，待转基因幼苗和野生型幼苗表现出明显的差别

后照相。

陈其军：结果与分析（一）

第三章实验结果与分析（一）

编码１，３，４－三磷酸肌醇５，６墩酶类似物的３个

拟南芥基因的克隆及其在胁迫条件下的表达分析

１利用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选受盐胁迫诱导的基因

为了发现与盐胁迫有关的新基因和功能未知的基因，我们以ＮａＣＩ胁迫处理和对照

拟南芥幼苗为材料，利用银染ｍＲＮＡ差异显示技术试图筛选一些受盐胁迫诱导的基因。

对照和盐处理两个样品分别以三种不同的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（Ｔ１１Ａ，Ｔ１ｌＣ和Ｔ１１Ｇ）为引物反

转录生成６种ｃＤＮＡ样品。在进行ＰＣＲ扩增时，６种ｃＤＮＡ样品与６个上游随机引物

可以有３６个组合（每种ｃＤＮＡ样品相应的下游Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｇＩ物与反转录时用到的相同）。

因此，６个随机引物需要进行３６个ＰＣＲ反应（表３－１）。

为避免加样误差及失误，采取以下措施改进加样操作：如表３－ｌ所示，列Ａ的ｃＤＮＡ

模板及Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｇｌ物分别为：Ｃ．Ｔ１１Ｃ＋Ｔ１１Ｃ；其它各列依此类推。行ｌ的随机引物为：

ＡＰｌ，其它各行依此类推。分别在Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ各管将ｃＤＮＡ模板及Ｏｔｉｇｏ（ｄＴ）

引物混合好，分别加入事先按表３－１作好标记的３６个ＰＣＲ管。然后，按上表加入随机

引物，最后加入ＰＣＲ反应预混液（含Ｔａｑ酶，Ｂｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰｓ，ｄｄＨ２０）。

表３．１３６个ＲＴ－ＰＣＲ的反应体系

Ｔａｂｌｅ３－１Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎ

ｓｙｓｔｅｍｓ

ｆｏｒ３６ｓａｍｐｌｅｓ

ｏｆＲＴ－ＰＣＲ

ＡＢＣＤＥＦ

（ＣＴｌｌＡ）（ＣＴｌｌＣ）（ＣＴＩＩＧ）（ＳＴｌｌＡ）（ＳＴｌｌＣ）（ＳＴｌｌＧ）

ｆｒｌｌＡｌｆＴ１１Ｃ、ｆＴ，１Ｇ１ｒｒｌｌＡ）（Ｔ１，Ｃ１ｒｒｌｌＧｌ

１Ａ１Ｂ１Ｃ１Ｄ１Ｅ１Ｆ１

（ＡＰｌ、

２Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２Ｅ２Ｆ２

ｆＡＰ２、

、３Ａ３Ｂ３Ｃ３Ｄ３Ｅ３Ｆ３

ｆＡＰ３’

４Ａ４

Ｂ４Ｃ４

Ｉ）４Ｅ４

Ｆ４

（ＡＰ舢

５Ａ５Ｂ５Ｃ５Ｄ５Ｅ５Ｆ５

ｆＡＰ５１

６Ａ６Ｂ６Ｃ５Ｄ６Ｅ６Ｆ６

ｆＡＰ６）

跑测序胶时上样顺序分别为：Ａ．Ｄ，Ｂ—Ｅ和Ｃ—Ｆ相应的管号两两组合，例如Ａ１和

Ｄ１组合，其它依此类推。测序胶经银染后表现为差异的条带共有３３条，其中，１８条

差异带受盐胁迫升调节，１５条受盐胁迫降调节（图３－１）。

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图３－１盐处理幼苗和对照幼苗银染差示部分结果

１、２泳道为两个重复的样品．代表对照样品；３、４泳道

为两个重复的样品，代表经ＮａＣＩ处理的样品箭头示差异带。

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１Ａｐｏｒｔｉｏｎ

ｏｆ

ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｐａｔｔｅｒｎｓ

ｏｂｔａｉｎｅｄ

ｂｙ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ

ｄｉｓｐｌａｙ

ｗｉｌｈ

ｔｈｅｏｌｉｇｏｎｕｏｌｅｏｔｉｄｅｓ

Ｔ１１ＧａｎｄＡＰ６

Ｌａｎｓ１ａｎｄ２ａｒｅｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ

ａｎｄ

ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ

ｔｈｅｃｏｎｔｒｏ

ｓａｍｐｌｅｓ；Ｌａｒｌｅ

３ａｎｄ４ａｒｅａｌｓｏｒｅｐｌｉｃａｔｅｓａｎｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈ

ｓａｍｏｌｅｓｔｒｅａｔｅｄｂｙ２００ｍｍｏＵＬＮａＣＩ

圈３－２部分差异片段的反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析

Ａ和Ｂ为两张完全相同的尼龙膜，泳道１～７分别为７个不

同的差异显示片段．与尼龙膜Ａ杂交的探针为对照组ｃＤＮＡ

探针，与尼龙膜Ｂ杂交的探针为处理组ｃＤＮＡ探针

Ｆｉｇｕｒｅ

３－２ＲｅｖｅｒｓｅＮｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

ｐａｒｔｉａｌ

ｄｉ仃ｂ他ｎｔｉａｌｂａｎｄｓ

ＡａｎｄＢａｒｅｔｈｅｔｗｏ

ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｎｙｌｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｓ．

Ｌａｎｅｓ

ｆｒｏｍ

ｌｔｏ７ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｅｖｅｎｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｌｂａｎｄｓ

ｆｒｏｍｔｈｅＤＤＲＴ．Ｔｈｅ

ｐｒｏｂｅｓｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ

ｗｉｔｈ

ｔｈｅ

ｎｙｌｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅＡａｒｃｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｃＤＮＡ

ｐｒｏｂｅｓａｎ

ｍａｔ

ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ

ｗｉｔｈｔｈｅ

ｎｙ｜ｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅＢｆｒｏｗ＝ｔｈ

ｔｒｅａｔｍｅｎｔｃＤＮＡ

ｐｒｏｂｅｓｂｙ

２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ．

２差异片段的反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析

为了确证差异带的真实性，每个表现为升调节的差异条带经ＰＣＲ再扩增后转移到

尼龙膜上。每个样在尼龙膜上有两个重复，尼龙膜分成两半，一半与来自ＮａＣＩ胁迫处

理的拟南芥幼苗ｃＤＮＡ探针杂交，另一半与来自未经ＮａＣＩ胁迫处理的拟南芥幼苗

ｃＤＮＡ探针杂交。１８条差异带经反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交后发现，只有３条差异带表现为阳

性（图３—２）。反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ的结果说明，ＤＤＲＴ有很高的假阳性率（在８０％以上），

陈其军：结果与分析（一）

比起传统的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交的方法，利用反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ技术可以大大降低筛选阳性差异

片段的工作量。

３阳性差异片段的克隆、测序及Ｂｌａｓｔ分析簖？１

．．。一觑奠蟑．＆趣尘ｊ犍逊．蠢’＆玉ｉｊ：¨。。

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ａｇａａａｃｇａｇｃｔｔｔｇｇｃａｇａｔｃａａｔａｃｔａａａｃｔｃａａｃｇｇａｇａｇａｃｃａｔｔｇｔｔｃｃｔｃｃｃｃａａａｇａａａａａａａｇａａｇａｔｔａｇ

ｔａｇｔｃｔａｔｇｃａａｔｔｔａｔｔｔｃｔｇｔａｃａｇｇａｃａａａｇｃａｃｃｇａｔｔｔｃｃｃｔｃｇａｔｇｔｔｇｔｔｃｔｔｔａｇｃｔｔｃａｔｔｇｔｇｃｔｇｔａ

ｃａａａａｇａａｃａａｔ职ａａｇａｃｔｇｃａｔｔｔａａａａ聃ａａａｔｃｃｃｔｔｇｇｇａ唯ａａａａａａａａａａ璺卜３’

、

．（Ｂ）

图３－３相应于ＡｔｌＴＬｌ基因的ＤＤＲＴ差异片段的序列分析结果

圈Ａ为序列分析图谱：图Ｂ为序列分析结果，其中，５’端框中的序列为随机引物序列．３。端框中的序

列为锚定引物ＴＩＩＧ的互补序列．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－３Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

ｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ

ｆｒａｇｍｅｎｔ

ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ

ｔｏｔｈｅＡｔｌＴＬｌ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａｓｈｏｗｓｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

ｃｏｌｏｒ

ｐｉｃｔｕｒｅ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｂｓｈｏｗｓｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

ｒｅｓｕｌｔ．ｔｈｅ

ｆｒａｍｅｄ

ｐａｒｔｓ

ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｒａｎｄｏｍｄｅｃａｍｅｒａｎｄｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｖｅｒｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄｔｏ

ＴｔｌＧ

ｐｒｉｍｅｒ，

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

将经反向Ｎｏｔｌｈｅｍ证实为阳性的盐诱导片段克隆到ｐＧＥＭ．Ｔ载体上送交公司测

序。将序列分析结果提交到ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）作Ｂｌａｓｔ

５５

一——一主垦查些盔堂堡主堂堡垒苎

序列同源性分析，同时检索相关文献。结果表明，在３条经反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ证明为阳性的

片段中，２条阳性片段相应的基因在盐胁迫反应中的功能已有文献报告。一条阳性片段

相应的基因（命名为ＡｔｌＴＬｌ）编码１，３，４·三磷酸肌醇５／６．激酶类似物（以下简称５／６．激

酶），其功能尚未有文献报告。

ｇｇａｇａｃｇａｃａｇａｇｃａａｇａｇａｃａｔｃｇｔｃｇｃｃＣｔｇｔｔｃｇｔｔａＫｔａａｔｃｇａａｇｃｔｔｔｔｃｃｇｇｔｇａａｇａａａｔｃｃａｔｔａｔｔｇｔ

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ｔｃｔｔｇｔｔｇｃａａａｇｃｃａｔｔｇｇｔｔｇｃｔｇａｔｇｇａａｇｔｇｃａａａｇｔｃａｃａｔｇａｇｃｔｔｔｃｇｃｔｇｇｃｔｔａｃｇａｔｃａａｃａｃｔｃｃｃｔ

ｔｃｔｇａａｇｃｔｃｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃａｇｇａ刮ｃｔｔＫｔｔａａｃｃａｔｇｇａｇｇｔｃｔｔｃｔｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔａｃａｔｔｇｔｔｇｇ

ｇｇａｇｇｃｔａｔｔａｇａｇＬｔｇｔｃｃｇｇｃｇｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｃｃｔｇａｔＫｔｃｔｃｔａｇａｃｇａｇａａｃｔｃｃｃｃａａａｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｔａｔｔ

ｃｃｇｃｔｔｃｃｃａｃｇｇｇｔｃｔｃｔｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃａｇｃｔｇａｔｇａｔｇｃａｇａｔｃｔｇｇａｃｃｃｇａｇｃａｔｔｇｃｃｇａｇｃｔｔｃｃａｃｃ

ａｃｇｔｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａｇａｇａｃｔｇｇｃａａａｇｇａａｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｇｔｃｔａａｇｇｃｔＫｔｔｃａａｔｔｔａｇａｃａｔａａｔｔａｇ

ａｇａｇｃａｃｇｇｇａｃａａｇａｇａｔｃｇｇｔｔｔｔａｔｇｔｇａｔｃｇａｃａｔｃａａｃｔａｔｔｔｃｃｃａｇｇｃａａｇｔｔｔｇａｔｔｔｃｃａｃａｃａｔｔｔｔｔ

图３－４Ａｔ／ＴＬｌａ的ｃＤＮＡ全序列

图中．５‘端加框的部分为５＇－ＵＴＲ序列：３’端加框的部分为３＇－ＵＴＲ序列；中间未加框的部分为ＣＤＳ

序列。

Ｆｉｇｕｒｅ：３

４

Ｔｈｅ

ｃｏｍｐｌｅｔｅ

ｃＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｏｆｔｈｅＡｔｌＴＬｌａ

Ｔｈｅ

ｆｒａｍｅｄ

ｐａｄｓ

ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅ５＇－ＵＴＲａｎｄｔｈｅ

３＇－ＵＴＲ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

在进行Ｂｌａｓｔ分析时发现，有５个登录号各不相同的序列与ＡｔｌＴＬｌ差异片段同源，

分别是：ＡＬｌ６１５１０，ＡＬ０８０２５２，ＡＶ０５０４０８，Ａｙ０５８２４ｌ和ＮＭ

１１６８８６。其中登录号

为ＡＬｌ６１５１０和ＡＬ０８０２５２的序列是拟南芥基因组序列的两个ＢＡＣ克隆，两个ＢＡＣ

克隆的序列有一部分是重叠的。两个ＢＡＣ克隆都含有同一个根据基因组序列推测的基

因，其ＣＤＳ（编码区）序列编码ｌ，３，４－三磷酸肌醇５／６．激酶类似物。另外３个登录号为

ＡＹ０５０４０８，ＡＹ０５８２４ｌ和ＮＭ１１６８８６的序列是同一种ｍＲＮＡ相应的ｃＤＮＡ序列，也

陈其军：结果与分析（一）

编码ｌ，３，４－三磷酸肌醇５／６一激酶类似物。分析发现，这三个ｍＲＮＡ相应的基因组序列

来自上述登录号为ＡＬｌ６１５１０或ＡＬ０８０２５２的ＢＡＣ克隆。根据基因组序列（ＡＬｌ６１５１０

和ＡＬ０８０２５２）推测的ＣＤＳ序列与登录的ｍＲＮＡ序列（ＡＹ０５０４０８，ＡＹ０５８２４１和

ＮＭ一１

１６８８６）两者在３’端有所不同。我们利用ＤＤＲＴ方法筛选得到的３’端片段与根据

基因组序列推测的３’端序列是完全吻合的，表明根据基因组序列推测的ＣＤＳ序列是存

在的，在后面的实验中我们也的确用ＲＴ－ＰＣＲ的方法克隆了该ＣＤＳ序列。因此，ＡｔｌＴＬＩ

基因的前体ｍＲＮＡ有两种剪接方式，分别将两种ｍＲＮＡ或ｅＤＮＡ序列命名为ＡｔｌＴＬｌ口

和ＡｔｌＴＬＩｂ。我们利用ＤＤＲＴ方法筛选得到的差异片段为ＡｔｌＴＬｌａ的３’端部分序列。

ＡｔｌＴＬｌａ和，６的ＣＤＳ的５’端剪接方式是完全一样的，因此ＡｔｌＴＬｌａ的５＇－ＵＴＲ也应该

与ＡｔｌＴＬＩｂ的相同。由此，我们得出ＡｔｌＴＬｌａ的序列全长为１４９１

ｂｐ，其中包括１７９ｂＤ

的５＇－ＵＴＲ，１０１７

ｂｐ的ＣＤＳ和２９５ｂｐ的３＇－ＵＴＲ。爿ｆ，７ｚ』６的序列全长为１４１５

ｂｐ，其

中包括１７９

ｂｐ的５＇－ＵＴＲ，１０６２ｂｐ的ＣＤＳ和１７４ｂｐ的３＇－ＵＴＲ（图３．４和３－５）。

４拟南芥基因组中编码ｌ，３＾三磷酸肌醇５１６．激酶类似物的所有３个基因的ｅＤＮＡ编码

区的克隆

以ＡｔｌＴＬａ的ｅＤＮＡ序列在ＮＣＢＩ网站上作Ｂｌａｓｔ分析，同时查找拟南芥编码５／６．

激酶的核酸或蛋白序列，发现在拟南芥中包括ＡｔｌＴＬＩ在内共有３个基因编码５／６．激酶

类似物。其中的一个基因已有文献报告其编码的蛋白具有５／６．激酶活性。该基因被命

名为ＡｔｌＴＫ。ＡｔｌＴＫ的全序列ｅＤＮＡ已在ＧｅｎＢａｎｋ上登录。另一基因同４ｌ，死Ｊ一样编

码５／６．激酶类似物，该基因被我们命名为ＡｔＩＴＬ２。ＡｔｌＴＬ２的ＣＤＳ是根据基因组序列推

测而来。ＡｔＩＴＬｌａ，ＡｔｌＴＬｌｂ，ＡｔｌＴＬ２，ＡｔｌＴＫ四种ｅＤＮＡ的ＣＤＳ长度分别为：１０１７，１０６２，

１０９５和９６０

ｂｐ。ＡｔｌＴＬ２（Ａｔ４９３３７７０）和ＡｔｌＴＬｌ（Ａｔ４９０８１７０）位于４号染色体，ＡｔｌＴＫ

位于５号染色体（Ａｔ５９１６７６０）。ＡｔｌＴＬｌａ和ＡｔＩＴＬｌｂ，ＡｔｌＴＬ２，ＡｔｌＴＫ的氨基酸同源性

分别为９２％，５１％，３９％（图３—６）。

为了对编码１，３，４．三磷酸肌醇５，６．激酶类似物的所有３个基因在胁迫条件下的表达

进行分析，同时为了构建３个基因的原核融合蛋白表达载体和真核转基因表达载体，

我们利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法分别克隆了ＡｔｌＴＬｌａ，ＡｔｌＴＫ和ＡｔｌＴＬ２基因的ＣＤＳ序列。

首先我们利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法克隆了ＡｔｌＴＬｌａ的ＣＤＳ。从盐处理的拟南芥幼苗中

提取的ＲＮＡ经反转录后，以反转录产物ｅＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增（图３—７Ａ）目的

条带经琼脂糖凝胶电泳回收后，构建到Ｔ载体上，转化大肠杆菌，提取质粒进行ＰＣＲ

和双酶切（ＢａｍＨｌ和Ｓａｅｌ）鉴定（图３—７Ｂ）。经鉴定为阳性的质粒送交公司测序。

中国农业大学博士学位论文

』舰妇＝＝＝＝二＝＝兰＝＝＝兰生＝］

＾ｔＩ’Ｌｌｂ

ＵＡＡＵＡＡ

（Ｂ）

图３－５ＡｔｌＴＬＩ基因（前体ｍＲＮＡ）的两种剪接方式

图Ａ，两种剪接方式产生的两种ｃＤＮＡ同源性比较，ｃｏｍｐｌｅｔｅ－ｌａ指ＡｔｌＴＬｌａ的全序列·

ｃｏｍｐｌｅｔｅ－ｌｂ指ＡｔｌＴＬｌｂ的全序列：图Ｂ．两种剪接方式示意图ｔ三角形代表被剪接掉的内含子。

ＵＡＡ为终止密码子．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－５Ｔｈｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ

ｓｐｌｉｃｉｎｇｏｆｐｒｅ－ｍＲＮＡ

ＯｆＡｔｌＴＬｌ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａｓｈｏｗｓ

ｈｏｍｏｌｏｇｙ

ｃｏｍｐａｄａｏｎ

ｂｅｗｅｅｎ

ｔｈｅ

ｔｗｏ

ｃｏｍｐｌｅｔｅ

ｃＤＮＡ

ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｒｏｄｕｃｅ

ｂｙ

ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ

ｓｐｌｉｃｉｎｇ

ｏｆ

ｐｒｅ－ｍＲＮＡ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ－ｌａ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｃｏｍｐｌｅｔｅ

Ａ１ＩＴＬｌａａｎ

ｃｏｍｐｌｅｔｅ．１ｂ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｃｏｍｐｌｅｔｅＡｔｉＴＬｌｂ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｂｓｈｏｗｓｔｈｅｓｃｈｅｍｅｓｏｆａｌｔｅｍａｔｉｖｅ

ｓｐｌｉｃｉｎｇ：ｔｈ

ｔｒｉａｎｇｌｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｉｎｔｒｏｎｔｏ

ｂｅ

ｓｐｌｉｃｅｄ

ｏｕｔ．ｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＵＡＡｓｔｏｐｃｏｄｏｎｓａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ。

