电泳实验

电泳实验

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2023年2月26日发(作者：成都二诊)

DNA的琼脂糖凝胶电泳

实验原理和方法步骤

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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方

法步骤

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼

脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。

DNA在碱性条件下（pH80的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正

极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不

同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射

后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。…

一、实验目的

学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的

一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（的缓

冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型

不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络

合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目

的。

三、实验材料

实验14提取的DNA样品，

四、器具及药品

电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲

烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。

五、实验步骤

1、安装电泳槽

将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，

插上样品梳。

2、琼脂糖凝胶的制备

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，

20-100kb的DNA用%的凝胶，200-2000bp的DNA用%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至

完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。

3、灌胶

将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。

5、加样

将DNA样品与加样缓冲液（loadingbuffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到

样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。

6、电泳

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安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电

泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。

7、染色和观察

取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有

橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致

癌剂，操作时要小心，必须戴手套。

附：

⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)：

Tris54g，硼酸，LEDTA20ml，将pH调到，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10

倍。

⑵加样缓冲液的配制：

%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

⑶溴化乙锭的配制：

称取溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸

取μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为μg/ml，混合均匀。

⑷100倍TE缓冲液的配制：

1mol/LTris-HCl（），100mmol/LEDTA

称取，，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至（大约加入盐酸

20ml），然后定容至1000ml。

⑸100倍电泳缓冲液的配制：

4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA称取，无水

乙酸钠，，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至（大约加入冰乙酸

50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。