倒置相差显微镜

倒置相差显微镜

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2023年3月16日发(作者：氨盐)

原子力显微镜对常用7种单克隆抗体形态的观察

侯永微;纪小龙;王美娥

【摘要】ObjectiveTolaythefoundationforestablishingamorphological

structuredatabaseofcommonlyusedantibodiesbystudyingthe

morphologyofantigen-antibodyreactionunderatomicforcedmicroscope.

MethodsSevenantibodieswereaddedontoslidesandplacedintoawet

kitcontaining10%raftertheantibodies

werekeptinanincubatorat37℃,theywerewashedwithdistilledwater

orphologieswereobservedunderatomicforce

th,maximumheightandmeanroughnessofparticles

sThelongrodcytokeratinandS100proteinmuse

anti-humanmonoclonalantibodies,theoblateroundcommonantigensof

vimentinandleukocyteaswellascytokeratin7andDog-1mouse

antihumanmonoclonalantibodies,andthetrianglethyroglobulin

thand

maximumheightofmonoclonalantibodiesweresignificantlydifferent

(P<0.05),butnosignificantdifferencewasfoundinthemeanroughness

(P>0.05).ConclusionThemorphologiesof7monoclonalantibodiescanbe

dividedintolongrod,oblateroundandtriangletypes,whichdirectly

provetherelativespecificityofantibodiesandcanthusprovidethe

morphologicalfoundationforfurtherstudyingtheco-expressionand

exceptionalexpressionofantigens.%目的为抗原抗体反应提供原子力显微

镜下的形态学基础，为建立常用抗体形态结构的形态库打下基础。方法将7种常

用单克隆抗体分别滴加于载玻片上，放入加有10%中性缓冲甲醛的湿盒内，置于

37℃温箱中1h，用蒸馏水轻轻涮洗，晾干，用原子力显微镜(atomicforce

microscope，AFM)进行扫描，观察形态，测量扫描颗粒的宽度、最大峰高度和

平均粗糙度。结果在2D图中，细胞角蛋白(广谱)、S100蛋白鼠抗人单克隆抗体

为长杆状，波形蛋白、白细胞共同抗原、细胞角蛋白7、Dog-1鼠抗人单克隆抗

体为类圆形，甲状腺球蛋白鼠抗人单克隆抗体为三角形；不同组间单克隆抗体之间

宽度、最大峰高度的差异有统计学意义(P＜0.05)，各组间平均粗糙度的差异无统

计学意义(P＞0.05)。结论2D图中，7种单克隆抗体的形态大致可分为三种：长杆

状、类圆形、三角形，直观地印证了抗体具有相对特异性，并为抗原的共同表达和

例外表达的进一步研究提供形态学基础。

【期刊名称】《解放军医学院学报》

【年(卷),期】2013(000)005

【总页数】3页(P513-515)