陈其军：结果与分析（一）

图３－６ＡＩｌＴＬｌａ同ＡｔＩＴＬｌｂ，ＡｔＩＴＬ２，ＡｔｌＴＫ氨基酸序列的同源性比较

图Ａ，Ｂ．Ｃ分别表示ＡｔｌＴＬｌａ同ＡｔｌＴＬｌｂ，ＡｔＩＴＬ２．ＡｔｌＴＫ氨基酸序列的同源性比较．氨基酸序

列在Ｇｅｎｂａｎｋ数据库的登录号分别为：ＡｔＩＴＬｌａ自ＣＡＢ４５７８７．１或ＣＡＢ８１１５３．１；ＡｌＩＴＬｌｂ自

ＡＡＫ９１４２４．１或ＡＡＬｌ５４１５．１或ＮＰ＿５６７３３４．１；Ａｔｌｌｌ．２自ＣＡＡ２０５９０．１或ＣＡＢ８００９４．１或

ＮＰ１９５１０３．１；ＡｔＩＴＫ自ＭＣ２鹋的．１或ＣＭＤ４９７８．１或ＣＡＣ０１８４０．１或ＡＡＬ５９９７８．１或

ＮＰ１９７１７８．１．阴影表示同源的部分．

Ｆｉｇｕｒｅ．３－６

Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄ

ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ

ｏｆＡｔｉＴＬｌａｗｉｔｈＡｔＩＴＬＩｂ．ＡｔＩＴＬ２，ＡｔＩＴＫ

Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄ

ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ

ｏｆＡｔＩＴＬｌｅｗｉｔｈＡｔＩＴＬｌｂ．ＡｔＩＴＬ２．ＡｔＩＴＫａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎＦｉｇｕｒｅＡ．Ｂ

Ｃ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄ

ａｍｉｎｏａｃｉｄｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ

ｐｕｂｌｉｃ

ｄａｔａｂａｓｅｓ

ａｒｅａｓｆｏＩｌｏｗｓ：ＡｔＩＴＬｌａ（ＣＡＢ４５７８７．１ｏｒＣＡＢ８１１５３．１）．ＡｔＩＴＬｌｂ（ＡＡＫ９１４２４．１ｏｒＡＡＬｌ５４１５．１ｏ

ＮＰ５６７３３４１）．ＡＩＩＴＬ２（ＣＡＡ２０５９０１

ｏｒＣＡＢ８００９４．１ｏｒＮＰ１９５１０３．１）．ＡＩＩＴＫ（ＡＡＣ２８８５９．１ｏ

ＣＡＡ０４９７６１ＯｒＣＡＣ０１８４０．１ｏｒＡＡＬ５９９７８．１ｏｒＮＰ－１９７１７８１）．Ｔｈｅ

ｇａｐｓ

ｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔ

ｍａｘｉｍｉｚｅｔｈｅ

ａｌｉｇｎｍｅｎｔ

ａｎｄｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓａｒｅｓｈａｄｅｄ

中国农业大学博士学位论文

＿Ｉ｛ｊ同样的方法克隆了ＡｔｌＴＫ和ＡｔＩＴＬ２的ＣＤＳ。ＡｔｌＴＫＣＤＳ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物（图

３－８）同样构建到Ｔ－载体上，阳性克隆经ＰＣＲ鉴定后，以阳性质粒为模板，重新进行

ＰＣＲ扩增，引入ＢａｍＨＩ和ＳａｅＩ酶切位点。ＰＣＲ产物经酶切后，将酶切片段构建到原

核融合蛋白表达载体ＰＥＴ－３０ａ（＋）及真核转基因表达载体ｐＢＩｌ２１（见结果与分析的第二

部分）上后送交公司测序。ＡｔｌＴＬ２ＣＤＳ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物（图３－９）不经克隆直接

送交公司测序。序列分析彩图见图３．１０。

我们通过ＲＴ．ＰＣＲ方法得到的ＡｔｌＴＬｌａ的ＣＤＳ序列与ＧｅｎＢｍａＫ上预测的序列只有

两个碱基的不同，但氨基酸序列是一样的。通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法得到的ＡｔｌＴＫ的ＣＤＳ

序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的序列完全一致。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法得到的ＡｔＩＴＬ２序列与

ＧｅｎＢａｎｋ上登录的序列有较大的差异（图３－１１）。

图３．７Ａｔ／ＴＬ伯ＣＤＳ的克隆及鉴定

围Ａ，ＲＴ－ＰＣＲ的扩增产物电泳结果．泳道１为ＲＴ＿ＰＣＲ的扩增产物．泳道２为分子量标准．图Ｂ，

阳性克隆的酶切ＰＣＲ及ＰＣＲ鉴定．泳道１为阳性质粒的双酶切结果．泳道２为ＰＣＲ扩增结果，泳道３

为ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物对照．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－７ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＤＳｏｆＡＨＴＬ’ａ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａ．ｔｈｅ

ｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲＴ－ＰＣＲ．Ｌａｎｅ１ｓｈｏｗｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ＲＴ－ＰＣＲ；ｌａｎｅ２

ｓｈｏｗｓｔｈｅ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓＦｉｇｕｒｅ

Ｂ．ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆｐｏｓＢｖｅｄｏｎｅ

ｔｈｒｏｕｇｈｅｎｚｙｍｅｃｕｔｔｉｎｇｏｒＰＣＲ．Ｌａｎｅ１

ｓｈｏｗｓｔｈｅｒｅｓｕｎｓｏｆｐｏｓｔｔｖｅｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔｂｙ

ＢａｍＨＩａｎｄＳａｃｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｌａｎｅ２ｓｈｏｗｓｔｈｅ

ｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ

ｕｓｉｎｇ

ｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｍａｓｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｌａｎｅ３ｓｈｏｗｓｔｈｅｒｅａｕ，ｓｏｆＲＴ－ＰＣＲａｓｃｏｎｔｒｏｌｏｆ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｚｅ

陈其军：结果与分析（一）

圈３－８

Ａｔ／ＴＫＣＤＳ的克隆及鉴定

图Ａ．ＲＴ－ＰＣＲ的扩增产物电泳结果．泳道１为ＲＴ－ＰＣＲ的扩增产物，泳道２为分子量标准。

图Ｂ，６个阳性克隆的质粒，泳道１—６分别为６个阳性质粒的电泳结果。图Ｃ，阳性质粒的ＰＣＲ

鉴定结果。泳道１－－６分别为６个阳性质粒的ＰＣＲ扩增结果，泳道７为ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物对照。图

Ｂ的泳道７和图Ｃ的泳道８为分子量标准。

Ｆｉｇｕｒｅ

３－８ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＤＳｏｆＡｔ／ＴＫ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａ．ｔｈｅｒｅｓｕＩｔｓｏｆＲＴ．ＰＣＲＬａｎｅ１ｓｈｏｗｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ＲＴ－ＰＣＲ；ｌａｎｅ２ｓｈｏｗｓｔｈ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｍａｒｋｅｒｓ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｂ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆ

ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｏｆ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓ

Ｌａｎｅｓ

ｆｒｏｍ１ｔｏ

ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｓｉｘ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｃ．ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ６

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓ

ｔｈｒｏｕｇｈ

ＰＣＲＬａｎｅｓｆｒｏｍ１ｔｏ６ｉｎｄｉｃａｔｅ仇ｅｒｅｓｕｌｔｓ

ｏｆＰＣＲｗＲｈ

ｐｏｓｉｔｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓａｓｔｅｍｐｌａｔｅｓ．１ａｎｅ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｗｉｔｈｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲＴ－ＰＣＲａｓｔｅｍｐｌａｔｅｓ．

圈３－９ＲＴ．ＰＣＲ扩增Ａｔ／ＴＬ２基因的ＣＤＳ

图中，泳道１为ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的电泳结果；泳道２为分子

标准．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－９ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＤＳ

ｏｆＡｔｌＴＬ２ｔｈｒｏｕｇｈＲＴ－ＰＣＲ

Ｌａｎｅ

ｌｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔ

ｏｆｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｏｆｔｈｅＲＴ－ＰＣ

ｔｏａｍｐｌｉｆｙ

ｔｈｅＣＤＳｏｆＡｔｌＴＬ２

！旦垒些查堂堡主堂焦堡壅

翻３．１０

Ａｔ／ＴＬｌ，Ａｔ／ＴＫ和月Ⅳ７Ｌ２基因的ＣＤＳ序列测序彩图

圈Ａ和８为ＡｔｌＴＬｌ基因ＣＤＳ（ＡｔｌＴＬｌａ）的两个测序彩圈．圈Ｃ和Ｄ为ＡｔｌＴＫ基因ＣＤＳ的两个

测序彩图，图Ｅ和Ｆ为ＡｔｌＴＬ２基因ＣＤＳ的两个测序彩圈．

Ｆｉｇｕｒｅ３－１０

Ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｄｎｇ

ｃｏｌｏｒｐｉｃｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅＣＤＳＯｆＡｔｌＴＬｌ，ＡｔｌＴＫａｎｄＡｔｌＴＬ２９ｅｎｅｓ

Ｆｉｇｕｒｅ

ＡａｎｄＢｓｈｏｗｔｈｅｔｗｏ

ｓｅｑｕｅｎｄｒｉｇｃｏｌｏｒ

ｐｉｃｔｕｒｅｓ

ｏｆ

ｔｈｅ

ＣＤＳ

ｏｆＡｔｌＴＬｌ

ｇｅｎｅ伪ｔｌＴＬｌａ）．

ＦｉｇｕｒｅＣａｎｄＤｓｈｏｗｔｈｅｔｗｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｏｌｏｒｐｉｃｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅＣＤＳｏｆＡｔｌＴＫｇｅｎｅ．ＦｉｇｕｒｅＥａｎｄ

Ｆｓｈｏｗ

ｔｈｅ

ｔｗｏ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ

ｃｏｌｏｒｐｉｃｔｕｒｅｓ

ｏｆｔｈｅＣＤＳｏｆＡｔ／ＴＬ２．

陈其军：结果与分析（－－）

图３．１１

ＡｔｌＴＬ２两种ＣＤＳ的序列比较

图中，ＡｔｌＴＬ２—１０９５指ＧｅｎＢａｎｋ上登录的根据基因组序列预测的ＣＤＳ（１０９５ｂｐ）：ＡｔｌＴＬ２．１０２９

指我们根据ＲＴ－ＰＣＲ扩增到的实际序列（共１０２９

ｂｐ）．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１１Ｔｈｅ

ａｌｉｇｎｍｅｎｔ

ｏｆｔｗｏＣＤＳｏｆＡｔ／ＴＬ２

ＡｔＩＴＬ２－１０９５ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｐｒｅｄｉｃｔｅｄＣＤＳ（１０９５ｂｐ．ｅｃｃ６ｓ￥ｉｏｎ

ｎｕｍｂｅｔ，ＡＬｌ６１５８４ｏｒＡＬ０３１３９４）．

ＡｌＩＴＬ２－１０２９ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＣＤＳ

ａｍｐｌｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈ

ＦｌＴ－ＰＣＲ．

为了验证Ａｔ／ＴＬ７基因的拷贝数并验证ＡｔｌＴＬｌａ和Ａｔ／ＴＬｌｂ两种ｃＤＮＡ的确来自同

一基因组序列，用三种不同的内切酶Ｈｉｎｄｌｌｌ，ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨｌ分别酶切拟南芥基因组

ＤＮＡ，以ＡｔｌＴＬｌａ编码区ｃＤＮＡ为探针，在高严紧杂交和洗脱条件下进行ＳｏｕｔｈｅｍＢｌｏｔ

分析。根据ＡｔＰＴＬｌ基因所在的ＢＡＣ克隆（Ｔ１２Ｇ１３），其基因组序列被Ｈｉｎｄｌｌｌ切成约

４１４９

ｂｐ和约２０４１ｂｐ两个片段，其中约４１４９ｂｐ的片段中包括约３０７２ｂｐ的ＡｔｌＴＬｌ

基因组序列，约２０４１ｂｐ的片段中包括约１０１ｂｐ的ＡＵＴＬｌ基因组序列。ＡＵＴＬｌ的基

因组序列被ＥｃｏＲＩ切成约６８５１

ｂｐ和约３０１１ｂｐ两个片段。其中约６８５１ｂｐ的片段

中包括约２２２９

ｂｐ的ＡｔｌＴＬｌ基因组序列，约３０１１ｂｐ的片段中包括约９４４

ｂｐ的ＡｔｌＴＬｌ

基因组序列。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交结果基本上与根据基因组序列所作的的预测吻合（图

３—１２），表明Ａｆ，丁Ｌ７基因是单拷贝的。尽管拟南芥基因组中存在其它两个编码５／６．激

酶的基因ＡｔｌＴＬ２和ＡｔｌＴＫ，但由于它们和ＡｔｌＴＬｌ的同源性不是很高，因此在高严紧条

件下，不能和ＡｔｌＴＬｌ的ｃＤＮＡ探针杂交。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果还证明ＡＵＴＬｌａ和７６的

６３

中国农业大学博士学位论文

确来自同一基因组序列。

圈３－１２ＡｔｌＩＬｌ基因的Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂ｛ｏｔ分析

Ｅ，Ｈ和８分别表示ＥｃｏＲＩ．Ｈｉｎｄｌｌｌ和ＢａｍＨＩ．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１２Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓ

ｄｉｇｅｓｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓ

ａｎｄ

ｓｉｚｅ辩ｐａｒ蛐－ｄｏｎｔｏａ０．８％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ

ＴｈｅＤＮＡｗａｓｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ

ｏｎｔｏａｎｙｌｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄＷＢＳｆｉｘｅｄ

ｂｙｂａｋｉｎｇ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ

ｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ

ｗｉｔｈｔｈｅ

Ａｔ玎ＺｌａｃＤＮＡａｔ６５。

ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ．Ｅ，Ｈ，ａｎｄ

ＢｉｎｄｉｃａｔｅＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ａｎｄ

ＢａｒｎＨＩ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

５编码ｌ＇３，４－三磷酸肌醇５ｆ确ｔ酶类似物的所有３个拟南芥基因在胁迫条件下的表达

分析

５．１ＡｔｌＴＬｌ基因受ＮａＣｌ和低温诱导，但不受干旱和ＡＢＡ诱导

为了进一步证实差异显示条带的真实性，并了解相应的基因是否被其它胁迫条件

所诱导，我们以克隆的ＡｔｌＴＬＩａ的３’端ｃＤＮＡ部分片段为探针进行ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析。

结果表明，ＡｔｌＴＬｌ基因除受ＮａＣＩ诱导外，还受低温诱导，但几乎不被干旱和ＡＢＡ诱

导（图３—１３）。

图３－１３＾ｆＪｌｔｆ基因的诱导表达

Ｈ２０，未经胁迫处理；ｃｏｌｄ，４＂Ｃ处理３小时；ＮａＣＩ，２００

ｍｍｏｌ／ｔＮａＣＩ处理３小时：Ｄｒｙ，自然

十燥３小时：ＡＢＡ．５０Ｕｍｏ仉ＡＢＡ处理３小时．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１３ｌｌＩｄｕｃｔｉｏａｏｆｔｈｅＡｔｆｆＬｌ唧ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｅｅｄｌｉｎｇｓｇｒｏｗｎ

ｉｎ

ＧＭ（ｇｃａ＇ｍｉｎａｔｉｏｎ

ｍｅｄｉｕｍ）ａｇａｒ

ｐｌａｔｅ＊ＷＣｌｔ＿ｃ

ｔｒｅａｔｅｄ

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ

ｕｎｄｅ

ｃｏｌｄ（４℃），２００

ｍｍｏｌ／ｌ

ＮａＣＩ，ｄｒｏｕｇｈｔ

ａｎｄ５０ｌｕａｏｌａＡＢＡｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ｆｏｒｔｈｒｅｅｈｏｕｒｓ．ＴｏｔａｌＲＮＡ（３０ｔａｇ）

Ｗｉｔｓ

ａｎａｌｙｚｅｄ

ｂｙ

ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇ

ｔｈｅ

ＡｔｌＴＬＩ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ

ｐｒｏｂｅ．Ｅｔｈｉｄｉｕｍ

ｂｒｏｍｉｄｅ－ｓｔａｉｎｅｄ

ｒＰ．ＮＡ

ｂａｎｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｓｆｏｒ

ｅｑｕａｌｌｏａｄｉｎｇＨ２０，ｎｏ

ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．

陈其军：结果与分析（～）

５，２干旱和ＡＢＡ对ＡｔｌＴＫ基因的诱导强于高盐和低温

既然编码１，３，４．三磷酸肌醇５／６－激酶类似物的ＡｔＩＴＬｌ基因受胁迫诱导，我们推测

编码１，３，４一三磷酸肌醇５／６一激酶的ＡｔｌＴＫ基因也可能受胁迫诱导。为了证实这一想法，

我们利用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了ＡｔＩＴＫ基因的ｅＤＮＡ，并以其为探针，分析ＡｔｌＴＫ基因在

正常和胁迫条件下的表达情况。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析表明，高盐、低温、干旱及ＡＢＡ处

理均诱导该基因的表达，干旱和ＡＢＡ对该基因的诱导强于高盐和低温（图３．１４）。

图３．１４ＡｔｌＴＫ基因的Ｎｏ，ｈｅｍＢＩｏｔ分析

Ｈ２０，未经胁迫处理；ｃｏｌｄ，４１２处理３小时；ＮａＣＩ，２００ｍｍｏｌ／Ｉ

ＮａＣＩ处理３小时：Ｄｒｙ，自然干燥

３小时：ＡＢＡ，５０

ｐｍｏｌ，ｑ

ＡＢＡ处理３小时．图Ａ，５．２中使用的杂交膜洗脱探针后以Ａｔ／ＴＫｃＤＮＡ为

探针再次杂交。图Ｂ，为新的杂交膜杂交的结果．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－］４Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｈｅＡｔｌＴＫ

ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ＦｉｇｒｕｅＡ，ｎｙｌｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅｉｓｔｈｅｓａｌｎｅ∞ｉｎ

ｆｉｇｕｒｅ

１３

ＦｉｇｕｒｅＢ，ｎｙｌｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅｉｓａｎｅｗ

ｏｎｅ

５．３ＡｔｌＴＬ２基因似乎不受高盐、干旱、低温及ＡＢＡ处理的诱导

将５．２中对ＡｔｌＴＫ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析时使用的尼龙膜的探针洗脱掉，以ＡｔｌＴＬ２

基因的ＣＤＳ为探针再次进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，结果没有杂交信号（图３．１５）。目前，

这一结果有待进一步确证。

图３－１５ＡｔｌＴＬ２基因的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

Ｂｌｏｔ分析

Ｈ２０，未经胁迫处理；ｃｏｌｄ，４℃处理３小时：ＮａＣＩ，２００ｍｍｏＨ

ＮａＣＩ处理３小时：Ｄｒｙ．自然干燥

３小时：ＡＢＡｔ５０ｐｍｏｌａＡＢＡ处理３小时．

Ｆｉｇｕｒｅ３－１５ＮｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＡｔｌＴＬ２９ｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｔｈｅ

ｎｙｌｏｎ

ｍｅｍｂｒａｎｅｂｌｏｔｔｅｄｗｉｔｈＲＮＡｉｓｔｈｅｓａｍｅ∞ｉｎ

Ｆｉｇｕｒｅ

１４

中国农业大学博士学位论文

６．编码１，３，４一三磷酸肌醇５１６－激酶类似物的所有３个拟南芥基因的启动子分析

６．１ＡｔｌＴＬＩ基因的５’区存在ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式作用元件

许多被胁迫诱导但不被ＡＢＡ诱导的基因在他们的５’区存在ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式作川元

件。我们对ＡｔＩＴＬＩ基因的５’区进行了分析，发现ＡｔＩＴＬｌ基因的５，区同样存在ＤＲＥ／ＣＲＴ

顺式作用元件。有趣的是，３个ＤＲＥ／ＣＲＴ中的２个位于推测的ＴＡＴＡｂｏｘ的下游，并

位于ＡｔｌＴＬＩ基因的５’非编码区内。此外，还发现一些其它的元件，例如ＭＹＢ

（Ｃ／ＴＡＡＣＮＡ／Ｇ）和ＭＹＣ（ＣＡＮＮＴＧ），但没有对ＡＢＡ起反应的Ｇ．ｂｏｘ和ＡＢＲＥ

（Ｔ／ＣＡＣＧＴＧＧ／ＴＣ）相关的元件（图３－１６）。

６．２在ＡｔｌＴＫ基因的５’区存在Ｇ－ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件

为了从基因结构上理解ＡｔｌＴＫ基因的表达模式，我们分析了ＡｔｌＴＫ基因的５’启动子区，

发现有两个离转录起始位点较近的Ｇ—ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件，有一个离转录起始位

点较远的ＤＲＥ／ＣＲＴ元件。此外，还存在～些ＭＹＢ和ＭＹＣ元件（图３－１７）。

６．３ＡｔｌＴＬ２基因５’区启动子的初步分析

ＡｔｌＴＬ２基因的５’－ＵＴＲ尚不清楚，我们对ＡｔｌＴＬ２基因的５’启动子进行了初步分析，

发现有一个Ｇ－ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件。此外，还存在一些ＭＹＢ和ＭＹＣ元件（图

