bca法

bca法

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2023年3月17日发(作者：光催化材料)

BCA法检测组织蛋白含量

一、材料准备

匀浆管，冰盒，肿瘤组织；

移液器，无菌枪头，无菌EP管（600ul），记号笔；

BCA试剂盒，96孔板，酶标仪，0.9%NaCl或PBS，37℃水浴或温箱；

煮沸锅，胶布，泡沫，上样缓冲液；

二、实验流程

1．组织裂解

（1）按比例加入裂解液，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时；裂解液体积与组织样本比

例要适当，使得最终蛋白浓度最少达到0.1mg/ml，理想的蛋白浓度为1-5mg/ml；

（2）4℃离心，12000rpm，20min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于

冰上，即为蛋白样本；

2．测定蛋白浓度

（1）配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试

剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

（2）稀释标准品：先将冻干标准品用0.9%NaCl或PBS稀释成2000ul/ml的储存液，

然后储存液稀释至25～2000ug/ml。

管号

稀释液体积标准品体积

终浓度

A

0ul600ul

2000ug/ml

B

100ul300ul

1500ug/ml

C

300ul300ul(从A管取)

1000ug/ml

D

200ul200ul(从B管取)

750ug/ml

E

300ul300ul(从C管取)

500ug/ml

F

300ul300ul(从E管取)

250ug/ml

G

300ul300ul(从F管取)

125ug/ml

H

400ul100ul(从G管取)

25ug/ml

I

300ul0ul

0ug/ml（空白）

（3）将25ul的标准品和合适浓度范围的样本分别添加于96孔板的微孔中。

（4）各孔加入200ulBCA工作液，充分混匀（最好使用排枪提高速度，否则加样的时

间差可能会影响最终结果）。

（5）盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟。

（6）冷却到室温，用酶标仪测定A562；

（7）在excel,将标准样品(usualBSA)的吸收值全部选中,点insert中的图表,选xy散点图

（以蛋白浓度为横坐标，OD值为纵坐标,Y（OD）＝aX（浓度）＋b）生成线

性方程公式，测蛋白浓度时是代入Y值来求X值，测样本蛋白的浓度；

3．蛋白变性

（1）100℃煮沸5min，一次性手套包裹，用胶布封口；

（2）以5×上样缓冲液：蛋白=1:4的比例加上样缓冲液，如100ul变性蛋白就加25ul

的5×上样缓冲液；

（3）置-20℃冰箱保存；

三、注意事项

1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解；

2.要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔且标准品与样品处

理要尽量一样（如采用同样的溶液溶解样品和标准品）,每次均应做标准曲线。

3.当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失。

4.测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发

影响检测结果。

*1g=1000mg,1mg=1000ug,