【关键词】显微镜检查;原子力;抗体;单克隆;形态

【作者】侯永微;纪小龙;王美娥

【作者单位】辽宁医学院病理学与病理生理学，辽宁锦州121001;武警总医院病

理科，北京100039;武警总医院病理科，北京100039

【正文语种】中文

【中图分类】R364.7

原子力显微镜(atomicforcemicroscope，AFM)在医学领域中的应用越来越广泛，

并已在各系统的正常及病变的细胞膜形态的探索上取得了很多成果[1-2]。目前临

床免疫组织化学过程中出现的假阳性、假阴性、共同表达、例外表达等问题的进一

步解释亟需抗原及抗体高分辨率的成像。因此，抗体分子的成像也是AFM研究的

热门内容，并可间接了解相应抗原的形态，为抗原-抗体结合提供直观的形态学基

础。本文应用AFM观察常用的7种鼠抗人单克隆抗体的形态，初步探讨不同抗体

形态的相对特异性。

材料和方法

1试剂和仪器近1个月内中杉金桥公司制备的7种鼠抗人单克隆抗体(广谱细胞角

蛋白、波形蛋白、白细胞共同抗原、S100蛋白、细胞角蛋白7、Dog-1、甲状腺

球蛋白)的工作液。ECLIPSETE2000-U倒置相差显微镜(购自日本NIKON公司)；

NanoscopeⅢa型原子力显微镜(购自DigitalInstrumentsInc，SantaBarbara，

CA)，采用氮化硅(Si3N4)悬臂，SNL-10型针尖(contact模式)，微悬臂长85μm，

力常数2.5N/m，探针针尖曲率半径为20~30nm，X轴扫描256线。

2制备扫描样本先将载玻片(单头单面硅化黏附载玻片)用记号笔圈定直径为1.5

cm的圆形范围，将上述7种鼠抗人单克隆抗体的工作液分别滴加于载玻片上并均

匀铺于圆形范围内，每张载玻片滴加1滴，将载玻片放入加有10%中性缓冲甲醛

的湿盒内，置于37℃，1h后，取出载玻片，于蒸馏水中轻轻涮洗1min，取出，

置于超净工作台(上海锦屏仪器仪表有限公司，型号为SW-CJ-3)中晾干以备扫描。

依上述方法同时制备不滴加任何抗体的空白载玻片作为对照。

3AFM扫描7组样品载玻片晾干后置于AFM载物台上，利用Nikon倒置显微镜

观察抗体的分布情况，选取分散较好，呈点状均匀分布的区域，在操作软件中选择

contact模式进行扫描。每组扫描10张样本片，每张扫描10个部位，每个部位

按100μm-50μm-20μm-10μm-5μm-1μm范围依次进行扫描，扫描频率为

0.5Hz，空气湿度50%，温度25℃。观察各组抗体形态的差异，并利用AFM图

像分析系统对扫描颗粒的宽度、最大峰高度和平均粗糙度进行定量测量。

4统计学方法采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行分析，7组样品的宽度

(width)、最大峰高度(maximumheight)、平均粗糙度(meanroughness)以-x±s

表示，方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1倒置相差显微镜观察抗体沉淀黏附法制备的样品在倒置相差显微镜下观察时背

景干净、抗体分散度较好，利于AFM的扫描。

2AFM扫描成像1)细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体的2D图像见长杆状物质，由多

个小类圆形物组合在一起，也有部分比图A所示更加长而窄，部分呈类椭圆形；

在3D图像上突起似几座山峰连在一起(图1)。2)波形蛋白鼠抗人单克隆抗体的2D

图像见类圆形但局部不规则的物质，中心最亮，四周稍暗；3D图像上见高低起伏

的突起，中间最高，四周环绕稍低的突起，如几座小山峰围绕一座主峰(图1)。3)