３．１８）。

除兑车：结果‘Ｊ分析（‘）

８１９

ａｔｇａｇｔｔｇｇｇａａｇａｔｇａｇｔｔｃｔａｇｔｔａａｇｔｃａｃｔａａｇａａｔｇｔｇａｇｇａｃｇｔａｔｔｃｇｇａｇｇａｃｃａａａａａｇｃｔ

７４９

ｃａａａｇｔｔａａａｇｔｇａｔｇｔａｇｔａａｃｔｔａＥｃｃｇｔｔｔａｔａａａｇｇｇａａａｇａｃｇｔａｃｔａｔｔｔｔａａｇａｇｇａａｔｔｔｔｇ

６７９

ａａｇａａａｇｔｔａｃｃａａｔｔｔｔａａａａｔｔｔａａａａｇｔａｔｇｔｇａｇａｔｃｔｇｃｔｔｔｔｔｔｇａａａｔａａａａｔａａｔｔｔａｔｔａａ

６０９

ｇｔｃｔｔｔｔｔａｔａｃａｔａｇａａｔａｔａｔａｔｔｃｔｔｔｔｔａａｔｇａａａｔｔｃＬａｃｃｔａａｇｔｔｔｔａｔｔｃａｃａａａｃａｔｔｃａｃ

ＭＹＢ

５３９ｔａａｔａｔｃａｔｔｔａｔ出出ｔｔｔｇｇｔｃａｔａｔａａａｔａｇｔｔｇｔｔｇａｇｔｔｔｔｇａｔａａａｔｔｇａｔａａａａａａｔｔａ

ＭＹＢ

４６９ｔｔｔｔａｃｃｔａａｔａａａａｔｔａｔａｃａａａａａｔａｔｔａａｔｔｔｇｔｔｔｔｔｔｔｇｃ囡Ｌａｔｔａｔｔｔｇａａａｇａａａａｔｔ

３９９

ａｇｃｔａｃａｔｇａｔｔｔｔｃｔｃｃｔａａａａｃａｔｔｃａｔｔｔｔｇｃｇａａｔｔａｔａｔｃｔａａａａａａｔｔｔａａｔｃｇｔａｔｃｔｃａａａｃ

ＤＲＥ／ＣＲＴ＆ＭＹＢ

３２９ｔｔｇｔｃａａｔａｃａｔｔｇａｔｔｔｃａａａｔｃＥｃｇａｃ。ａａｃａａｋａａａｃｔｃｔｃｃａａａｃｔｃａａａｃｃａｇａ：ｃＢａｔｃｔａｔｃｔ

ＭＹＢ＆ＭＹＢＭＹＢ

２５９ａａｃａｔｔｔｔａａａａａａｔｔｃｏａａｃｃｔａｇａｔｃａｔｔｃａｃｇｔｔｃｔｔａａａ必ｔｃａｂａａｃｔａｌｇｃｔａｔａｔａ

一１８９

ｔｃｇｇｃｔｔｇｇｃｔｃａｇａｃａａａａａｔａａａａａａｇｔｇｃａｇｔｔｃｃａａｇａａｔａｔｇｔｔｃａａａｔｔｇｃａａ！ａｔａｃａｔｔｔｃｔ

ＭＹＢ

ＭＹＣＭＹＣ

－１１

９ｃａｔａａｔｔａａａａｃａｔｇｔｔｔｃｔｔｔａｃｃａａａａａａａａａａａａａａａａ函ｔａｇａｃａｃａｔａ匿≤五球ａ园

ＴＡＴＡ＋１

—４９昧ｃｃｃｔｃａｃｇｃｃ题五五丑ｔｔｃａｇａｏｃｔｃｔｃｃｃｔａｃｔｃｔｃｔｃａｔａａｏｃｃａｃｃｃｍａｔａｔｃⅢａ

ＤＲＥ／ＣＲＴＤＲＥ／ＣＲＴ

＋２２ｇ罐垂蚕蛩鳞黼黼鞲翁鬻链黧霪塑霆匿蠢萄黼ｇ涵ａｔ如曲ａ眦ｔｔｔａｃｔｃ。ｇｔｔｇｔｇａ

ｔ９２ａｉ蘸舔蟊溺鞴露窿鬻鬻黧露罄蘑纛镶鞲鸶霸ｉｉ融ｃｔｃ曲ｃｔｔ６ｃａｔａａｔｃｃｃｃａａａａｔｔｇ＿ｔｔｔ

＋ｊ６２ｃｇｔｔｇ昔ｔｔｆ螂酾ａ矗鞘ｇ乱

图３—１６ＡｆｔＴＬｌ的５。区分析

序列摘自ＡＬ０８０２５２的第５０３１至６０３０．经反向互补而来。加阴影的部分为ＡｔＩＴＬ７基因５ＵＴＲ

—ＡＹ０５０４０８）相应的基因组序列。加框的部分为ＴＡＴＡｂｏｘ，ＤＲＥ／ＣＲＴ．ＭＹＢａｎｄＭＹＣ元件。

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１６

Ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

５’ｒｅｇｉｏｎ

ｏｆｔｈｅＡＩｆＴＬ７

ｇｅｎｅ

Ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｉｓｒｅｖｅｒｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ

ｔｏ

ｔｈａｔｅｘｃｅｒｐｔｅｄｆｒｏｍＡＬ０８０２５２ｆｒｏｍｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ５０３１

Ｉｏ６０３０ＴｈｅｓｈａｄｅｄＤａｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅ

ｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ

ｔｏｔｈｅ５’ＵＴＲ

ｏｆＡｔｌＴＬｌｂ

ｍＲＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏＡＹ０５０４０８）ＴＡＴＡ

ｂｏｘ．ＤＲＥ／ＣＲＴ．ＭＹＢ

ａｎｄＭＹＣｅｌｅｍｅｎｔｓａｒｅｂｏｘｅｄＴｈｅ

ｓｈａｒｅｄＤａｎｓｏｆｔｗｏ

ｅｌｅｍｅｎｔｓａｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄ

ｂｙｓｈａｄｉｎｇ

中国农业人学博士学位论文

～８６０

ａａｃａａｔａａｔｃａｔａｔｔｔａｇａａａｔｃａａａｔｔｔｔｔｔａａａａａａｇａｇａａａｃｃｔａａｔｔｃａａｔａｔｃａｇｔｔａＥｔａｃａａｔ

一７９０

ａｔａｔａｔａｔａｃｃｔｔｃｃａａｇａｇｃｇａａｔｇｃａｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｃｃａａａｔｃｃｃａａａｃｔｃｇｇａｔｔｔｇｔｃｔａｃｔａｔｇ

ＤＲＥ／ＣＲＴ

一７２０ｔｃｃａｇｃａｇａｇａａａａｇｇａｇｃｔｔａｔｃａｔｃａｇｇａｃｔａａｇａｇｃｔａａａｇｃａｇｔｇａｇｃｇｔａｔｂ！竖！！Ｒｃｇｃｃｔｔｃａ

ＭＹＢ

一６５０ａｔｃｇｔｇｇａｔｔｔｃａｃｔｇａｔｇａａｔｃｃｇｔａｇａａｔ毡苎皇壁墨水ｇｔｔａａｔｇａｃｇｔｃａｃｃａｃａｇｇｃｇｃａｇｇｃｇａｔｇａ

ＭＹＣ

ＭＹＣ

一５８０ａａｇａａｃｏａｔ区§！玉ａａｃａａｔｇａａａｇｇａｃｃａｃｃｇｃｃｇｔａｇａａｃｔｇｃｔｔｔａｇａｇａｔｃＥｔｇａ６：ｉ讯ａ

ＭＹＢ

＿＿＿＿＿ｒ●●＿＿＿＿＿一

一５１０ｇｔｔｃｔｔｃｔｔ睦！皇璺ｇ！Ｉａｔｇａｇｇａｇｃｃａｔｃａｃｇａｃｇｇｃｇａａｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｇ‘ｇａａｇａｇａａｃｇｔｔｇ

一４４０

ａａｇｇａｃｔｔｔｇｃｇｃｇａａｇａａａａａｃｇｇｔａｇｃｃｇｇａｇａａａｇａａｔｔａｇｇｇｔｔｔａａｇｃａｇｃｔｃｇｃｔｔｔｔａｔａｃｃｔ

ＭＹＣ

一

一３３０ｔｇｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔ幽ｔａｃｃａａａｔｔｔｔａａｇａｏｇｔａｃｃａａａｔｔａａｇｃｇｔｔｔｇｃｇｔｔｔｇｃｇｔｃｔｇｃｇｔ

ＴＡＴＡＢｏｘ

ＭＹＢ

一２６０ｔｔｇａｇａｔｃｃａａａｔａｔｔｔａａｇｃｃｃａｔｇａａｃｋｋｇｇｃｃｃａｔａａｔａａｔｔａｔｇａａｇｃａａｔｃｇｔ！！！！ｇｆ

Ｇ—ｂｏ×／ＡＢＲＥ＆¨ＹＣＭＹＣ

一１９０ｔｃｃａｔｃｔａａｔｇａａａａａｇａｃｃｔａｇａｃｔｃｇｔｃｃｔｃｔｔｔｃｇｃａｃｇｃｔａ也！！鲢出ｔｃａａｃａｔｔｃｇｃｂ型

Ｇ—Ｂｏｘ／＾ＢＲＥ＆ＭＹＣ

一１２０ｃａｔｃｔｔｃａｃａｃｇｔａｃｃａａｔａｔｔｃｇａｔｔｃｃａ睦！鲢出ａｃａａｃａｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｇｔｔａｔｔｔｃａｔｃｔ

＋１

－５０

ｃｔａｇａａａａｇｇｇｃａｃａａａａａａｃｃａａａｃｔｔｔａｃｇａｔｔｔｃｔｃｃｔｃｔｃｔｇｇａａｔｇｔａｔｇａｔｃｔｃｔ＋２１溺黼斓戮鬻麟辫黼翁黻黼斓黼麟麟黼鍪黼戮黼黼ｇｃｔｔｇａａｃｃｔ

＋９１§镶瓣霞漆黼黼纛黼滋谶黼燃鬻黼裁瀵粼罐瀚浚舔浚魄黼舔镦ｔｇｔｔａｃｃｔｔ。ｇ

＋１６１ｄａｉｂｇ≮鞘潞《籀黼ｉ

图３一１７』ｆ，７Ｋ的５’区分析

序列摘自ＡＬ３９１１４７的鹕４２９６０至４３９５９碱基。加阴影的部分为ＡｔｌＴＫ基吲５’ＵＴＲ（ＡＪ００１７５３）相

』、ｔ的皋㈨组序列。加框的部分为Ｇ－ｂｏｘ，ＤＲＥ／ＣＲＴ，ＭＹＢａｎｄＭＹＣ元件．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１７

Ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

５’ｒｅｇｉｏｎ

ｏｆｔｈｅ

ＡＨＴＫｇｅｎｅ

Ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｉｓ

ｅｘｃｅｒｐｔｅｄ

ｆｒｏｍＡＬ３９１１４７ｆｒＯｍｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ４２９６０ｔｏ４３９５９

ＴｈｅｓｈａｄｅｄＤａｎｓ

ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅ

ｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅ

５’ＵＴＲｏｆＡｔｌＴＫｍＲＮＡｒａｃｃｅｓｓｉｏｅＮｏＡＪ００１７５３）

ＴＡＴＡ

ｂｏｘ．ＤＲＥ，ＣＲＴ．Ｇ－ｂｏｘ

ａｎｄＡＢＲＥ—ｒｅｌａｔｅｄ

ｅｌｅｍｅｎｔｓ。ＭＹＢ

ａｎｄＭＹＣｅｌｅｍｅｎｔｓａｒｅｂｏｘｅｄ

陈其军：结果与分析（一）

ａｃｃａｃｔａａａａａａｇａｔｔｔｇｇｔｇａｃｇｔａａｔｔａｃｓｔｃａａｔｃａｔｃｇａａｓｔｔｔｃｔａａｃｔｔｔｔａｃａａｃｃｃｃａａｇｇｃ

ＭＹＣ

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ａｔｇｇｃｔａｔｔｔａｃａｓｔｔｔｔｇａｔｇｓｔａｓｔｃａｔｇｃｔａｃａｃａａａｔｔｔａｃａａｇｔａｃｔｇｃｔｃｓｔｔｔａｃｔｇｔａｃｔｇｃ

ＭＹＢ

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ｔａｔｔａａ柏ｔａｃｔｃａａａａｔａｃｇａｔｔｔｓｔｃａｓｔｃｔａｔｔｇａｔｓｔａｔｔｔｇａｔｇｔａｇａａｇｔａａｓｔｇｔａａｔｔｃａｃｔ

Ｇ－Ｂｏｘ

ＭＹＣａａａａａｇａｇｇｇａａａａａａａａａｃｇａｇｇａｇａａｔ５；；ｊ；ｉｉ玉ａａｃｔａｔａｇＣＣｇｃｔｔｔｔｔａｓｔｓｔａｔｔｔｇａ因

ｔａａａａａａａａａａａａｓｔａｔａｔａｔａｓｔｔｔｔａａｔｔｔｔｓｔｔｇｔｃｇｃｔｔｓｔａｃｔｔｔｔｃａａｇｔｔｇｃｔｔｇｔａａｔａｔｇｇ

ｔｔｔｃａｔｃｔｔｇａｇａａａａａａａａａａａｃａｇａａａｇａｇａａａａｔａｃａａｔａａａｔｇｔａｔｔｃａｇａａａａｇａａｇａａｔａａｃｃａ

ａａａａａａｇｃａｇｃａａａｔｃｔｔｔｇｇｇａａｃｇａｃｃａｔｓｔｃａｃｔｓｔａｇｃａｔｃｔｓｔｔｔｔｔｃｔｇｃａａａｔｔａｔｔｃｔｃ［］

ＴＡＴＡ？

ＭＹＣｉｌｉｉｉ；；；面ａｔｔｔｇａｔｃａｔｃａｇａｃｃａａｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃａａＩｊ；ｊｌｊｉ蛩ｔｃａｔｃｔｃａｔｃｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｔｔｇｃ

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ＴＡＴＡ？ｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔ因ｃｃｓｔｔｔｃｔａｔｔｅａｔｓｔｔｔｕｇａｃｔｃｔｔｇｃｔｔＣＣｇｇｃｇａａａｔｃｇａａａｃｔｇｃｃａｇａ

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ｇａｔｔｃｇａａｇｇｇｇａａａａｃａｔｇ

图３－１８ＡｔｌＴＬ２的５’区分析

序列摘自ＡＬ０３１３９４的第２９６６４至３０６６３碱基．经反向互补而来．加框的部分为Ｇ．ｂｏｘ。ＭＹＢａｎｄＭＹＣ

元件．

Ｆｉｇｕｒｅ

３－１８

Ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

５’ｒｅｇｉｏｎ

ｏｆｔｈｅＡｔｌＴＬ２

ｇｅｎｅ

Ｔｈｅ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｉｓｅｘｃｅｒｐｔｅｄ仃Ｄｍ

ＡＬ０３１３９４

ｆｒｏｍｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ２９６６４ｔｏ３０６６３．ＴＡＴＡｂｏｘ．Ｇ·ｂｏｘ

ａｎｄ

ＡＢＲＥ－ｒｅｌａｔｅｄ

ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＭＹＢ

ａｎｄＭＹＣｅｌｅｍｅｎｔｓｅｒｅｂｏｘｅｄ．

陈其军：结果与分析（二）

第四章实验结果与分析（二）

７个拟南芥胁迫诱导基因片段的克隆

为了分析ＡｔＩＴＬｌａ和ＡＵＴＫ基因在胁迫反应中的功能，我们创建了超表达ＡｔｌＴＩ伯

的转基因烟草和转基因拟南芥（见实验结果与分析的第四部分），正在创建超表达ＡｔＩＴＫ

的转基因烟草和拟南芥。为了深入研究上述基因的功能，除了以这些转基因植物为材

料研究相应的基因在胁迫反应中的生理功能外，还需要分析上述基因超表达后对其它

胁迫反应基因表达的影响。为此目的，我们克隆了７个胁迫诱导基因的片段。这７个

胁追诱导基因分别是：ＲＤ２９Ａ，ＲＤ２９Ｂ，ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６，ＫＩＮｌ。除

了ＲＤ２９Ｂ外，其它基因的启动子区都含有ＤＲＥ顺式作用元件。克隆的这些基因片段

可作为Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析时的探针，用于研究转基因拟南芥中ＡＵＴＬｌａ或ＡＵＴＫ超表

达后对这些胁迫诱导基因表达的影响。

１７个胁迫诱导基因片段的ＰＣＲ扩增

ＫＩＮｌ，ＲＤｌ７。ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６，ＲＤ２９Ｂ六个基因片段以拟南芥基因组

ＤＮＡ为模板进行扩增，ＲＤ２９Ａ基因片段以ＲＤ２９Ａ的基因组序列为模板进行扩增（含

有ＲＤ２９Ａ基因的质粒来自日本的Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ实验室）。ＫＪＮｌ，ＲＤ２９Ａ，ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，

ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６和ＲＤ２９Ｂ等片段的预期大小分别为：２２８，１３８１，５７３，５８３，３９８，２７９，

８５３

ｂｐ。

图４．１７个胁迫诱导基因片段的ＰＣＲ扩增

泳道Ｉ为ＤＮＡ分子量标准，泳道２～８分别为Ｋ／ＮＩ，ＲＤ２９Ａ．ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６

和ＲＤ２９Ｂ等７个基因片段的扩增结果．

Ｆｉｇｕｒｅ

４－ｌＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ∞ｖｅｎ

ｆｒａｇ／／”ｎｔｓｏｆｓｔｒｅｓｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅ

ｇｅｎｅｓ

Ｌａｎｅ１ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＤＮＡ

ｍａｒｋｅｒｓ；Ｌｓｎｃｓ

ｆｒｏｍ２ｔｏ８ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ｏｔ

Ｋｍｌ．ＲＤ２９．４。ＲＤｌ

７。ＥＲＤＩＯ。ＣＯＲｌ５．ＣＯＲ６．６ａｎｄＲＤ２９Ｂ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

７１

中国农业大学博士学位论文

从图４－ｌ可以看出，图中电泳条带单一，亮度很好，说明扩增效果很理想。从ＰＣＲ

产物大小来看，与预期片段大体上是吻合的，但与ＤＮＡ分子量标准比较，扩增产物的

大小与预期大小相比有一定的出入，这可能与琼脂糖凝胶的分辨率不够有关，也可能

与电泳时的上样量等因素有关。

２７个胁迫诱导基因片段的克隆及鉴定

圈４－２７个胁迫诱导基因片段的克隆策略

Ｆｉｇｕｒｅ

４－２

Ｃｌｏｎｉｎｇ

ｓｔｒａｔｅｇｙｏｆ．∞ｖｅｌｌ自ａＩ舯协ｏｆｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｇｅｎｅｓ

为了将ＰＣＲ扩增产物构建到ＳＫ载体上（图４－２），在设计ＰＣＲ引物时，引入适当

的酶切位点。扩增Ｋ／Ｎ１，ＲＤ２９Ａ，ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６和ＲＤ２９Ｂ基因片

段的引物引入的酶切位点分别为：脚抖棚，Ｈｉｎｄｌｌｌ，Ｘｈｏｌ，ＥｃｏＲｌ，ＨｉｎｄｌｌＩ，ＥｃｏＲＩ和

西盯。将ＰＣＲ产物回收、酶切、再回收，与酶切后的ＳＫ质粒连接，转入大肠杆菌进

行蓝白班筛选。挑取白色单菌落摇菌提质粒进行分子量大小及ＰＣＲ鉴定。

从图４．３上可看出，与对照的ＳＫ质粒相比，２、３、４、５、６、７、８、９号质粒都

有不同程度的滞后。这说明它们可能含有外源插入片段。泳道７的情况比较特殊，比

陈其军：结果与分析（二）

预期的阳性质粒大很多。对其进行ＰＣＲ鉴定发现，它含有目的序列。推测可能是两个

ｓＫ质粒相连后，再连接目的片段造成的。对７号阳性质粒进行酶切，发现酶切下来的

片段与目的片段的大小是吻合的。回收酶切的片段，重新连接转化，得到９号阳性克

隆，泳道９就是从该阳性克隆的质粒，它的大小与预期的相符。

分别以７种阳性质粒为模板，进行ＰＣＲ扩增鉴定。ＰＣＲ鉴定结果如图４—３所示。

比较图４－３与图４－１的结果，可以看出相应的ＰＣＲ扩增片段的大小是一致的，ＰＣＲ扩

增结果表明被鉴定的质粒是阳性的。

圈４－３阳性质粒分子量大小及ＰｅＲ鉴定

图Ａ．阳性质粒的分子量大小鉴定．泳道１为ＳＫ对照质粒。泳道２～８分别为含ＫＩＮＩ．ＲＤ２９Ａ，

ＲＤｌ７．ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５。ＣＯＲ６．６和ＲＤ２９Ｂ基因片断的ＳＫ质粒．泳道９为另一含ＣＯＲ６．６基因片

断的ＳＫ质粒．图Ｂ，阳性质粒的ＰＣＲ鉴定．泳道Ｉ为ＤＮＡ分子量标准，泳道２～８分别为７中阳

性ＳＫ质粒的ＰｅＲ扩增结果．

Ｆｉｇｕｒｅ４－３Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ

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Ｆｉｇｕｒｅ

Ａ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ

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１

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ＲＤ２９Ｂ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｌａｎｅ

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ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅ

ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

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Ｆｉｇｕｒｅ

Ｂ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ

ｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

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ｂｙ

ＰＣＲ．Ｌａｎｅ１ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＤＮＡ

ｍａｒｋｅｒｓ；Ｌａｎｅｓ

ｆｒｏｍ２ｔｏ８ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｔｈｅ

ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ｏｆｔｈｅＫＩＮＩ，ＲＤ２９Ａ，ＲＤｌ■ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６

ａｎ

ＲＤ２９Ｂ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

３阳性质粒的序列分析

为了进～步确证克隆的ＰＣＲ扩增片段是我们需要的目的片段，对上述阳性质粒的

插入片段进行了序列分析。序列分析送交公司完成。由于ＲＤ２９Ａ基因片段是从包含

中国农业大学博士学位论文

ＲＤ２９Ａ基因的质粒扩增而来，假阳性的可能性极小，因此没有克隆的ＲＤ２９Ａ基因片

段进行序列分析。以下是６种基因片段即ＫＩＮＩ，ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲｄ６和

ＲＤ２９Ｂ的序列分析图谱。序列分析结果表明，我们克隆的基因片段是我们需要的目的

片段（图４－４）。

图４．４阳性质粒插入片段的序列分析图谱

圈Ａ￣Ｆ分别为ＫＩＮＩ，ＲＤ２９Ａ．ＲＤｌ７，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５．ＣＯＲ６．６和ＲＤ２９Ｂ基因片断序列分析

图谱．

Ｆｉｇｕｒｅ

４－４Ｔｈｅｃｏｌｏｒ

ｍａｐｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ¨ａ岍ｉｓｏｆｉｎｓｅｒｔｉｏｎ

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ＦｉｇｕｒｅｓｆｒｏｍＡｔｏＦｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅ

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ｔｈｅｆｈ镕ｍ∞协ｏｆＫＩＮＩ，ＲＤ２９Ａ。ＲＤｔＴ，ＥＲＤＩＯ，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６，６ａｎｄＲＤ２９Ｂ

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

——————————————————堕苎兰！笙墨量坌堑！三！

第五章实验结果与分析（三）

融合蛋白在大肠杆菌中的表达、分离纯化及抗体制备

１ＡｔｌＴＬｌａ基因原核表达载体的构建

圈５－ｌ

原核表达载体ｐＥＴ．３０ａ（＋）的质粒图谱及多克隆位点的序列

Ｆｉｇｕｒｅ

５‘１Ｖｅｃｔｏｒ

ｍａｐ

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ｇｔｇｔｔｃｇｔｔａｇｔａａｔｃｇａａｇｃｔｔｔｔｃｃｇｇｔｇａａｇａａａｔｃｃａｔｔａｔｔｇｔａｇｇｔｔａｃｇｃｔｃｔｔａｃａｔｃａａａｇａａｇａｔｔａａ

ｇａｇｃｔｔｔｔｔａｃａａｃｃａａａａｃｔｃｇａａｇｇｔｔｔａｇｃｔａｇｐａｔａａｇｇｇｇａｔａｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｃａａｔａｇａｔｃａｇａａｔａａｇｃｃ

ａｃｔｔｔｃａｇａｇｃａｇｇｇｔｃｃｇｔｔｔｇａｔａｔｔｇｔｇｔｔｇｃａｔａａｇｃａａａｔｔｇｇａａａａｇａａｔｇｇｃｇｔｃｇａａｔｔｃｔｃｇａｇｇａａｔｔ

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ｔｃａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｇｇａｃａｔｇａａｔｃｔｇｔｃｔｇａｔａｇｔａａｔｇｇａｃｇｃｇｔｔｇｇｔｇｔｇｃｃｃａａｇｃａａｔｔｇｇｔａａｔｔａａａａａｇｇａ

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ａａｇｔｇｃａａａｇｔｃａｃａｔｇａｇｃｔｔｔｃｇｃｔｇｇｃｔｔａｃｇａｔｃａａｃａｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇａａｇｃｔｃｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃａ

ｇｇａｇｔｔｔｇｔｔａａｃｃａｔｇｇａｇｇｔｇｔｔｃｔｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔａｃａｔｔｇｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｔａｔｔａｇａｇｔｔｇｔｃｃｇｇｃｇｃｔｔｃｔｃ

ｃｃｔａｃｃｔｇａｔｇｔｃｔｃｔａｇａｃｇａｇａａｃｔｃｃｃｃａａａｔｃａｇｃｔｇｇｔｇｔａｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｃａｃｇｇｇｔｃｔｃｔｔｇｔｇｃｔｇｃａｇｃ

ｔｔｃａｇｃｔｇａｔｇａｔｇｃａｇａｔｃＣｇｇａｃｃｃｇａｇｃａｔｔｇｃｃｇａｇｃｔｔｃｃａｃｃａｃｇｔｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａｇａｇａｃｔｇｇｃａａａｇｇａ

ａｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｇｔｃｔａａｇｇｃｔｇｔｔｃａａｔｔｔａｇａｃａｔａａｔｔａｇａｇａｇｃａｃｇｇｇａｃａａｇａｇａｔｃｇｇｔｔｔｔａｔｇｔ

（Ｂ）

陈其军：结果与分析（三）

图５－２

ＡｌｌＴＬｌａ融合蛋白的氨基酸序列

髑Ａ，ＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡ在ｐＥＴ－３０ａ（＋）上的插入位点序列．图Ｂ。融合基因的开放阅读框序列．图Ｃ

融合蛋白的氨基酸序列．

Ｆｉｇｕｒｅ

５－２Ｔｈｅａｍｉｎｏ

ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ＦｉｇｕｒｅＡ．ｔｈｅｐａｒｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｏｆｐＥＴ－３０ｓ（＋）ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡｗａｓ

ｉｎｓｅｒｔｅｄ．Ｆｉｇｕｒ

Ｂ，ｔｈｅ

ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ

ｆｒａｍｅｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎ

ｇｅｎｅ．ＦｉｇｕｒｅＣ。ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄ

ｓｅｑｕｅｎｃ

ｅｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏ

ｐｒｏｔｅｉｎ

匿５．３原核表达载体的构建

图Ａ，ｐＥＴ－３０ａ（＋）的双酶切（ＢａｍＨｌ和Ｓｓｃｌ）。泳道ｌ为未酶切的质粒对照。泳道２、３为酶切的

质粒．图Ｂ，携带有ＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡ的ｐＧＥＭ－Ｔ载体的双酶切，泳道ｌ为ＡｔＩＴＬｌａ的ＰＣＲ扩增产物对

照．泳道２为Ｔ载体的酶切结果．圈Ｃ．酶切后的ｐＥＴ－３０ａ（＋）质粒及酶切后的ＡｔｌＴＬＩａｃＤＮＡ的回收纯

化产物．泳道１为Ａｔ盯Ｌｌａ

ｅＤＮＡ。泳道２为ｐＥＴ－３０ａ（＋）．图Ｄ，阳性质粒的大小鉴定．泳道Ｉ、２为

两个阳性质粒，泳遒３为原质粒．图Ｅ，阳性质粒的ＰＣＲ鉴定．泳道ｌ、２为两个阳性质粒的ＰＣＲ扩

增结果，泳道３为ＡｆｌＴＬＩａ的ＰＣＲ扩增产物对照．

Ｆｉｇｕｒｅ

５－３

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｏｆｐｍｔｎｋａｒｙｏｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ

ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒＡｔｌＴＬＩｓｅＤＮＡ

Ｆｉｇｕｒｅ九ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｖｃｃｔｏｒｓｃｕｔｂｙ

ＢａｍＨＩａｎｄＳｓｃｌ．ＬａｃｅＩｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｉｎｔａｃｔｖｃｃｔｏｒｓ∞ｃｏｎｔｒｏｌ

Ｌａｎｃｓｆｒｏｍ２

ｔｏ３

ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔ

ｂｙ

ｔｈｅ

ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｂ，ｔｈｅ

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ｗｉｔｈ

ＡｔＩＴＬＩａ

ｃＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｃｕｔｂｙｔｈｅｅｎｚｙｍｅｓ．ＬａｎｅｌｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰｅＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆｔｈｅＡｔｌＴＬｌａａｓｃｏｎｌｒｏｌ；Ｌｓｎｅ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅ∞狮ｅ

ｃｕｔｔｉｎｇ

ｏｆｔｈｅＴ

ｖｅｃｔｏｒｓ．ＦｉｇｕｒｅＣｔｈｅ

ｒｅｃｏｖｃＤ，ｐｒｏｄｕｃｔｓ

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ｐＥＴ－３０“＋）ｖｅｃｔｏｒｓ

ａｎｄ

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ｅｎｚｙｍｅｓ．ＬＩｌｌｅ

ＩｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＡｔｌＴＬＩａ

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２

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｐＥＴ－３０ａ（”ｖｅｃｔｏｒｓＦｉｇｕｒｅＤ＇ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓ

ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔｏｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｗｅｉｇｈｔ

ｏｆｔｈｅｖｅｃｔＯｒｓＬａｎｅｓｆｒｏｍｌｔｏ２ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｔｗｏ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓ；Ｌａｎｅ

３ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｏｒｉｇｉｎａ

ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｏｕｔｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓＦｉｇｕｒｅＥ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓｔｈｒｏｔｌｇｈＰＣＲＬａｎｅｓ１

ａｎｄ

２ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆｔｗｏ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃ“）ｒｓ；Ｌａｎｅ

３ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡ

ｃｏｎｔｒｏｌ

中国农业大学博士学位论文

为了阐明ＡｔｌＴＬｌａ的生化功能，首先需要获得ＡＵＴＬｌａ基因的表达产物蛋白，然

后对其进行活性分析。另外，尽管Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析的结果表明，ＡｔｌＴＬｌａ受胁迫诱

导，但不能肯定其表达产物蛋白的水平与其转录水平是一致的。我们创建了超表达

ＡｔｌＴＬｌａ的转基因烟草及转基因拟南芥，尽管可以用在转录水平上对转基因植物中

ＡｔｌＴＬｌａ基因的表达情况进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析，但不能肯定超表达的ＡｔｌＴＬｌａ基因

后能否翻译成蛋白。为此，需要进行Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析。而要进行Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析，

首先需要获得ＡＵＴＬｌａ的表达产物蛋白，进而制备抗体。为此，我们构建了原核表达

载体，诱导表达和分离纯化了融合蛋白，并制备了相应的抗体。

图５—１显示我们使用的原核表达载体的图谱及多克隆位点序列。原核表达载体

ｐＥＴ·３０ａ（＋）（图５－２）及带有ＡＵＴＬｌａ

ｃＤＮＡ（５’和３’端分别引入了ＢａｍＨＩ和Ｓａｃｌ酶

切位点）的ｐＧＥＭ－Ｔ载体分别用ＢａｍＨＩ和Ｓａｃｌ双酶切，相应的酶切片段经琼脂糖电

泳回收纯化后进行连接反应（图５－３）。阳性克隆经ＰＣＲ鉴定后送交公司测序。从图

５—２可知，融合蛋白中前５０个氨基酸由ｐＥＴ－３０ａ（＋）编码，其中含有６个组氨酸标签，

剩下的３３８个氨基酸由ＡｔｌＴＬｌａ

ｃＤＮＡ编码。融合蛋白的分子量约４３ＫＤ（ＭＷ＝

４３３５１）。之所以没有在融合蛋白的Ｃ末端也挂上组氨酸标签（需要去掉Ａｆ『丁Ｌ伯ｃＤＮＡ

的终止密码子），是为了避免重新合成引物（原有的用于构建真核表达载体的引物带有

终止密码子）。

我们还构建了ＡｔｌＴＫ的原核表达载体。ＡＵＴＫ的ＰＣＲ扩增产物经ＢａｍＨＩ和Ｓａｃｌ

双酶切后，构建到经ＢａｍＨＩ和Ｓａｄ双酶切的ｐＥＴ－３０ａ（＋）载体上。阳性载体经ＰＣＲ

鉴定后送交公司测序。测序结果表明我们成功地构建了ＡｔＩＴＫ的原核表达载体。

２融合蛋白的诱导表达、分离纯化及抗体制备

将阳性质粒转化到大肠杆菌表达菌ＪＭｌ０９·ＤＥ３株系中，用ＩＴＰＧ进行诱导表达，

从图５－４中可以看出，在４３与６６ＫＤ之间有一条加粗的蛋白带，应该是融合蛋白。

融合蛋白比预期的４３ＫＤ的分子量稍大。

融合蛋白的纯化按Ｑｉａｇｅｎ公司的产品说明书进行。细菌沉淀用ＢｕｆｆｅｒＢ裂解后，

离心取上清，上清过Ｎｉ·ＮＴＡ亲和柱．随后分别用ＢｕｆｆｅｒＣ和ＢｕｆｆｅｒＤ洗涤亲和柱。

最后用Ｂｕｆｆｅｒ

Ｅ洗脱。从图５－５中可以看出，融合蛋白的洗脱峰在ＢｕｆｆｅｒＥ洗脱物的

第２和３管。合并洗脱峰，按考马斯亮兰染色法测量蛋白浓度为０．８

ｍｇ／ｍｌ。兔抗血清

由有关技术人员代为制备。抗体效价在１０３～１０。．之间。

陈其军：结果与分析（三）

图５－４融合蛋白的诱导表达

泳道１和２为带有阳性ｐＥＴ－３０ａ（＋）质粒的表达菌的总

蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳．其中，泳道ｌ为ＩＰＴＧ诱导前

的蛋白ＰＡＧＥ电泳，泳道２为ＩＰＴＧ诱导后的蛋白

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳．泳道３为蛋白分子量标准，６条带的分

子曩自上而下分别为：９７、６６、４３、３１、２０、１４。泳道

为带有ｐＥＴ－３０ａ（＋）空质柱的表达菌在ＩＰＴＧ诱导后的蛋白

ＰＡＧＥ电泳．箭头示融合蛋白所在的位置。

Ｆｉｇｕｒｅ

５－４

Ｔｈｅｆｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄ

ｉｎＥｃｏｌｉ

ＬａｎｅＩａｎｄ２ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅＳＤＳ·ＰＡＧＥｏｆｔｏｔａｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

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ｐｏｓｉｔｉｖｅｐＥＴ－３０ａ（＋、

ｖ∽Ｉｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅ

Ａ“ＴＬｌａ

ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ．Ｌａｎｅ１

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈ

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ｐｒｏｔｅｉｎｓｎｏｔｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙＩＰＴＧ；Ｌａｎｅ２

ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅＳＤＳ·ＰＡＧＥｏｆｔｈｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｙＩＰＴＧ；Ｌａｎｅ

３

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｌｌｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓ：９７，６６，４３，３１，２０，１４

ｆｒｏｍ

ｕｐ

ｔｏｄｏｗｎ。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｌａｎｅ

４ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰＡＧＥ

ｏｆｔｏｔａ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ

ｉｎＥｃｏ／ｉｃａｒｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅ

ｎｅｇａｔｉｖｅ

ｐＥＴ－３０“＋）ｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ

Ｔｈｅ８，ｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ

ｏｆｔｈｅｆｕｓｉｇｎ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

图５．５融合蛋白的分离纯化

泳道１为过Ｎｉ－ＮＴＡ柱前的蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．泳道２为ＢｕｆｆｅｒＢ的洗脱物，泳道３为ＢｕｆｆｅｒＣ的洗

脱物，泳道４为ＢｕｆｆｅｒＤ的洗脱物，泳道５～１０分荆为ＢｕｆｆｅｒＥ的洗脱物．箭头示融合蛋白所在的位置。

Ｆｉｇｕｒｅ５－５

Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ

ｃｏｌｉ

Ｌｌｕｌｅ１ｉｎｄｉｃａｔｅ

ｔｈｅＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅ

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ｂｕｆｆｅｒ

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ｆｌｏｗｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈ

ｔｈ

Ｎｉ－ＮＴＡ

ｃｏｌｕｍｎｓ；Ｌａｎｅ

２ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｅｌｕａｔｅｓｏｆｔｈｅ

ｂｕｆｆｅｒ

Ｂ：Ｌｓｎｅ

３ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｅｌｕａｔｅｓｏｆｔｈｅｂｕｆｆｅｒ

Ｃ；ｔａ／ｌｅ

４ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｅｉｎｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｂｕｔｉｅｒＤ：Ｉ．．１Ｕｌｅｓｆｒｏｍ５ｔｏ１０ｉｎｄｉｅ．ｕｓｔｈｅｅｌｕａｔｅｓｏｆｔｈｅｂｕｆｉｅｒ

Ｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｔｈｅａｌｌｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ

ｏｆｔｈｅｆｕｓｉｏｎ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ．

陈其军：结果与分析（四）

第六章实验结果与分析（四）

转基因烟草和拟南芥的获得及功能分析

１３５Ｓ－ＡｔｌＴＬｌａ转基因表达载体的构建

图６－１３５Ｓ．ＡｆｌＴＬＩａ转基因载体的构建流程示意图

Ｆｉｇｕｒｅ

６－１Ｓｃｈｅｍｅｓ

ｏｆｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ

ｏｆⅡａｎｓｆｏｒｍｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒ３５Ｓ·ＡｄＴＬｌａ

ｇｃｎｅ

为了研究ＡｔＩＴＬｌ，ＡｔＩＴＫ和ＡｔＩＴＬ２基因在胁迫反应中的功能并对这些基因的组织

器官定位进行研究，我们首先构建了ＡｔＴＩＬｌａ的两种转基因载体：ＡｔｌＴＬｌａ单个基因的

转基因载体和ＡｔｌＴＬｌａ·ＧＦＰ融合基因的转基因载体。图６－１是３５Ｓ－Ａ“ＴＬｌａ转基因载

体的构建流程示意图，图６－２显示载体的构建及鉴定的有关结果：ｐＢｌｌ２１载体及包含

ＡｔｌＴＬｌａ目的片段的ｐＧＥＭ—Ｔ载体的酶切、回收以及连接、转化后阳性质粒的ＰＣＲ鉴

８ｌ

中国农业大学博士学位论文

定及酶切鉴定。经ＰＣＲ和酶切鉴定为阳性的质粒送交公司测序。序列分析表明，载体

构建正确。

图６－２３５Ｓ－ＡｔｌＴＬＩａ转基因载体的构建

图Ａ，ｐＢｌｌ２１转基因载体的双群切（Ｂａｍｌ－ｉｌ和Ｓａｃｌ）．泳道Ｉ为未酶切质粒对照ｌ泳道２、３、

为酶切质粒的电泳结果．圈Ｂ。１＂－戴体（带有ＡｆｌＴＬＩａｅＤＮＡ）的双酶切（ＢａｍＨＩ和Ｓａｃｌ）．泳道１为

ＡｔｌＴＬｌａ的ＰＣＲ产物（对照）ｔ泳道２为Ｔ．载体的酶切结果．图Ｃ，酶切的转基因载体及酶切后的ＡｔｌＴＬｌａ

ｃＤＮＡ片段回收纯化产物的电泳．泳道１为ｐｅＩｌ２１筑体酶切大片段的回收产物，泳道２为ＡｔＩＴＬＩａｅＤＮＡ

的酶切回收产物．圈Ｄ．阳性戴体的ＰｅＲ鉴定．泳道１为ＡｔｌＴＬＩａ的ＰＣＲ扩增产物对照；泳道２为阳

性质粒的ＰｅＲ扩增结果．图Ｅ，阳性载体的酶切鉴定．泳道１为ＡｔｌＴＬｌａ的ＰＣＲ扩增产物对照；泳道

２为阳性载体的双酶切（ＢａｍＨｌ和Ｓａｃｌ）结果；泳道３为未酶切载体对照．

Ｆｉｇｕｒｅ

６－２Ｓｃｈｅｍｅｓｏｆｃ∞ｓ咖ｃｔｉ鸭ｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒ３５Ｓ－ＡｔＩＴＬＩａ