白细胞共同抗原鼠抗人单克隆抗体的2D图像中见由多个大小不一、形状不规则形

物质组成类圆形，且表面明暗不一；3D图像中见突起高低起伏，中间最高。

4)S100蛋白鼠抗人单克隆抗体的2D扫描图中见不规则长条形结构，明暗不一；

3D图像中见不规则长形突起，表面凹凸不平，由多个大小不等的突起组成。

5)Dog-1鼠抗人单克隆抗体的2D图像中见类圆形的物质，明暗不一致；3D图中

可见不规则突起，似“山包”，表面凹凸不平，为多个小“山包”组成。6)细胞角

蛋白7鼠抗人单克隆抗体的黏附载玻片上扫描的2D图中可见类圆形物质，亮度较

一致；3D扫描图见半球形“山包”状突起。7)甲状腺鼠抗人单克隆抗体的2D图

像中可见三角形物质，明暗不一，由多个不规则形物质组成；3D图像见突起呈三

角锥形，表面凹凸起伏(图1)。

3各组单克隆抗体形态的参数分析广谱细胞角蛋白鼠抗人单克隆抗体为长杆状，

其宽度明显大于其他6组(P＜0.05)，Dog-1鼠抗人单克隆抗体的宽度大于细胞角

蛋白7(P＜0.05)，其他各组间单克隆抗体的宽度差异无统计学意义(P＞0.05)；细

胞角蛋白7鼠抗人单克隆抗体的最大峰高度大于广谱细胞角蛋白、甲状腺球蛋白、

Dog-1鼠抗人单克隆抗体(P＜0.05)，Dog-1鼠抗人单克隆抗体的最大峰高度大于

白细胞共同抗原鼠抗人单克隆抗体(P＜0.05)，其他各组间单克隆抗体的最大峰高

度无统计学差异(P＞0.05)；各组间平均粗糙度无统计学差异(P＞0.05)，见表1。

图1三种具有代表性形态的单克隆抗体2D与3D图Fig.12Dand3Dof3

monoclonalantibodieswithrepresentativemorphologies

表17组单克隆抗体宽度、最大峰高度、平均粗糙度的比较Tab.1Width,

maximumheightandmeanroughnessof7monoclonalantibodiesaP＜

0.05,vsCytokeratin-pan;bP＜0.05,vsVimentin;cP＜0.05,vsLeukocyte

commonantigen;dP＜0.05,vsS100;eP＜0.05,vsDog-1;fP＜0.05,vs

Cytokeratin7;gP＜0.05,vsThyroglobulinMonoclonal

antibodyWidth(μm)Maximumheight(nm)Meanroughness(nm)Cytokeratin-

pan1.90±0.39bcdefg270.03±70.00f31.64±4.99

Vimentin1.25±0.26a245.08±83.6825.25±11.29Leukocytecommon

antigen1.16±0.18a228.94±72.92e26.71±12.82

S1001.17±0.18a237.06±86.0631.15±13.16Dog-

11.35±0.28af290.02±137.83cf34.41±23.29

Cytokeratin71.11±0.47ae319.92±196.27aeg26.42±16.03

Thyroglobulin1.15±0.11a277.43±58.83f31.15±20.94

讨论

目前常用的基质材料有云母、二氧化硅、金属、聚苯乙烯等[3]。本实验显示黏附

载玻片可以作为AFM扫描中方便实用的材料之一。甲醛是公认的组织细胞固定液，

有保持细胞形态、保护蛋白的作用，而乙醇会使细胞变性，丙酮会使细胞萎缩变性

[4]。由于10%甲醛溶液中含不规则形的颗粒，因此本研究用10%中性缓冲甲醛的

蒸汽固定法保持抗体形态[5]。

细胞角蛋白(cytokeratin，CK)是细胞骨架蛋白中最为复杂的中间丝，它由30多种

不同的基因编码，可以转录成20多种不同的多肽，主要表达在各种上皮细胞中。

AE1/AE3是广谱抗细胞角蛋白抗体，是AE1克隆与AE3克隆的混合[6]；用于上

皮细胞及上皮细胞来源肿瘤的标记。克隆AE1识别Ⅰ型细胞角蛋白CK10、CK15、

CK16、CK19；克隆AE3识别CK1、CK2、CK3、CK5、CK6及CK8。不同公司

的广谱抗细胞角蛋白抗体识别的种类并不完全一致。而扫描出来的广谱CK抗体形

态并不单一也说明了此抗体是多种单克隆抗体的混合液。

应用原子力显微镜对各组单克隆抗体平均粗糙度的观察测量得出各组间差异无统计

学意义。这与细胞之间测量的结果不同，正常细胞与肿瘤细胞之间表面的平均粗糙

度可得出明显的差异[2]。癌细胞膜表面粗糙度增加与其抗体表达的种类和数量有

关，如Kaul-Ghanekar等[7]发现相对于正常相邻近的组织切片，SMAR1表达减

低的人类乳腺癌组织切片的表面粗糙度增高，然而不同种类抗体本身的平均粗糙度

是否有明显差异需进一步研究。

目前，对于抗原-抗体之间作用力的研究较多，而对于特异性抗体形态的研究较少

[8-9]。本实验中用AFM扫描的7种单克隆抗体中形态各不相同，但其2D形态图

大其致可分为三种：类圆形、不规则长杆形和三角形。对于更多抗体的扫描将会观

察到更多特异的形态。这在形态上直观地印证了不同抗体的多态性及每种抗体具有

相对特异性。在不同种类及不同分化阶段的细胞中表达的抗原是不同的，明确抗体

的特异形态对各种抗体形态的观察为在少量细胞情况下，滴加相应抗体进行AFM

扫描来判断细胞种类、分化程度及其与癌症的关系提供形态学基础。

通过对7种单克隆抗体形态的观察，我们初步认为，抗原-抗体结合如锁-钥匙的关

系，应是一一对应的，但当某些抗体的形态极为相似时，也有可能会同时与两种抗

原结合，即出现一把钥匙开两把锁的情况，这是“例外表达”的形态学基础。

AFM对更多抗体纳米级形态的观察分析将对细胞抗原的共同表达及例外表达提供

更加客观的解释。

参考文献

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