ｇｅｎｅｓ

ＦｉｇｕｒｅＡ，ｐＢＩｌ２１

ｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔ

ｂｙ

ＢａｍＨｌａｎｄＳａｃＩ．ＬｓｆｌｅＩｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｏｒｉｇｉｎａｌ

ｖｅｃｔｏｒｓ；Ｌａｎｅｓ

ｆｒｏｍ２

ｔｏ４ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｖｅｃｔｏｒｃｕｔｂｙ

ＢａｍＨＩａｎｄ

Ｓａｃ．ＦｉｇｕｒｅＢ．ｔｈｅｐＧＥＭ－Ｔ

ｖｅｃｔｏｍｗｉｔｈＡｔＩＴＬｌａｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｅＬＩ

ｂｙ

ＢａｍＨｌａｎｄＳａｄ．Ｌｌｕｍ１ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆＡｔｌＴＬｌａａｓｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌ８［１ｃ

２ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ｐＧＥＭ－Ｔ

ｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔｂｙＢａｍＨｌ

ａｎｄ

Ｓａｃｌ．ＦｉｇｕｒｅＣ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

ｒｅｃｏｖｅｒｙ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ｐＢｌｌ２

（Ｌａｎｅ１）ａｎｄＡｔｌＴＬｌａｃｕｔｂｙＢａｍＨｌａｎｄ

Ｓａｃｌ（Ｌａｎｅ２）．ＦｉｇｕｒｅＤ’ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅ

ＶｃｃｃＯｒｓ

ｔｈｒｏｕｇ

ＰＣＲＬｓｎｅＩ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｅｓ

ｏｆＡｔｌＴＬｌａａｓｃｏｎｔｒｏｌ；ｋｃ２ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓｏ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓ．ＦｉｇｕｒｅＥ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓｔｈｒｏｕｇｈｅｌｌｚｙｎｋ

ｃｕｔｔｉｎｇ．Ｌｓｎｅ

１ｉｎｄｉｃａｔｅｓＰＣ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆＡｔｌＴＬｌａ

ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌａｎｅ

２ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｐｏｓｋｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔｂｙＢａｍＨＩａｎｄ

Ｓａｃｌ；Ｌａｎｅ３ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅｉｎｔａｃｔ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

Ｖｅ．Ａ’ｔｏｒｓ．

陈其军：结果与分析（四）

２３５Ｓ－ＡｔｌＴＬｌａ．ＧＦＰ转基因表达载体的构建

Ｎｍ

Ｋ肌ｉｃｓｉｍａｌｌｔ

Ｎｏｓｐｒｏｍｏｔｅｒ

８岬Ⅻ１磐’５ｅ。ｌ【．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一

ｌ

ＡｔＩＴＬＩａ

１０Ｉ７

ＫｍＲｓｉｓｌａｎｔ

图６－３３５ｓ．ＡｔｒｒＬｌ｝ＯＦＰ转基因载体的构建流程示意图

Ｆｉｇｕｒｅ

６－３Ｓｃｈｅｍｅｓｏｆｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍ

ｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒ３５Ｓ．ＡｔＩＴＬｌａ．ＧＦＰｆｕｓｉｏｎ

ｇｃｎｃ

图６－３是３５Ｓ－ＡｔＩＴＬｌａ－ＧＦＰ转基因载体的构建流程示意图。不同于３５Ｓ－Ａ＇，ＷＬ；ａ

转基因载体的构建之处是：ＡｔｌＴＬｌａ的酶切片段来自于ＰＣＲ产物（３’端引入新的酶

切位点Ｋｐｎｌ）的酶切。图６－４显示载体的构建及鉴定的有关结果：ｐＢｌｌ２１载体及

ＡｔｌＴＬｌａ目的片段的酶切、回收以及连接、转化后阳性质粒的ＰＣＲ鉴定及酶切鉴定。

经ＰＣＲ和酶切鉴定为阳性的质粒送交公司测序。序列分析表明，载体构建正确。

中国农业大学博士学位论文

圈６－４３５Ｓ·ＡｔｌＴＬＩａ－ＧＦＰ转基因载体的构建

图Ａ，ｐＢｌｌ２１·ＧＦＰ转基因载体的双酶切（ＢａｍＨｌ和Ｋｐｎｌ）．圈Ｂ，ｐＢＩｌ２１－ＧＦＰ载体酶切大片段的

回收产物．图Ｃ，ＡｔｌＴＬｌａｃＤＮＡ的酶切回收产物．圈Ｄ。阳性载体的ＰＣＲ鉴定．泳道１为阳性质粒的

ＰＣＲ扩增结果．泳道２为ＡｔＩＴＬＩａ的ＰＣＲ扩增产物对照．图Ｅ－阳性载体的酶切鉴定．泳道１为ＡＵＴＬＩａ

的ＰＣＲ扩增产物对照；泳道２为阳性载体的双酶切（ＢａｍＨｌ和Ｋｐｎｌ）结果．

Ｆｉｇｕｒｅ

６－４Ｓｃｈｅｍｅｓ

ｏｆｃｏｎｓｌｒｕｃｔｉｎｇ

ｏｆｌｒａｎｓｆｕｒｍｖｅｃｔｏｒｓｆｕｒ３５Ｓ－ＡｔＩＴＬＩａ－ＧＦＰｆｕｓｉｏｎ

ｇｅｎｅｓ

ＦｉｇｕｒｅＡ．ｐＢＩｌ２１－ＧＦＰｖｅｃｔｏｒｓｃｕｔ

ｂｙ

ＢａｍＨＩａｎｄ

ＫｐｎｌＦｉｇｕｒｅ

Ｂ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｏｆｔｈｅ

ｒｅｃｏｖｅｒｙ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ｐＢＩｌ２１－ＧＦＰ

ｃｕｔｂｙ

ＢａｍＩ－ＩＩａｎｄ

Ｋｐｎｌ．Ｆｉｇｕｒｅｃ，ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

ｏｆ

ｔｈｅ

ｒｅｃｏｖｅｒｙｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ＡｆｌＴＬｌａＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓｃｕｔｂｙ

ＢａｍＨｌ

ａｎｄ

Ｋｐｎｌ．ＦｉｇｕｒｅＤ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｖｃｃｔｏｒｓｔｈｍｕｇｈＰＣＲ

ＬａｎｅＩｉｎｄｉｃａｔ∞ｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖｅｃｔｏｒｓ；Ｌａｎｅ２ｉｎｄｉｃ，ｅｔｅｓ

ｔｈｅＰＣＲ

ｐｒｅｄｕｃｔｅｓｏｆＡｔｌＴＬｌａａ

ｃｏｎｔｒｏｌ；．Ｆｉｇｕｒｅ

Ｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｖｅｃｔｏｒｓｔｈｒｏｕｇｈ

ｃｎｚｙｍｅｃｕｔｔｉｎｇ．Ｌａｎｃ

１ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ＰＣ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆＡｔｌＴＬｌａａｓｃｏｎｔｒｏｌ；ｌａｍｅ

２ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｖ∞ｔｏｒｓｃｕｔｂｙ

ＢａｍＨｌａｎｄ

Ｋｐｎｌ．

３３５Ｓ制ＴＫ转基因表达载体的构建

３５Ｓ－ＡｔｌＴＫ转基因表达载体的构建策略类似于３５Ｓ－ＡｔｌＴＫ转基因表达载体的构建，

两个表达载体所用的酶切ｐＢｌｌ２１质粒大片段是一样的。ＡｔｌＴＫ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物用

ＢａｍＨＩ和Ｓａｃｌ双酶切，构建到表达载体上。经ＰＣＲ鉴定后送交公司测序。序列分析

表明，载体构建正确。

４超表达ＡｔｌＴＬｌａ的转基因烟草的获得及其功能的初步分析

４．１叶盘法转化烟草

将上述构建好的阳性质粒ｐＢＩＴＬｌａ转化ＬＢ４４０４农杆菌株系，获得阳性农杆菌

陈其军：结果与分析（四）

阳性农杆菌经ＰＣＲ鉴定后用于侵染烟草叶片。烟草转化采用叶盘法，烟草叶片取自无

菌苗。共培养三天后，转至分化培养基（ＭＳ培养基＋３ｍｇ／Ｌ

６．ＢＡ＋０

２ｍｇ／Ｌ

ＮＡＡ＋１００ｍｇ／ｍｌＫａｎ＋５００ｍｇ／ｍｌ

Ｃｂ）进行见光分化，约两周以后即可看到愈伤组织

产生，而大部分转化体则可以直接分化出抗性芽。抗性芽生长至２—３ｃｍ时，转到生根

培养基（ＭＳ培养基＋Ｋａｎ

１００ｍｇ／ｍｌ＋Ｃｂ５００ｍｇ／ｍ１）中诱导生根，约两周后即可生

出细嫩小根，逐渐成苗。由于幼苗生根时对卡那霉素非常敏感，此时适当提高Ｋａｎ的

浓度至１００—１２５ｍｇ／ｍｌ，可以降低转化体假阳性出现的频率，从而减少后续筛选的工

作量。诱导生根的小苗转移到土壤中繁种。单株收获转基因烟草的种子。

４．２转基因烟草的ＰＣＲ鉴定

我们首先对转基因烟草进行了ＰＣＲ鉴定。在３０个品系中总共鉴定了８个品系，

其中有７个品系经ＰＣＲ鉴定为阳性。另一个品系，用不同批次提取的基因组ＤＮＡ进

行ＰＣＲ扩增，均表现为阴性结果。图６－５显示其中的３个品系的ＰＣＲ鉴定结果。

图６．５转基因烟草的ＰＣＲ鉴定

图Ａ，野生型烟草及３个转基因烟草品系的基因组总ＤＮＡ．泳道Ｉ为野生型，２～４分别为１、

２、３号转基因品系．图Ｂ，转基因烟草的ＰＣＲ鉴定结果．泳道Ｉ为野生型，２～４分别为１、２、

号转基因品系，泳道５为Ａｆｔ＇ＩＬｉａ的ＰＣＲ扩增产物对照．

Ｆｉｇｕｒｅ６－５ｌｄａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

ｔｏｂａｃｃｏ

ｔｈｒｏｕｇｈ

ＰＣＲ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａ，ｔｈｅ

ｇｃｎｏｍｉｃ

ＤＮＡｓｏｆＷＴａｎｄ３ｔｒａｎｓｇａｎｉｃｌｉｎｅｓ．Ｌａｎｅ１ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

ＷＴ；ＬｓⅢｌｅＳｆｒｏｍ

２－４ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｌｉｎｅｓ

１，２，３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＦｉｇｕｒｅＢ，ｔｈｅ

ｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ

ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ

ｔｏｂａｃｃｏＬｏ／ｌ（：ｌｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅＷＴ，踟∞ｆｒｏｍ２－４ｉｎｔｌｉｃａｔｅｔｈｅｌｉｎｅＩ，２，３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｌａｎｅ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆＡｔＩＴＬｌａｃＤＮＡ．

４．３转基因烟草的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析

为了搞清楚转基因烟草是否表达ＡｔｌＴＬｌａ蛋白以及表达量如何，我们对转基因烟

草进行了Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果表明，３个转基因品系有免疫反应信号，而野生型

没有。说明Ａｔ／ＴＬｌａ在转基因烟草中得到正常表达（图６－６）。

中国农业大学博士学位论文

图６－６转基因烟草的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析

泳道ｌ为野生型，２～４分别为Ｔｌ·ｌ、Ｔ１．２、Ｔｌ－３号转基因品系．

Ｆｉｇｕｒｅ

６－６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｓ

Ｌａｎｅ

Ｉ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓ

ｔｈｅＷＴ＇Ｌａｎｅｓｆｒｏｍ２－４ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｔｈｒｅｅ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ

ｌｉｎｅｓ

ＴＩ－１，ＴＩ－２，ＴＩ·３

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

４．４转基因烟草Ｔ１代种子的Ｋａｎ抗性分析

为了进一步鉴定转基因烟草。对３个不同的转基因烟草品系的Ｔ１代种子进行了

Ｋａｎ抗性分析（图６－７）。

图６－７转基因烟草的Ｋａｎ抗性分析

ｗＴ为野生型，Ｔ１．１、ＴＩ．２、Ｔ１．３分别为３个转基因品系．

Ｆｉｇｕｒｅ６－７Ｋａｎ·ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｏｂａｃｃｏ

Ⅵ几ｗｉｌｄｔｙｐｅ；Ｔ１－１．Ｔ１－２ａｎｄＴｌ－３ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｔｈｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ

陈其军：结果与分析（四）

４．５转基因烟草的功能初步分析

我们对转基因烟草在胁迫条件下的表现进行了初步分析。１／４ＭＳ培养基上生长７

目的转基因或野生型烟草幼苗转移到含３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的１／４ＭＳ培养基胁迫处理３

天，之后转移到１／４

ＭＳ继续生长。１１天后照相（图６—８）。从图６—８中可以看出，与

野生型相比，３个转基因烟草品系对ＮａＣＩ胁迫处理表现得更为敏感。

图６－８转基因烟草的耐盐性分析

ｗＴ为野生型．Ｔ１·１、Ｔ１．２、”－３分别为３个转基因品系．

Ｆｉｇｕｒｅ

６－８Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｌｃｔｏｂａｃｃｏ

ｖ、几ｗｉｌｄｔｙｐｅ；Ｔ１－１．Ｔ１·２ａｎｄ”．３ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｔｈｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

５超表达ＡｔｌＴＬｌａ的转基因拟南芥的获得及其功能的初步分析

将上述构建好的阳性质粒ｐＢＩＴＬｌａ转化ＧＶ３１０１农杆菌株系，获得阳性农杆菌，

阳性农杆菌经ＰＣＲ鉴定后用于侵染拟南芥。拟南芥转化采用真空渗入法。收获拟南芥

Ｔ１代种子，在Ｋａｎ板上筛选抗Ｋａｎ的阳性苗。图６－９显示阳性苗筛选的部分结果。

ｐＢｌｌ

２１转基因载体的Ｔ－ＤＮＡ上带有抗Ｋａｎ的基因，因此基因组中整合了Ｔ．ＤＮＡ

的拟南芥转基因种子能在含有Ｋｅｎ的平板上正常生长，而野生型种子虽能萌发，但幼

苗不能正常生长，直至黄化枯死。将Ｋａｎ板上正常生长的１周龄苗移栽到土中繁育Ｔ２

代种子。Ｋａｎ板上筛选的每一株Ｔ１代阳性苗都作为一个转基因品系看待。单株收获

Ｔ２代种子，从中挑选一些品系经Ｋａｎ板筛选剔除没有Ｋａｎ抗性的Ｔ３代苗，继续进行

繁育。一部分Ｔ２代和Ｔ３代拟南芥种子用于进行生理功能的分析及其它方面的研究，

同时通过ＰＣＲ等方法对有关转基因品系进行检测，此部分工作仍在进行中。

中国农业大学博士学位论文

图６－９转基因拟南芥阳性苣的筛选

大约３，０００粒”代拟南芥种子铺于含５０ＰｇＫａｎ和５０Ｉｌｇｃｂ的ＭＳ琼脂板上．图Ａ是７日龄

拟南芥苗；图Ｂ是圈Ａ框中部分的放大圈．

Ｆｉｇｕｒｅ

６－９

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ

ｆｏｒ

ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆｔｒａｎｓｇｃｏｉｃ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

Ａｂｏｕｔ３，０００

ｇｒａｉｎｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｗｅｒｅ

ｓｐｒｅａｄ

ｏＲｔｈｅＭＳ

ａｇａｒｐｌａｔｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

５０

ｐ．ｇ

Ｋａｎａｎｄ

５

ｐｇＣｂ．Ｆｉｇｕｒｅ

Ａｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ７

ｄａｙ

ｏｌｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ＦｉｇｕｒｅＢ

ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｍａ鲷ｉｆｉｅｄｆｉｇｕｒｅ

ｏｆｔｈｅ

ｆｒａｍｅｄ

ｐａｒｔ

ｉｎ

Ｆｉｇｕｒｅ

Ａ．

我们对Ｋａｎ筛选表现为阳性的３个拟南芥转基因品系进行了初步的功能分析。拟

南芥野生型种子及３个拟南芥转基因品系的Ｔ２代种子播种于含１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的

ＭＳ平板上。在生长初期，野生型和转基因品系的表型之间没有可见的差异，４周后，

野生型开始表现变黄，直至枯死．图６—１０是在生长４３天的拟南芥幼苗。从图中可以

看出，尽管３转基因品系的幼苗在含１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的ＭＳ平板的生长大大受到抑

制，但比起野生型，３个转基因品系的幼苗仍然具有生活力。初步的实验表明，超表

达ＡＵＴＬｌａＣＤＳ的转基因拟南芥耐盐性增强。

陈其军：结果与分析（四）

图６－１０转基因拟南芥的耐盐性分析

、＾厂ｒ为野生型。Ｔ２－１、１２．２、Ｔ２－３分别为３个Ｔ２代的拟南芥转基因品系。

Ｆｉｇｕｒｅ

６－１０Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｔａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ＶＶＴ

ｗｉｌｄ

ｔｙｐｅ；Ｔ２－１．Ｔ２－２

ａｎｄＴ２－３ｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｔｈｒｅｅ

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

陈其军：文献综述

第七章讨论

１编码１，３，４一三磷酸肌醇５／６－激酶类似物的ＡｔｌＴＬｌ基因具有可变剪接方式

植物的胁迫耐受性是一个涉及多基因的复杂性状，尽管拟南芥整个基冈组的序列

测定已经完成，但对胁迫耐受性状的诸多决定因子进行功能上的鉴定仍然是～个巨大

的挑战。要想阐明复杂的胁迫信号传递网络，需要发现更多的参与胁迫信号转导的新

基因和功能未知的基因，并对他们在胁迫信号传递途径中的功能进行研究。本研究首

次报告１，３，４．三磷酸肌醇５／６．激酶类似物参与植物对逆境胁迫的反应。我们首先利用

ｍＲＮＡ差异显示技术筛选得到一个受盐诱导表达的拟南芥基因，该基因编码１，３，４．三磷

酸肌醇５／６一激酶（以下简称５／６一激酶）类似物，命名为ＡｔｌＴＬＩ。根据Ｂｌａｓｔ分析及我们

的实验结果，我们发现根据ｍＲＮＡ差异显示技术筛选得到的ＡｔｌＴＬｌ基因的前体ｍＲＮＡ

在靠近３’端有两种剪接方式。目前我们还不清楚ＡｔｌＴＬｌ基因前体ｍＲＮＡ的可变剪接

方式的生物学意义。在拟南芥中，７９％的核基因（１８％的质体和１２％的线粒体基因）包括

内含子，预计其它植物的基因也存在类似的情况”３。因此，准确而高效的剪接是植物及其

它真核生物中基因表达调控的关键特性。可变剪接现象的存在是内含子一外显子在结构上

相互作用的结果，是基因表达调控和产生多样性异构体的一个普遍机制。可变剪接能够导

致蛋白活性的修饰或删除，产生完全不同的蛋白活性，改变蛋白在细胞内的定位，影响ＲＮＡ

的稳定性和翻译效率。尽管在脊椎动物中，有一些著名的可变剪接的例子”４，但高等植物

中可变剪接的例子很少，已知能产生不同功能蛋白的可变剪接的例子更少。发表在今年

ｐｌａｎｔ

ｃｅｌｌ第４期的一篇文献，报告了促进开花的基因ＦＣＡ由于可变剪接方式而产生的４种

ｍＲＮＡ的不同功能”５。朱健康实验室通过分析￥ｏｓ４突变体发现了在盐胁迫耐受性中起

重要作用的ＳＯＳ４基因，该基因编码ＶＢ６激酶，参与ＶＢ６的合成。８０Ｓ４基因也有两种

剪接方式，产生的两种成熟ｍＲＮＡ相差１００个碱基。两种转录本的丰度受发育和环境

胁迫因素的不同调控”。我们在对ＡｔｌＴＬｌ基因的表达进行反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ

分析时，均没有发现存在明显的２条杂交带。可能的原因是：由于两种成熟ｍＲＮＡ相

差仅仅７６个碱基，在我们的Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析没有将两者分开；也有可能是只有一种

转录本受诱导表达，至于是ＡｔｌＴＬＩａ和ＡｔｌＴＬＩｂ两种转录本的哪一种，目前仍无法获知。

Ｂｌａｓｔ分析表明，拟南芥基因组中存在３个编码５／６．激酶类似物的基因：ＡｔｌＴＬ，ＡｔｌＴＫ

和ＡｔｌＴＬ２。我们用ＲＴ．ＰＣＲ的方法克隆了３个基因的ＣＤＳ并对３个基因的表达进行了

Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果表明，ＡｔｌＴＬＩ和ＡｔｌＴＫ基因在高盐、低温、干旱胁迫条件下及

９１

中国农业大学博士学位论文

ＡＢＡ处理条件下的表达模式呈现出互补的模式：一盯儿』受高盐和低温诱导，但不受十

早和ＡＢＡ诱导，而ＡｔｌＴＫ主要受干旱和ＡＢＡ诱导。分析推测的ＡｔｌＴＬＩ基因的５，启动

了区发现存在ＡＢＡ不依赖的ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式作用元件，但不存在对ＡＢＡ起反应的

Ｇ·ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件。分析ＡｔｌＴＫ推测的基因５’启动子区发现存在对ＡＢＡ反应

的Ｇ－ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件，５’启动子区结构特征与我们进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析发

现的表达模式是一致的。这些结果表明，编码５／６．激酶类似物的拟南芥基因家族的不

同成员分别参与了ＡＢＡ依赖的和ＡＢＡ不依赖的的胁迫信号传递途径。ＡｔｌＴＬ２基因似

乎不受环境胁迫诱导，提示ＡｔｌＴＬ２基因可能参与了其它的信号传递途径。

２５１６．激酶在植物、哺乳动物甚至原生虫中普遍存在并参与逆境胁迫反应

从植物到哺乳动物，甚至在原生虫均已证实具有编码５，６．激酶的基因”６。人和小牛

脑的５／６一激酶产生的１，３，４，６·四磷酸肌醇（Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４）和ｌ，３，４，５．四磷酸肌醇

（１ｎｓ（１，３，４，５）＾）的比例是３：ｌ；而拟南芥则相反”７。原生虫的５，６．激酶作用于１，３．４．

三磷酸肌醇（Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３）和ｌ，４，５－三磷酸肌醇（Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３）两种底物。当以Ｉｎｓ（１。３，４）Ｐ３

为底物时两种产物的比例为１：１，当以Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３为底物时，Ｉｎｓ（１…３４５）Ｐ４是唯一的产

物。最近的研究表明，人的５，６一激酶还具有３，４，５，６．四磷酸肌醇（Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４）１－激酶

的活性，即以Ｉｎｓ（３…４５６）１＇４为底物产生ｌｎｓＰ５１７８０而且，令人感兴趣的是小牛脑５，６一激

酶能磷酸化转录因子ｃ－Ｊｕｎ和ＡＴＦ－２，这是肌醇激酶具有蛋白激酶活性的第一例报告，

在此之前有研究表明以磷脂酰肌醇磷酸为底物的几个激酶具有蛋白激酶的活性”。同

一激酶具有两种活性，可以解释为同一激酶被不同刺激激活产生不同的活性，分解为

不同的信号传递途径１７９０转录因子ｃ－Ｊｕｎ和ＡＴＦ－２可被胁迫激活的蛋白激酶所磷酸化，

称为依赖于ＪＮＫ／ＭＡＰＫ的磷酸化途径。该蛋白激酶属于三个ＭＡＰＫｓ亚类中的一类，

在对渗透胁迫，ＵＶ射线和其它的胁迫条件反应中激活…ｏ“。５／６．激酶磷酸化受胁迫激

酶激活的转录因子ｅ－Ｊｕｎ和ＡＴＦ－２，表明５／６．激酶参与了胁迫反应途径。

同样令人感兴趣的是，在纯化小牛脑５／６．激酶过程中，发现ＣＯＰ９信号体和５／６一

激酶共沉淀，可能表明细胞内的５／６一激酶和ＣＯＰ９信号体存在一种相互作用的关系１７９。

ＣＯＰ９信号体最初是美国耶鲁大学的邓兴旺实验室在研究光形态建成突变体过程中发

现的。当ｃｑ矽突变体幼苗生长在暗处时表现出光生长形态学特性即组成性光形态建成

（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）。后来研究发现，ＣＯＰ９蛋白是一个大的蛋白复合

物（ＣＯＰ９信号体）的组成部分“２。ＣＯＰ９信号体由８条亚基组成，在结构组成上与２６Ｓ

蛋白酶体的盖亚基密切相关”３。ＣＯＰ９复合物在哺乳动物和高等植物中是高度保守的

陈其军：文献综述

１８４。ＣＯＰ９信号体在细胞信号转导和发育中的分子和生化特性已开始得到阐明。ＣＯＰ９

信弓体和２６Ｓ蚩白酶体的调控亚基的相似性提示两者在进化起源上密切相关。最近的

研究表明，在植物，哺乳动物和裂殖酵母中ＣＯＰ９信号体在泛素／蛋白酶体途径中发挥

作用１８５，１８６，１８７，１８８ｉ８９，１９０。在哺乳动物中，组成ＣＯＰ９信号体的亚基ＧＰＳｌ…和ＪＡＢｌｌ９２参与

转录因子ｃ．Ｊｕｎ的活性调节。总之，在哺乳动物中，５／６一激酶可能通过和ＣＯＰ９信号体

和ＪＮＫＪＭＡＰＫ途径相互作用参与胁迫信号转导。

原生虫的５／６一激酶基因受热击诱导，这再次表明５／６．激酶参与逆境胁迫反应途径

”“”９。我们的研究结果表明，拟南芥中５／６－激酶类似物也参与对逆境胁迫的反应，这

是植物５／６一激酶类似物参与对逆境胁迫反应的首例报告。此外，我们也克隆了编码５／６．

激酶类似物的水稻基因并对其进行了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析，结果同样表明，水稻５／６．激

酶基因受胁迫诱导（资料未显示）。在盐处理的冰革植物中也发现５／６．激酶类似物的存

在（在ＧｅｎＢａｎｋ上的登录号为ＢＥ０３７０４０）。

３拟南芥１，３，４－三磷酸肌醇５１６－激酶类似物在胁迫反应中的可能的作用机制

图７－１Ｉｎｓ（Ｊ，３，４）ＰＪ５／６－激酶在胁迫反应中的可能的作用模式

Ｆｉｇｕｒｅ

７－１Ｔｈｅ

ｐｏｓｓｉｂｌｅ

ａｃｔｉｏｎｍｏｄｅｏｆｌｎｓ（１，３，４）Ｐ３５／６一ｋｉｎａｓｅｉｎｓｔｒｅｓｓ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

如同哺乳动物５／６．激酶在胁迫信号转导途径中的作用，植物可能通过两个途径参

与胁迫信号转导，即磷酸肌醇信号途径和（或）蛋白激酶级联途径（图７－１）。磷酸肌

醇信号转导途径涉及一系列的磷酸肌醇激酶和磷酸肌醇磷酸酶，磷酸化和去磷酸化各

种口ｒ溶性的肌醇多磷酸盐。磷酸肌醇途径的一个分支点是产生Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３，Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３

９３

中国农业火学博士学位论文

被５／６·激酶磷酸化形成Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４和ｌｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４。Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４是形成更高级的肌

醇多磷酸（包括其它肌醇四磷酸盐的异构体，肌醇五磷酸，肌醇六磷酸及肌醇焦磷酸）

的第一个中间体”３’”４。ＩｎｓＰ５和ｌｎｓＰ６是细胞中含量最丰富的肌醇多磷酸盐，它们在动

物或植物细胞中的功能最近开始得到阐明。例如，在马铃薯保卫细胞中ＡＢＡ可以引发

］ｎｓＰ６的快速变化，ＩｎｓＰ。可以模拟ＡＢＡ和细胞内的Ｃａ２＋对内向Ｋ＋整合电流的抑制效

应，ＩｎｓＰ６的作用强于ＩＰ３，并且这种抑制作用是ｃａ２＋依赖的。这些结果提示，ｌｎｓＰ６在

保卫细胞对ＡＢＡ的生理反应中发挥着重要的作用１９５ｏ在哺乳动物中，Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３和Ｉｎｓ（１…３４５）Ｐ４可以作为信号物质１９４，１９６前者是５／６．

激酶的底物，后者和Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４一样是５／６．激酶的产物。在动物中，Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４及

其代谢产物ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３同ＩＰ３一样是较早被发现的肌醇多磷酸。Ｉｎｓ（１，３，４，５）１＇４主要是由

ＩＰ３３．激酶产生。后者是动物中最活跃的肌醇多磷酸激酶。在动物中至少存在３种ＩＰ３３．

激酶异构体，３种异构体均受钙调素调控，其中的２种还受钙／钙调素．依赖的蛋白激酶

ＩＩ（ＣａＭＫＩＩ，Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅＩＩ））调控。磷脂酶Ｃ耦合的受体

被激活后产生ＩＰ３，ＩＰ３

３．激酶在快速代谢ＩＰ３库方面发挥着重要的作用。在ｌＰ３３．激酶

代谢Ｊ玛库过程产生的Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４在进化中逐渐获得了功能。最近，ｌｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４的

生理功能在动物中开始得到阐明１９７０Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４能够被水解ＩＰ３的５．磷酸酯酶水解，

但５．磷酸酯酶对ｌｎｓ（１…３４５）ｎ比对Ｉｎ的亲和性高１０倍，最大反应速度Ｖｉｃａ。ｘ低１００

倍。因此，Ｉｎｓ（１…３４５ｍ能够保护ＩＰ３不被水解，提高ＩＰ３的有效性。如果用低剂量的、

促进Ｉ＾产生的兴奋剂处理细胞，接着清除兴奋剂，短时间后再次用兴奋剂处理细胞，

那么细胞质膜钙内流对第二次处理更敏感。原因是第一次刺激产生的Ｉｎｓ（１，３，４，５）ｐ４比

ＩＰ３存留时间更长（因为５．磷酸酯酶对前者作用的ＶｕＡｘ更低）。因此，Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４

的水平作为某个早期刺激的一个“记忆体（ｍｅｍｏｒｙ）”而持续存在一段时间。

Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４除了能够保护Ｉ玛不被水解外，还具有其它方面的功能，例如在内皮细胞

中有直接的证据”８，在神经细胞中有直接”和间接２”的证据，表明Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４能够

激活质膜上的钙通道。

最近的研究表明，人的５，６．激酶还具有ＩｎｓＯ，４，５，６）Ｐ４

１－激酶的活性”８，即以

Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４为底物产生ＩｎｓＰ５。ｌｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４在动物表皮细胞中是钙调控ｃ１．通道的抑

制剂。５，６．激酶可以通过将Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４磷酸化为ＩｎｓＰ５影响Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４对钙调控ｃｌ＿

通道的抑制作用。

综合动植物中肌醇信号传递途径的研究，我们提出５１６激酶在植物逆境胁迫信号转

陈其军：文献综述

导中的可能的作用机制包括：磷酸化Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３产生的Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ。保护Ｉ＾不被水解，

已知ＩＰ３参与胁迫信号的传递过程３７，１４８磷酸化Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３产生的Ｉｎｓ（１，３，４，５）Ｐ４和

Ｉｎｓ（１，３，４，６）Ｐ４，以及磷酸化Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ４产生的ｌｎｓＰ５，可以促进ｌｎｓＰ６的合成，产生的

ＩｎｓＰ６参与保卫细胞对ＡＢＡ或胁迫信号的反应”５；通过磷酸化Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ。调控

Ｉｎｓ（３，４，５，６）Ｐ一的生理功能（图７－１）。随着更多肌醇多磷酸盐在植物中的功能得到阐明，

编码５／６一激酶类似物的ＡｔｌＴＬｌ和ＡｔｌＴＫ在胁追信号转导途径的作用也将得到阐明。我

们正在从细胞学水平上探讨转基因植物对气孔变化的影响。我们还打算在培养基中添

加能透过细胞膜的Ｉｎｓ（１，３，４）Ｐ３替代物伺喂转基因烟草或拟南芥幼苗，研究其在正常或

胁迫条件下细胞学及生理学方面发生的变化。

拟南芥５／６－ｋｉｎａｓｅ也可能象哺乳动物５／６一激酶那样通过蛋白激酶级联途径参与胁迫

信号传递途径（图７－１）。因此，有必要研究５／６．激酶是否有蛋白激酶的活性，是否和

ＣＯＰ９信号体或其它蛋白复合物共沉淀。

尽管推测ＡｔｌＴＬＩ编码的蛋白类似于５１６－激酶，但ＡｔｌＴＬｌ是否具有５／６．激酶活性以

及ＡｔｌＴＬｌ和ＡｔｌＴＫ是否象哺乳动物中的５／６．激酶那样具有ｌ一激酶的活性和蛋白激酶的

活性都是值得深入研究的问题。我们构建了ＡｔｌＴＬＩａ和ＡｔｌＴＫ的原核重组表达载体，

得到了重组蛋白，有关工作正在进行中。

４ＡｔｌＴＬｌ在盐胁迫信号传递途径中的正调控或负调控作用

对转基因烟草进行的初步的功能分析表明，ＡｔｌＴＬｌａ超表达的转基因烟草幼苗对

盐胁迫更敏感。这些研究表明，ＡｔｌＴＬＩ可能象ＨＯＳ５４０那样在ＡＢＡ不依赖的渗透胁迫

信号传递途径中充当负调控因子的作用。从现有的遗传学研究结果来看，在胁迫信号

传递途径中发现的负调控因子多于正调控因子，例如ＬＯＳｌ，ＬＯＳ２，ＨＯＳ５，ＦＩＥＲＹｌ，

ＥＲＡＩ和ＡＢｌｌ／２。

另外一种可能是，ＡｔｌＴＬｌ可能象转录因子ＡＢＦ３和ＡＢＦ４那样在ＡＢＡ依赖的渗

透胁迫信号传递途径中充当正调控因子的作用。彳珊ｚＪ在烟草中的超表达激活或强化

了ＡＢＡ的信号转导途径。ＡＢＦ３和ＡＢＦ４能够与ＡＢＡ反应元件ＡＢＲＥ特异结合并激

活含ＡＢＲＥ元件的基因表达。ＡＢＦ３和ＡＢＦ４超表达的转基因拟南芥除对ＡＢＡ非常敏

感外，转基因植物也表现出其它方面与ＡＢＡ信号转导有关的现象。例如，在含１００

ｍｍｏｌ／ｌＮａＣＩ的培养基中，转基因与野生型及ＡＢＡ敏感性突变体相比，其种子萌发及

幼苗生长受抑制５７

０为了验证第２种可能性，需要对转基因烟草种子进行萌发实验，

中国农业大学博士学位论文

例如比较转基因种子和野生型种子在含１００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣＩ以及在含ＡＢＡ的ＭＳ平板上

的萌发及生长情况。

与烟草对盐胁迫更敏感相反，对转基因拟南芥耐盐性进行的初步分析表明，转基

冈拟南芥对盐胁迫的耐受性大大增强。推测产生上述两种相反结果的可能的原因有：

基因沉默或共抑制；Ｉ如的水平和持续时间。可能ｌ＾或其它参与胁迫信号转导的肌醇

多磷酸在转基因烟草中过量产生，超出了正常反应许可的范围（包括肌醇信号物质的

水平及持续时间），表现出与加，），Ｊ突变体类似的表型。在肛，）＇』突变体中，编码肌醇

多磷酸ｌ一酯酶的基因发生突变，该基因在ＩＰ３的代谢中起作用。在胁迫处理条件下，

ｆｉｒｅｒｙｌ突变体积累过多的Ⅱ、，导致突变体对胁迫反应更敏感”。转基因拟南芥对盐胁

迫表现出耐性，可以解释为，尽管ＩＰ３或其它参与胁迫信号转导的肌醇多磷酸在转基因

拟南芥中的含量增加，但这些信号物质的含量仍在正常反应许可的范围内（或者，这

些信号物质含量的增加，启动了其它不同的代谢ＩＰ３的反应机制，导致这些肌醇信号物

质在正常反应许可的范围内），并最终增强植物对逆境胁迫的反应。另外一个可能的

原因是转基因烟草中ＡｔｌＴＬｌ基因的超表达激活了ＡＢＡ信号转导途径，导致转基因烟

草幼苗表现出与ＡＢＦ３和ＡＢＦ４超表达的转基因拟南芥类似的表型”。而转基因拟南芥

中ＡｔｌＴＬｌ基因的超表达激活了ＡＢＡ不依赖的胁迫信号转导途径，最终导致与ＤＲＥＢＩＡ

超表达的转基因拟南芥类似的表型”．我们在下一步的实验中将对转基因烟草及拟南

芥进行详细的研究和分析，以期对ＡｔｌＴＬＩ基因的生化及生理功能得出更加合理的解释。

陈其军：结论

结论

１利用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选到一个受盐诱导的功能未知的基因。该基因编码

ｌ’３，４·三磷酸肌醇５／６－激酶类似物，命名为ＡｔｌＴＬｌ。ＡｔｌＴＬＩ基因的前体ｍＲＮＡ有

两种剪接方式，产生的两种ｍＲＮＡ或相应的ｃＤＮＡ被分别命名为ＡｔｌＴＬｌ口和

ＡｔｌＴＬＩｂ。我们通过ｍＲＮＡ差异显示筛选到的ｃＤＮＡ序列为ＡｔｌＴＬｌａ。拟南芥基因

组中包括ＡｔｌＴＬｌ在内共有３个基因编码５／６－激酶类似物。其中的一个基因已有文

献报告其编码的蛋白具有５／６－激酶活性，该基因被命名为ＡｔｌＴＫ。另一基因同

ＡｔｌＴＬｌ一样编码５／６．激酶类似物，被命名为ＡｔｌＴＬ２。

２扩增并克隆了拟南芥基因组中３个编码５／６－激酶类似物基因的ＣＤＳ。其中，ＡｔｌＴＬＩ口

和ＡｔｌＴＫ基因的ＣＤＳ序列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的序列一致，但ＡｔｌＴＬ２的ＣＤＳ序

列与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的ＣＤＳ序列有较大的差异。

３对拟南芥基因组中所有３个编码５／６－铡ｔ酶类似物的基因在胁迫条件下的表达进行了

Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果表明，ＡｔｌＴＬｌ基因除受盐诱导外，还受低温诱导，但不

受干旱和ＡＢＡ诱导；高盐、低温、干旱及ＡＢＡ处理均诱导ＡｔｌＴＫ基因的表达，

干旱和ＡＢＡ对该基因的诱导强于高盐和低温；ＡｔｌＴＬ２基因不受胁迫诱导。分析推

测的ＡｔｌＴＬＩ和ＡｔｌＴＫ基因的５’启动子区发现两者均存在不依赖于ＡＢＡ的

ＤＲＥ／ＣＲＴ顺式作用元件，在推测的ＡｔｌＴＫ基因的５，启动子区还存在对ＡＢＡ反应

的Ｇ－ｂｏｘ和ＡＢＲＥ相关的元件．

４分别构建了ＡｔｌＴＬｌａ和ＡｔｌＴＫ的转基因表达载体，并获得了ＡｔｌＴＬｌａ超表达的转

基因烟草和转基因拟南芥．对转基因烟草在胁迫条件下的表现型进行了初步的分

析。结果表明，转基因烟草幼苗对ＮａＣＩ胁迫更加敏感。对转基因拟南芥在盐胁迫

条件下的表现型也进行了初步的功能分析，结果表明，转基因拟南芥幼苗对ＮａＣＩ

胁迫的耐受性增强。

５构建了原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达了ＡｔＩＴＬｌａ的融合蛋白。利用分离

纯化的融合蛋白制备了抗体。利用制备的抗体对野生型和３个转基因烟草品系进

行了Ｗｅｓｔｅｒｎ

ｂｌｏｔ分析，结果表明转基因烟草中ＡｔｌＴＬｌａ蛋白得到正常表达。

６克隆了ＲＤ２９Ａ，ＲＤ２９Ｂ，ＲＤｌ７，ＥＲＤｌ０，ＣＯＲｌ５，ＣＯＲ６．６和Ｋ１Ｎ１等７个胁迫

诱导基因片段。

９７

陈其军：参考文献

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Ｊ．ＧｉｒａｕｄａｔＪ（１９９８）．Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ

ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ

Ｐｈｙｓｉ０１．Ｐｌａｎｔ

Ｍｏｌ

Ｂｉ０１．４９．１９９一－２２２．

２９ＭｃＣｏｕｒｔＰ（１９９９）．Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｈｏｒｍｏｎｅ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ０１．Ｐｌａｎｔ

Ｍ０１．Ｂｉ０１．

５０．２１垂－２４３．

３０ＲｏｃｋＣＤ（２０００）．Ｐａｔｈｗａｙｓｔｏａｂｓｄｓｉｃａｄ小幛ｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＮｅｗＰｈｙｔ０１．１４８．３５７－３９６．

３１Ｓｈｉ

Ｈ，Ｉｓｈｉｔａｎｉ

Ｍ．ＫｉｍＣ．ＺｈｕＪＫ（２０００）．Ｔｈｅ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａｓａｌｔｔｏｌｅｌｅｎｃａ

ｇｅｎｅ

Ｓ０ｓ１

ｅｎｃｏｄｅｓａｐｕｔａｔｉｖｅＮａ＋，Ｈ＋ｅｎｔｉｐｏｒｔｅｒ．Ｐ＾伪Ｓ．９７（１２）．∞９良∞１

３２Ｌｉｕ

Ｊ．ＩｓｈｉｔａｎｉＭ，ＨａｉｒｉｅｒＵ。Ｋｉｍ

ＣＳ．ｚｈｕＪＫ（２０００）．ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａＳＯＳ２

ｇｅｎｅ

ｅｎｃｏｄｅｓａ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅｔｈａｔｉｓ

ｒｅｑｕｉｒｅｄ

ｆｏｒｓａｌｔｔｏｌｅｍｎｃａ．尸＾埔Ｓ．９７（７）．３７３¨

３３Ｌｉｕ

Ｊ，ＺｈｕＪＫ（１９９８）．Ａ

ｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｏｒｈｏｍｏｌｏｇ

ｒｅｑｕｉｒｅｄ

ｆｏｒ

ｐｌａｎｔ

ｓａｌｔｔｏｉｅｒａｎｃａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．

２８０（５３７１）．１９４３－５

３４Ｓｈｉ

Ｈ．Ｘｉｏｎｇ

Ｌ．ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＢ．Ｌｕ

Ｔ

ＺｈｕＪＫ（２００２）．ＴｈｅＡｌｅｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｓａｌｔ

ｏｖｅｄｙ

ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ４ｍｕｔａｎｔｓ

ｕｎｃｏｖｅｒａｃｒｌｔｉｃｅＩ

ｒｏｌｅｆｏｒ’，Ｉ＿暗删ｎＢ６

ｌｎ

ｐｌａｎｔ

ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｐｌｅｎｔ

Ｃｅｌｌ，１４（３）．５７５－８８

３５

Ｘｉｏｎｇ

Ｌ。ＩｓｈｌｔａｎｉＭ。ＬｅｅＨ．ＺｈｕＪＫ（２００１）．ＴｈｅＡｌｅＭｄｏｐｓｉｓ

ＬＯＳ鼬惦＾３ｌｏｃｕｓ

ｅｎｃｏｄｅｓａ

ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ

ｃｏｆａｃｔｏｒｓｕｆｆｕｒａｓａａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｃｏｌｄ翻∞ｅｓ－ａｎｄｏｓｍｏｔｉｃ

ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１３（９）．２∞弛∞３

３６

Ｘｉｃｎｇ

Ｌ．ＬｅｅＨ．ＩｓｈｌｔｅｎｉＭ．ＺｈｕＪＫ（２００２）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｏｓｍｏｔｉｃ

ｓｔｌｅｓｓ－ｌｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｂｙ

ｔｈｅＬＯＳ６１ＡＢＡｌｌｏｃｕｓＩｎＡｍｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｊ

ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７７（１０）．８５８８．∞

３７

Ｘｉｏｎｇ

Ｌ．ＬｅｅＢ，Ｉｓｈ盼ｎｉＭ．ＬｅｅＨ．Ｚｈａｎｇ

Ｃ．ＺｈｕＪＫ（２００１）．ＦｆＥＲＷｅｎｃｏｄｉｎｇａｎｉｎｏｓｉｔｏＩ

ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ１－ｐｈｃｅｐｈｅｒａｓｅｉｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ

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ｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｉｎ

Ａｍｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，１５（１渤：１９７１－１∞４

３８ＩｓｈｉｔａｎｉＭ．ＸＩｏ旧Ｌ，ＬｅｅＨ．ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＢ．ＺｈｕＪＫ（１９９８）．ＨＯＳｌ．ａ∞ｎｅＵｃｌｏｃｕｓｉｎｖｏｌｖｅｄＩｎ

ｃｏｌｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓＩｏｎＩｎ

ａｌｅｂｉｄｏｐｓｔｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１０ｍ．ｔｔ５１－６１

３９ＬｅｅＨ．ＸｉｅｎｇＬ．Ｇｏｎｇ

Ｚ．１ｓｈｉｔｅｎＩＭ．ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＢ．ＺｈｕＪＫ（２∞１）．Ｔｈｅ

ＡｍｂｌｄｏｐｓｉｓＨＯＳ，ｇｅｎｅ

ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｃｏｌｄ蝴ｇｎａＩ

ｔｒａｎｓｄｕｃａｏｎａｎｄｅｎｃｏｄｅｓａＲＩＮＧ

ｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ

ｔｈａｔ

ｄｉｓｐｌａｙｓ

ｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ

ｎｕｄｅｏ－ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ．ＧａｎｅｓＤａｙ，１８（７）．９１２．２４．

４０

Ｘｉｏｎｇ

Ｌ，ＩｓｈｉｔａｎｉＭ．ＬｅｅＨ．ＺｈｕＪＫ（１９９９）．ＨＯＳ５－ａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆ

ｏｓｍｏｔｉｃｓｔｌｅｓｓ－ｉｎｄｕｃａｄ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｌｎ

Ａｍｂｉｄｏｐｓｌｓ

ｔｈａｌｉａｎａ．ＰｌａｎｔＪ．１９（５）．髑们８

４１Ｌｅｅ

Ｈ。Ｘｉｃｎｇ

Ｌ．ＩｓｈｌｔａｎｌＭ．ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＢ．ＺｈｕＪＫ（１９９９）．ＧｏＩｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ａｎｄ

ｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅＩｎａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ

ｍｕｔａｎｔ．ＰＩｅｎｔＪ。１７（３）．３０１·８

４２Ｑｉｎｘ，Ｚｅｓｖａａｒｔ

ＪＡＤ（１９９９）．Ｔｈｅ９－ｃ／ｓ－ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｄｅｅｖ８Ｉｇｅｌｅａｃｔｉｏｎｉｓｔｈｅ

ｋｅｙ

ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｔｅｐ

ｏｆａｂｓｄｓｉｃａｄｄ

ｂ｛ｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｗａｔｅｒ－ｓｔｌｅａｓｅｄ

ｂｅａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃｅｄ．ＳｃＩ．ＵＳＡ∞．１５３５４＿１５３６１．

４３Ｔｈｏｍｐｓｏｎ

ＡＪ．ＪａｃｋｓｏｎＡＣ．Ｓｙｒｎｏｎｄｓ

ＲＣ．Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ．刚．ＤａｄｓｗｅｌＩＡＲ．Ｂｌａｋｅ

ＰＳ．ＢｕｒｂｉｄｇｅＡ，

Ｔａｙｌｏｒ．ＩＢ（２０００）．Ｅｃｔｏｐｌｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆａｔｏｒｎａｔｏ９．－ｃｉｓ－ｅｐｏｘｙｃｅｒｏｔｅｎｏｉｄｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ

ｇｅｎｅｃａｕｓｅｓ

ｏｖｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｌｉｏｎ

ｏｆｅｂｓｄｓｉｃａｄｄ．ＰｌａｎｔＪ．２３．∞各３７４

４４Ｇｉｒａｕｄａｔ

Ｊ．Ｐｅｒｃｙ

Ｆ．ＢｅｒｔａｕｃｈｅＮ．ＧｏｓｔｉＦ．ＬｅｕｎｇＪ《１９舛）．ｃｕｒｒｏｎｔ

ａｄｖａｎｃｅｓｌｎ

ｅｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｃｔｉｏｎ

ａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｌｅｎｔ

Ｍ０１．Ｂｉｏｉ。∞．１５５７－１５７７

４５Ｇｕｉｉｔｉｎａｎ．ＭＪＷ．Ｍａｒｃｏｔｔｅ．Ｒａｎｄ０ｕａｔｌｅｎｏ，ＲＳ（１９００）．Ａｐｌａｎｔ

ｌｅｕｄＲｅ

ｚｉｐｐｅｒｐｒｏｔｅｉｎ

ｔｈａｔ

ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓａｎａｂｅｃｉｓｉｃａｄｄｒｏ坤ｏｎｓａｅｔｅｍｅｎｔ．Ｓｄｅｎｃｅ２∞．２盯·２７’

４６Ｓｈｅｎ．ＱｅｎｄＨｏ．Ｔ４－１．Ｄ．（伯９５）．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｄＩ鹞蜘晒ｏｎｏｆｅｎａｂｓｄｓｌｃａｃｉｄ（旭Ａ¨ｎｄｕｄｂｌｅｇｅｎｅ

ｒｅｖｅａｌｓｔｗｏ

ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＡＢＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓｅａｃｈ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａＧ－ｂｏｘａｎｄ

ａｎｏｖｅＩ

ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ

ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔｏ鲥７．２９５－３０７

４７Ｖａｓｉｌ．ｖ，Ｍａｒｃｏｔｔｅ，ＷＲ．Ｊｒ．．Ｒｏｓｅｎｋｍｎｓ．Ｌ．．Ｃｏｃｃｏｌｏｌｏｎｅ．ＳＭ．Ｖａｓｉｌ，ＩＫ．Ｑｕａｔｒａｎｏ．ＲＳａｎｄ

ＭｃＣａｒｔｙ，

ＤＲ（１９９５）．Ｏｖｅｒｌａｐ

ｏｆＶｉｖｉｐａｒｏｕｓｌ（ｖＰｔ）ｅｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｄｄｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅＥｍ

ｐｒｏｍｏｔｅｒ：

Ｇ－ｂｏｘｅｌｅｍｅｎｔｓａｌｅｓｕｆｆｉｄｅｎｔｂｕｔｎｏｔｎａｃｅｌｌｅ８ｒｙｆｏｒＶＰｌｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｅｏｎ．ＰｌａｎｔＣｅⅣ７．１５１１．１５１８

４８Ｍｅｎｋｅｎｓ

ＡＥ．ＳｃｈｉｎｄｌｅｒＵ．ＣｅｓｈｍｏｒｅＡＲ（１∞５）．ＴｈｅＧ·ｂｏｘ：Ａ

ｕｂｌｑｕＲｏｕｓ

ｒｅｇｕｉａｔｏｗ

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ｅｌｅｍｅｎｔ

ｉｎ

ｐｌａｎｔｓ

ｂｏｕｎｄ

ｂｙ

ｔｈｅＧＢＦｆａｍｌｌｙｏｆ

ｂＺＩＰｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｍｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．洲．２０．５０６－５１２

Ｉ∞

堕基兰：垄重苎蔓

４９ＢｕｓｋＰＫ．ＰａｇｅｓＭ（１９９８）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ｏｆａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｌａｎｔＭｏＩ

Ｂｉ０１．３７．

４２５—４３５

５０Ｕｎｏ

Ｙ．ＦｕｒｉｈａｔａＴ．ＡｂｅＨ．ＹｏｓｈｉｄａＲ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ·ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（２０００）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｂａｓｉｃＩｅｕｃｉｎｅ

ｚｉｐｐｅｒｔｒａｎｓｃｄｐｔｉｏｎ

ｆａｃｔｏｍ

ｊｎｖｏｌｖｅｄ

ｉｎ

ａｎａｂｓｃｉｓｉｃ

ａｃｉｄ＿ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｇｎａＩ

Ｖａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

ｐａｔｈｗａｙ

ｕｎｄｅｒ

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ａｎｄ

ｈｉｇｈ－ｓａｌｉｎｉｔｙ．ＰＮＡＳ．９７。１

１６３２～１１６３７

５１Ｃｈｏｉ

Ｈ．ＨｏｎｇＪ，Ｈａ

Ｊ．Ｋａｎｇ

Ｊ，ＫｉｍＳＹ（２０００）．ＡＢＦｓ．ｅ

ｆａｍｉｌｙｏｆＡＢＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｅｌｅｍｅｎｔ

ｂｉｎｄｉｎｇ

ｆａｃｔｏｒｓ．ＪＢｉｏＩ

Ｃｈｅｍ。２１．１７２３＿１７３０

５２Ａｒｅｎａｓ－Ｈｕｅｒｔｅｒｏ

Ｆ。Ａｒｒｏｙｏ

Ａ．ＺｈｏｕＬ，ＳｈｅｅｎＪ。ＬｅｏｎＰ（２０００）．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｌｕｃｏｓｅ

｝ｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｍｕｔａｎｔｓ．ｇｉｎ５

ａｎｄ

ｇｉｎ６，ｒｅｖｅａｌｓａｃｅｎｔｒａＩｒｏｌｅｏｆｔｈｅ

ｐｌａｎｔ

ｈｏｒｍｏｎｅＡＢＡｉｎｔｈｅ

ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

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ｐｌａｎｔｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

ｂｙｓｕｇａｒ．Ｇｅｎｅｓ

Ｄｅｖ．１４．２０８５－－２０９６

５３ＨｕＵｓｅｒＣ．Ｋｏｄｓｔｅｅ

Ａ．ＰｅｇｏＪ．Ｗｅｉｓｂｅｅｋ

Ｐ．Ｗｉｓｍａｎ

Ｅ．ＳｍｅｅｋｅｎｓＳ（２０００）．ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ＳＵＣＲＯＳＥＵＮＣＯＬ，魁ＥＤ－６９ｅｎｅｉｓｉｄｅｎｔｉｃｅＩｔｏＡＢＳＣＩＳＩＣＡＣＩＤＩＮＳＥＮＳＩ订ＶＥ－４：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆ

ａｂｓｃｉｓｉｃ

ｅｃｉｄ

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ｓｕｇａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｌａｎｔ

Ｊ．２３。５７７｛８５

５４Ｌａｂｙ

ＲＪ．ＫｉｎｃｅｉｄＭＳ．Ｋｉｍ

Ｄ．ＧｉｂｓｏｎＳＩ（２０００）．ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｓｕｇａｒ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ

ｍｕｔａｎｔｓｓｉｓ４

ａｎｄ

ｓｉｓ５

ａｒｅ

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ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ

ａｎｄ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｌａｎｔ

Ｊ．２３．５８７－５∞

５５

Ｌｅｕｎｇ

Ｊ。ＧｉｒａｕｄａｔＪ（１９９８）．Ａｂｓｃｉｓｉｃｅｃｉｄ

ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃ－ｔｉｏｎ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔ

Ｐｈｙｓｉｏｌ

ＰｌａｎｔＭｏＩ

Ｂｉ０１．４９．１９争．２２２

５６ＳｃｈｒｏｅｄｅｒＪＩ．ＫｗａｋＪＭ．ＡｌｉｅｎＧＪ（２００１）．ＧｕａｒｄｃｏｌＩａｂｓｃｉｓｉｃａｄｄ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｒｏｕｇｈｔ

ｈａｒｄｉｎｅｓｓｊｎ

ｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４１０．３２７－３３０．

５７

Ｋａｎｇ

Ｊ．ＣｈｏｉＨ，ＩｍＭ，ＫｉｍＳＹ（２００２）．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｂａｓｉｃＩｅｕｄＲｅ

ｚｉｐｐｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｔｈａｔｍｅｄｉａｔｅ

ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ａｂｓｄｓｉｃｅｄｄ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐ／ａｎｔＣｅｌｌ，１４．３４３＿七５７

５８

Ｋｏｏｍｎｅｅｆ

Ｍ，ＲｅｕｌｉｎｇＧ．ＫａｒｓｓｅｎＣＭ（１９８４）．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｂｓｃｉｓｉｃ

ａｃｉｄ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｕｔａｎｔｓ

ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ．ＰｈｙｓｉｏＩ

Ｐｉｅｎｔ．６１。３７７—３８３．

５９ＯｏｍｓＪＪＪ．Ｌ（１０ｎ－ＫｌｏｏｓｔｅｒｚｉｅＩⅢ．ＢａｒｔｅｌｓＤ．ＫｏｏｍｎｅｅｆＭ．ＫａｒｓｓｅｎＣＭ（１９９３）．Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆ

ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ

ｔｏｌｅｒａｎｃｅｅｎｄ

ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ

ＩｎＩＮ，ｅｄｓ

ｏｆＡｒｅｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉｅｎａ．Ａ

ｃｏｍｐａｒａ．ｒｉｖｅｓｔｕｄｙｕｓｉｎｇ

ａｂｓｃｉｓｉｃ

ｅｃｉｄ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅ埘ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ

Ｐｈｙｓｉ０１．１０２．１１８５－１

１９１

６０ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＲＲ（１９９４ａ）．Ｍｕｔａｆｉｏｎｓａｔｔｗｏ

ｎｅｗＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｅＩｏｃｉａｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅ曲『３

ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ

Ｊ．５．７６５＿７７１

６１Ｎａｍｂａｒａ

Ｅ，ＫｅｉｔｈＫ．ＭｃＣｏｕｄ

Ｐ。ＮａｉｔｏＳ（１９９５）．Ａ

ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

ｒｏｌｅ

ｆｏｒｔｈｅＡＢｌ３

ｇｅｎｅ

ｉｎｔｈｅ

ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉｅｎａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２１．６２争＿６３６

６２ＣｕｔｌｅｒＳ．ＧｈａｓｓｅｍｉａｎＭ．Ｂｏｎｅｔｔａ

Ｄ。Ｃｏｏｎｅｙ

Ｓ．ＭｃＣｏｕｒｔＰ（１９９６）．ＡｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｅｓｙＩ

ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ

ｉｎｖｏｌｖｅｄ

ｉｎ

ａｂｓｃｉｅｉｏｅｃｌｄ

ａｉｇｎａＩ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

ｊｎＡｍｂ／ｄｏｐｓ／ａ．Ｓｄｅｎｃｅ．２７３。１２３９－１“１

６３Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ

ＲＲ．ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅＣＲ（１９９０）．Ｔｈｌｅｅｃｌａｓｓｅｓｏｆａｂｓｃｉｓｉｃ

ｅｄｄ（＾Ｂ＾卜｛ｎｓｅｎｓｎｉｖｅｍｕｔａｆｉｏｎｓ

ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｄｅｆｉｎｅ

ｇｅｎｅｓ

ｔｈａｔ∞ｎｔｒｏＩ

ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ

ｓｕｂｓｅｔｓ

ｏｆＡ８Ａ

ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ０１．９４．

１１７２—１１７９

６４ＰａｒｏｙＦ．ＶａｌｏｎＣ。ＲａｙｎａｌＭ．Ｇａｕｂｉｅｒ－ＣｏｍｅｌｌａＰ，ＤｅｔｓｓｎｙＭ。ＧｉｒｅｕｄａｔＪ（１９９４）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｐｒｏｇｒａｍｓｄｕｄｎｇＡｒａｂｌｄｏｐｓｉｓ

ｓｅｅｄ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｒｏｌｅｓ

ｏｆｔｈｅＡＢｌ３Ｉｏｃｕｓａｎｄｏｆ

ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ

ａｂｅｄｓｉｃａｄｄ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，６．１５６７－１５８２

６５Ｎａｍｂａｒｅ

Ｅ，ＫｅｉｔｈＫ．ＭｃＣｏｕｒｔ

Ｐ。ＮａｉｔｏＳ（１∞５）．Ａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

ｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅＡＢｌ３

ｇｅｎｅ

ｊｎｔｈｅ

ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｌｓｔｈｅｌｉｅｎａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ。１２１．６２９—８３６

６６Ｇｉｒａｕｄａｔ

Ｊ，Ｈａｕｇｅ

ＢＭ．ＶａＩｏｎＣ．Ｓｍａｌｌｅ

Ｊ．ＰａｒｏｙＦ。０００ｄｍａｎＨＭ（１∞２）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ＡＢｌ３

ｇｅｎｅｂｙｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｄｏｎｉｎｇ．ＰｌａｎｔＣｅＨ４．ｔ２５１－１２６１

６７ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＲＲ．ＷａｎｇＭＬ．ＬｙｎｃｈＴＪ。ＲａｏＳ．ＧｏｏｄｍａｎＨＭ（ｆ９９８）．ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ＩｏｃｕｓＡＢｌ４

ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰ目＿ＡＵ崆ｄｏｍａｉｎ

ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｌａｎｔ

Ｃｅｌｌ，１０．１０４３－１０５４

６８ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＲＲ．ＬｙｎｃｈＴＪ（２０００）．Ｔｈｏ

Ａｒａｂ／ｄｏｐ船ａｂｓｃｉｓｉｃａｒｉｄｒｅｓｐｅｎｅｅｇｅｎｅ

Ａ８『５ｅｎｃｏｄｅｓａ

ｂａｓｉｃＩｅｕｃｉｎｅ

ｚｉｐｐｅｒ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐＩｉｏｎ

ｆａｃｔｏｒ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１２．５９９－６０９

６９Ｐｅｉ圳．ＧｈａｓｓｅｍｉａｎＭＫｗａｋＣＭ．ＭｃＣｏｕｒｔＰ，ＳｃｈｒｏｅｄｅｒＪＩ（１蜘．Ｒｏｌｅｏｆｆａｍｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｅｅｉｎ

ＡＢＡｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｕａｒｄ

ｃｏｌｌａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｐｌａｎｔｗａｔｅｒＩｏ髓．Ｓｃｉｅｎｃｅ。２８２。２８７－２９０

７０ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎＲＲ（１９驯ａ）．ＭｕｔａｔｉｏｎｓａｔｔｗｏｎｅｗＡｒａｂ／ｄｅｐｓ／ｓＡ队ｒｅｓＩｘ）ｎｓｓｌｏｃｉｅｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅａｂｉ３

ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＰｌａｎｔＪ．５．７６５＿＿７７１

７１ＬｅｕｎｇＪ．Ｍｅ—ｏｔＳ．ＧｉｒａｕｄａｔＪ（１９９７）．１１１ｅＡｒｅｂｉｄｏｐｅｉｓＡＢＳＣｆｓ『Ｃ＾ＣｆＤ—ｆＭ｝￡＾『ｓ『ＴＩＶＥ２似Ｂ／２）ａｎｄ

＾８１１

ｇｅｎｅｓ

ｅｎｃｏｄｅｒｅｄｕｎｄａｎｔ

ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ

２Ｃｉｎｖｏｆｖｅｄｊｎａｂｅｃｉｓｉｃａｃｉｄ

ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ

Ｐ『ａｎｔＣｅｌｌ，９．７５９．－７７１

７２

Ｍｅｙｅｒ

Ｋ．ＬｅｕｂｅＭＰ．ＧｄｌＩＥ（１９９４）．Ａｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

２Ｃ

ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＡＢＡ

ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈｅｌｉａｎａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６４．１４５２－１４５５

７３ＢｅｒｔａｕｃｈｅＮ．ＬｅｕｎｇＪ．ＧｉｒｅｕｄａｔＪ（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓ－ｐｈａｔａｓｅａｃＩｉｖｉｔｙｏｆａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌ

（ＡＢｉｌ）ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＡｒｅｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａ／／ａｎｅ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ．２４１．１９３－－２００

１０ｌ

中国农业大学博士学位论文

７４Ｌｅｕｂｅ

ＭＰ．ＧｒｉｌＩＥ．ＡｍｒｈｅｉｎＮ（１９９８）．ＡＢｌｌｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｉｓａｐｒｏｔｅｉｎ

ｓｅｄｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

ｈｉｇｈｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄ

ｂｙ

ｔｈｅ

ｐｒｏｔｏｎ

ａｎｄ

ｍａｇｎｅｓｉｕｍ

ｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ

Ｌｅｔｔ．４２４。１００－１０４

７５Ｒｏｄ内ｕｅｚＰＬ．ＢａｎｎｉｎｇＧ．Ｇ枷Ｅ（１９ｅ８）．ＡＢｌ２．ａ

ｓｅｃｏｎｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｅ

２Ｃ

ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ

ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃ－ｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉａ．ＦＥＢＳ

Ｌａｔｔ．４２１．１８５＿１９０

７６ＶａｄａｎｉａｎＮ．ＭａｒｃｏｔｔｅＬ．ＧｉｒａｕｄａｔＪ（１９９４）．Ｄｒｏｕｇｈｔｒｈｉｚｏ－－ｇｅｎｅｓｉｓ

ｉｎ

ＡｒａｂＭｏｐｓｉｓ

ｔｈｅｆｆａＢａ．

ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａＩ

ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ

ｏｆｈｅｒ－ｍｏｎａＩ

ｍｕｔａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ

Ｐｈｙｓｉ０１．１０４．７６１—７６７

７７Ｇｏｓｔｉ

Ｆ．Ｂｅｄａｕｃｈｅ

Ｎ．Ｖａｒｔａｎｉａｎ

Ｎ．ＧｉｒｓｕｄａｔＪ（１９９５）．Ａｂｓｃｉｓｉｃａｄｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ａｎｄ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ｏｆ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｄｒｏｕｇｈｔ

ｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａ／／ａｎａ．ＭｏＩ

Ｇｅｎ

Ｇｅｎｅｔ．２４６．

１０－１８

７８Ｇｏｓｔｉ

Ｆ，ＢｅａｕｄｏｉｎＮ，ＳｅｒｉｚｅｔＣ，ＷｅｂｂＡＡ，ＶａｒｔａｎｉａｎＮ，ＧｉｒａｕｄａｔＪ（１９９９）．ＡＢｌｌ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

２ＣｉｓａｎｅｇａＵｖｅ

ｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆａｂｓｃｌｓｉｃａｃｉｄ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ＂．１８９７－１９１０

７９

ＭｅｎｏｌＳ．ＣｏｓｔｉＦ．ＧｕｅｒｄａｒＤ．ＶａｖａｓｓｅｕｒＡ．ＧｉｒａｕｄａｔＪ（２００１）．１ｈｅＡＢｌｌａｎｄＡＢｌ２

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ２Ｃ

ａｃｔ；ｎａｎａｇａｔｉｖｅｆｅｅｄｈｃｋｍｇｕｂｔｏｒｙｌｏｏｐｏｆｔｈｅａｂｓｃｉｓｉｃａｄｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｐａｔｈｗａｙ．

Ｐ／ａｎｔＪ２５．２９５－１３０３

８０Ｇｉｌｍｏｕｒ

ＳＪ．ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ（１９９１）．Ｃｏｌｄａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎａｎｄｃｏｌｄ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｉｎＡＢＡ

ｍｕｔａｎｔｓ

ｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ

Ｍ０１．Ｂｉ０１．１７．１２３３．１２４０．

８１Ｇｏｓｔｉ

Ｆ．ＢｅｒｌａｕｃｈｅＮ．ＶａｒＩａｎｉａｎＮ．ＧｉｒａｕｄａｔＪ．（１９９５）．Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ａｎｄ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ

ｄｒｏｕｇｈｔ

ｌｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ．ＭｏＩＧｅｎ

Ｇｅｎａｔ，２４６．

１０．１８．

８２

Ｙａｍａｇｕｃｈｌ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ．ＳｈｉｎｏｚａｋＩＫ（１９９３）．Ｃｈａｒａｃｔｅｄｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ

ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ．

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｒｄ２９９ｅｎｅｏｆＡｒｅｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉｅｎｓ

ａｎｄ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，ＭＯｌ

ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２弱．３３１－３４０．

８３

Ｙａｍａｇｕｃｈｉ－Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ．ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９９４）．Ａｎｏｖａｌ

ｄｓ－ａｃｔｉｎｇ

ｅｌａｍｅｎｔｉｎ

ａｎＡｍｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｅ

ｉａ

ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ

ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ

ｔｏｄｒｏｕｇｈｔ．Ｉｏｗ－ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ．ｏｒｈｉｇｈｌ８ａ幢ｓｔｒａ鹋．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，６。２５１－２６４．

８４ＢａｋｅｒＳＳ．ＷｉＩｈｅＩｍＫＳ．ＴｈｏｍａｓｈｏｗＭＦ（１９舛）．ＴｈｅＳ－ｒａｇｉｏｎｏｆＡｍｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉｅｎｓｃｏｒｌ５ａ

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ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ

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ＡＢＡ－ｒｏｇｕｌａｔｅｄｇａｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ

ＭｏｌＢｉ０１．

２４：７０１－７１３．

８５ＷａｎｇＨ．Ｄａｔｌａ

Ｒ。Ｇｅｏｒｇｅｓ

Ｆ－Ｌｏｅｗｅｎ

Ｍ，ＣｕｔｅｒＡＪ（１９９５）．ＰｒｏｍｏｔｅｒｓｆｒｏｍＫｉｎｌ

ａｎｄ

ｃｏｒ６．６．ｔｗｏ

ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓＡｒａｂｉ－ｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ

ｇｅｎｅｓ：Ｔｒａｎｓｃｄｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ

ａｎｄ

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ｉｎｄｕｃｅｄ

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ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＡＢＡ

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ａｎｄ

ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ．Ｐｉｅｎｔ

Ｍ０１．Ｂｉ０１．∞．６０５－与１７

８６１ｗａｓａｋｉＴｔ

ＫｉｙｏｓｕｅＴ．Ｙａｍ明ｕｄｄ－ＳｈｌｎｏｚａｋｉＫ．ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９９７）．Ｔｈｅｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ

ｒｄｆ７

（ｃｏｒｅ／）ｇｅｎｅａｎｄｂｐｒｏｍｏａＩｒｒｅｇｉｏｎＩｎＡｒａｂｉｄｏｐａｌｅ曲ａｌｔｅｒｍ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｌ０１．１１５．１２８７．

８７ＪｉａｏｇＣ．ＬｕＢ．ＳｉｎｇｈＪ（１９ｅ６）．ＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｏｆａＣＣＧ＾Ｃｃｂ－ｓ酬ｎｇｅｌｅｍｅｎｔｆｏｒｃｏｌｄｉｎｄｕｄＩ∞ｏｆｔｈｅ

ＢＮｌｌ５

ｇｅｎｅ

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８８

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ＥＪ．ＧｉｌｒｎｏｕｒＳＪ．ＴｈｏｍｅｓｈｅｗＭＦ（１９９７）ＡｒａｂｉｄｏｐｓｌｓｔｈｅｌｌａｎａＣＢＦｌ

ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰ２

ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ

ａｃｔｉｖａｔｅ＂ｔｈａｌｂＩｎｄ８ｔｏ（ｔｉｅＣ－ｍｐａａ嘲Ｅ．ａｃｉｓ－ａｃｌｌｎｇ

ＤＮＡ

ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

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ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ

ｔｏｌｏｗ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒａａｎｄｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔ．

只～担Ｓ．９４．１０３５．１０４０．

８９Ｇｉｌｍｏｕｒ

ＳＪ．Ｚａｒｋａ

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ＥＪ。ＳａｌａｚａｒＭ只ＨｏｕｇｈｔｏｎＪＭ。Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ

ＭＦ（１９９８）．Ｌｏｗ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｉ伽ｏｆｔｈｅＡｍｂｉｄｏｐａｌｓＣＢＦｆｅｍｉｌｙｏｆＡＰ２ｔｍｎａｃ岫Ｕｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓ

ａｓａｎｅａｄｙ

ｓｔｅｐ

ｉｎｃｏｌｄ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＯＲ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰｌａｎｔＪ．１６。４３３－４４３．

９０Ｌｉｕ

Ｑ．Ｋａｓｕｇａ

Ｍ．ＳａｋｕｍａＹ。Ａｂｅ

Ｈ．Ｍｉｕｒａ

Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ－Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ．ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９∞）．Ｔｗｏ

ｔｒａｎｓｃ—ｐｔｉｏｎ怡ｃｔｏｒｓ．ＤＲＥＢｌ

ａｎｄ

ＤＲＥＢ２．ｗｉｔｈａｎＥＲＥ邯帆ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇ

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ｓｅｐａｒａｔｅ

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ｄｒｏｕｇｈｔ－ａｎｄＩｏｗ－ｔｅｍｐｅｒｏｔｕｒｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＩｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｌａ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１０．＇∞１－ｔ４０６．

９１

Ｏｋａｍｕｒｏ

ＪＫ。ＣａｓｔｅｒＢ．ＶｉＩｌａｒｒｏａｌ

Ｒ．Ｖａｎ

Ｍｏｎｔｅｇｕ

Ｍ．ＪｏｆｕｋｕＫＤ（１９９７）．Ｔｈｅ＾Ｐ２ｄｏｒａａｉｎｏｆ

Ａ户Ｅ联Ｕ２ｄｅｆｉｎｅｓａｌａｒｇｅｎｅｗｆａｍｉｌｙｏｆＤＮＡ

ｂｉｎｄｉｎｇ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐａｌｓ．ＰＮＡｓ．９４．

７０７争＿７∞１

９２

Ｏｈｍｅ－Ｔａｋａｇｉ

Ｍ．ＳｈｉｎｓｈｉＨ（１９９５）．Ｅｔｈｙｔｅｎｅ－ｉｎｄｕｄｂｌｅＤＮＡ

ｂｉｎｄｌｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｔｈａｔｉｎｔｅｒｅｃｔｗｉｔｈ

ａｎ

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Ｃｅｌｌ，７。１７３－１８２．

９３ＮａｋａｓｈｉｍａＫ．Ｓｈｉｎｗａｄ

Ｚ

Ｋ．ＳａｋｕｍｅＹＳｅＩｄ

Ｍ．Ｍｉｕｒａ

Ｓ。ＳｈｌｎｏｚａｋＩ

Ｋ。Ｙｓｍａｇｕｃｈｉ·Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ

ｆ２０００）．ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｗｏＡｒａｂｌｄｏｐｓｉｓＤＲＥＢ２９ｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇＤＲＥ－ｂｉｎｄｉｎｇ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｉｎｖｏｌｖｎｄＩｎｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ·ｅｎｄｈｉｇｈ－ｓａｌｉｎｉｔｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＪａｎｔ

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２ｆ４），６５７－∞５

９４ＫａｓｏｇａＭ．ＵｕＱ．ＭｉｕｒａＳ．Ｙａｍｏｇｕｃｈｉ·ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ。ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９９９）．ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｐｌａｎｔｄｒｏｕｇｈｔ．

ｓａｌｔ．ａｎｄｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｌａｎｃｅ

ｂｙｇｅｎｅ

ｔｒａｎｓｆｅｒｏｆ

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ｓｔｒｅｓｓ－ｌｎｄｕｄｂｌｅ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ

ｆａｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７（３）．２８７－２９１

１０２

堕苎兰！茎耋苎墼

＿—●——————————－＿－＿＿－－＿＿－——————＿—＿＿＿＿＿＿＿——，——＿—＿＿＿＿＿＿●—————＿－＿＿＿＿＿＿－—————＿＿＿－———————＿●－＿—————＿ｈ———————＿－ｈ—————＿—＿——＾●—————————－———一—————～——一

９５刘强，赵南明，Ｙａｍａｇｕｃｈ－ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ．ＤＲＥＢ转录因子在提高植物抗逆性中的作用

科学通报．２０００．４５（１）．１１—１６

１００ＸｉｎＺ，ＢｒｏｗｓｅＪ（１９９８）．ｅｓｋｉｍｏＩｍｕｔａｎｔｓｏｆＡｒｅｂＭｏｐｓｆｓａｒｅ

ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙｆｒｅｅｚｉｎｇ．ｔｏｌｅｒａｎｔ．ＰＮＡＳ

９５

７７９９－７８０４

１０１ＮａｎｊｏＴ

Ｋｏｂａｙａｓｈｉ

Ｍ．ＹｏｓｈｉｂａＹＫａｋｕｂａｄＹ

Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ。ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９９９）．

Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ

ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｏｆ

ｐｒｏｌｉｎｅ

ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｓ

ｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏ

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ａｎｄ

ｓａｌｉｎｉｔｙ

ｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ．触ＳＬｅｔｔ，４６１．２０５＿２１０．

１０２ＷａＫｅｎ

Ｇ，ＭｃＫｏｗｎ

Ｒ．Ｍａｄｎ

Ａ，ＴｅｕｔｏｎｉｏｏＲ（１９９６）．１ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓ

ａｆｆｅｃｔｉｎｇ

ｔｈｅ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｌｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈｅ『『ａｎｅ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｈ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１１１，１０１１－１０１９

１０３

ＫｎｉｇｈｔＨ，ＶｅａｌｅＥＬ．Ｗａｒｒｅｎ

ＧＪ．Ｋｎｉｇｈｔ

ＭＲ（１９９９）．Ｔｈｅａｆｔ６ｍｕｔａｔｉｏｎ

ｉｎ

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ

ｔｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

ｉｎｄｕ删ｏｎｏｆ

ｇｅｎｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｈｅＣＲＴｍＲＥ

ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ｍｏｔｉｆ户妇几ｆ

ＣｅＪｊ．

１１．８７５－８８６

１０４

ＫｎｉｇｈｔＨ。Ｋｎｉｇｈｔ

ＭＲ（２００１）．Ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

ａｎｄｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ．Ｔｒｅｎｄｓｉｎ

ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ。６（６）．２６２．２６７

１０５Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ

Ｋ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ－ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ（１９９７）．Ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎ

ａｎｄ

ｓｉｇｎａｌ

ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎ

ｗａｔｅｒ－ｓｔｒｅｓｓ

ｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，”５．３２７＿３３４

１０６ＺｈｕＪＫ（２００１）．Ｐｌａｎｔｓａｌｔｔｏｌｅｆｅｎｃｅ．ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔ

Ｓｃｉ，６．６６－７１

１０７

Ｈａｓｅｇａｗａ

ＰＭ，ＢｒｅｓｓａｎＲＡ。ＺｈｕＪＫ，ＢｏｈｎｅｒｔＨＪ（２０００）．Ｐｌａｎｔｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ

ｔｏ

ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙ．ＡｎｎｕＲｅｖＰ『ａｎｔＭｏｌＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，５１．４６３－４９９

１０８Ｂｉｕｍｗａｌｄ

Ｅ．Ａｈａｒｏｎ

ＧＳ，ＡｐｓｅＭＰ（２０００）．Ｓｏｄｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔ

ｉｎ

ｐｌａｎｔ

ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏ曲ｋｎ

Ｂｉｏｐｈｙｓ

Ａｃｔａ，

１４６５．１４０－１５１

１０９ＺｈｕＪＫ（２０００）．Ｇｅｎｅｌｉｃａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆ

ｐｌａｎｔ

ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ

ｕｓｉｎｇＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ

ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐ『ａｎｔ

Ｐｈｙｓｉｏｌ，

１２４．９４１—９４８．

１１０ＷｕＳＪ．ＤｉｎｇＬ．ＺｈｕＪＫ（１９９６。）ＳＯＳｌ．ａｇｅｎｅｔｉｃＩｏｃｕｓｅｓｓｅｎｔｉａＩｆｏｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄ

ｐｏｔａｓｓｉｕｍ

ａｃｑｕｉｓｌｔｉｏｎ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，８．６１７－６２７

１１１ｚｈｕ

ＪＫ．Ｌｉｕ

Ｊ．ＸｉｏｎｇＬ（１９９８）．ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓａｌｔｔｏｌａｒａｎｃｏｉｎＡｒｏｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａ

ｃｒｉＵｃａｌｒｏｌｅｏｆｐｏｔａｓｓｉｕｍ

ｎｕｔｒｌｔｉｏｎ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１０．１１８１．１１９１．

１１２ＺｈｕＪＫ（２００１）．ＣｅｌＩ

ｓｉｇｎａｌｉｎｇ

ｕｎｄｅｒｓａｌｔ，ｗａｔａｒａｎｄｃｏｌｄ

ｓｔｒｅｓｓｅｓ．ＣｕｒｔＯｐｉｎＰＪａｎｔＢｉｏｌ，４．４０１－４０６

１１３ＧｕｏＹ．ＨａＩｆｔｅｒＵ．ＩｓｈｌｔａｎｉＭ．ＺｈｕＪＫ但∞１）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｌｉｏｎａＩｄｏｍａｉｎｓｉｎｔｈｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ

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ｒｅｑｕｉｒｅｄ

ｆｏｒ

ｐｌａｎｔ

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Ｃｅｌｌ，１３．１３８３－１４００

１１４Ｉｓｈｉｔａｎｉ

Ｍ．ＵｕＪ．ＨａｌｆｔｅｒＵ．ＫｉｍＣＳ．ＷｅｉＭ．ＺｈｕＪＫ（２∞０）．ＳＯＳ３ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎ

ｐｌａｎｔ

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ｒｅｑｕｉｒｅｓｍｙｄｓ｜ｏｙｌａｔｉｄｎａｎｄｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１２．１６６７－１６７７

１１５ＨａｉｒｉｅｒＵ。ＩｓｈｉｔａｎｉＭ。ＺｈｕＪＫ（２０００）．ＴｈｅＡｒｅｂｉｄｏｐｓｉｓＳＯＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｐｈｙｓｉｃａｌｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈ

ａｎｄｉｓａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｂｙ

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ＳＯＳ３．纠怕Ｓ．９７．３７３０－３７３４

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１１７

ＭｅｎｄｏｚａＩ。ＲｕｂｉｏＦ．Ｒｏｄｄｇｕｅｚ－ＮａｖａｒｒｏＡ。ＰａｒｄｏＪＭ（１９９４）．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ

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１０３