对流免疫电泳
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2023年3月2日发(作者：3a标准)医学免疫学实验指导：沉淀反应
【内容】
六、环状沉淀试验
七、单向免疫扩散试验
八、双向免疫扩散试验
九、对流免疫电泳试验
十、火箭免疫电泳试验
十一、免疫电泳试验
可溶性抗原（如毒素、血清蛋白、细胞碎片）与相应抗体特异性结合，在两者比例适当并有电解
质存在及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。可溶性抗原与相应抗体相比，
抗原分子小，故抗原的反应面积大，为使抗原抗体比例适当，一般应稀释抗原。
试验、环状沉淀试验
（Ringprecipitationtest）
将高浓度的抗血清置于直径较小的环状沉淀管中，再缓缓加入血清，使二者间有一清晰界面。如
抗原抗体相对应，一段时间后，在液面交界处可形成白色沉淀环。
此试验常用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、鉴定血迹、测定媒介昆虫的嗜血习性
等。
【材料】
1、兔抗人血清、人血清、牛血清、生理盐水。
2、毛细吸管、环状沉淀管及环状沉淀管架。
【方法】
1、取环状沉淀管三支置于环状沉淀管架上，做好标记。用毛细吸管加入兔抗人血清各0.2ml于
管底。
2、用毛细吸管分别吸取人血清、牛血清、生理盐水0.2ml，沿试管壁缓缓加入三支沉淀管，使两
层液体之间有一明显的交界面。
3、室温下静置10~20分钟，观察结果。
【结果】
观察各管两层液体交界面有无白色沉淀环出现，有白色沉淀环的为阳性。（图4—5）
【注意事项】
加下层兔抗人血清时应注意将毛细吸管管口置于沉淀管底，避免气泡产生；加上层液体时毛细吸
管不能接触到下层液体，吸管口靠在沉淀管壁上缓缓加入，否则不能形成清晰界面。
试验、单向免疫扩散试验
（Singleimmunodiffusiontest）
此试验属定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中先将某种已知抗体混合于琼脂中，制
成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，将需检测的一定量的抗原加入孔中。在反应过程中，抗体已
经均匀分布在琼脂板中，只有抗原向四周呈辐射状扩散，故称为单向免疫扩散试验。如果抗原抗体相
对应，则在比例适当的地方出现一白色的沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。以不同浓
度的标准抗原与固定浓度的抗体反应后测得沉淀环的直径作为纵坐标，以抗原的浓度作为横坐标可绘
制标准曲线图。测出待侧抗原在相同条件下的沉淀环直径，即可从标准曲线中求出其含量。此试验主
要用于检测血清中各种Ig和补体成分的含量。
【材料】
1、标准参考血清：冻干正常人混合血清，其中IgG含量为经标准标定的已知量，用以制作标准
曲线。
2、IgG诊断血清。
3、待检标本：人血清。
4、1.5%琼脂盐水、PBS、载玻片、直径3mm打孔器、微量加样器、湿盒、半对数坐标纸。
【方法】
1、免疫琼脂板的制备：将适宜浓度的诊断血清与预先溶化好的并保存于56℃水浴箱中保温的1.5%
琼脂盐水按一定比例混合后，立即浇注在载玻片上，每块3.5ml（厚度2mm），置室温冷却凝固制成
免疫琼脂板。
2、打孔：用直径3mm打孔器在琼脂板上打孔，孔间距为15mm，孔内琼脂用打孔器的针尖挑出。
3、加样：取冻干参考血清一支，加入0.5ml蒸馏水溶解，用0.01mol/LpH7.2~7.4PBS倍比稀释
成1:10~1:160五种浓度。用微量加样器分别取10μl不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，
每一浓度加2个孔，然后用同样的方法取10μl事先用PBS1:40稀释的待检血清加入孔内，每份标
本加2个孔。
4、反应：将加样的琼脂板置湿盒内，放37℃恒温箱24—48小时后取出，测量各孔沉淀环直径并
作记录。（图4—6）
【结果】
以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作
图，绘制标准曲线。根据待检血清的沉淀环直径，从图上可查出IgG浓度。查得的浓度乘以标本的稀
释倍数即可得该标本IgG的浓度（图4—7）
【注意事项】
1、制备琼脂板时温度不宜太高以免抗体变性失活，也不宜太低以免使琼脂凝固不匀。
2、制备琼脂板时，载玻片一定要置于水平位置。
3、孔要圆整、光滑，孔中琼脂不能与载玻片分离。
4、时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，沉淀线解离或散开，影响结果判断。
5、测量沉淀环直径必须准确，以mm为测量单位。
6、
试验、双向免疫扩散试验
（Doubleimmunodiffusiontest）
此法为定性试验。将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，两者各自向四周扩散，在比例
适当处形成可见的白色沉淀线。如果所加抗原、抗体标本中有多对抗原抗体系统，则因各种抗原的扩
散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障
作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗原抗体。因此观察沉淀线的位置、数量、
形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。此试验常用于抗原和抗体的纯度鉴定，也可用
已知的抗原（或抗体）检测未知的抗体（或抗原）。本试验以检测血清甲胎蛋白（AFP）为例。
【材料】
1、待检血清、AFP阳性血清。
2、AFP诊断血清。
3、1%琼脂盐水、载玻片、直径3mm打孔器、吸管等。
【方法】
1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平台面上，用吸管吸取加热溶化的1%琼脂盐水3.5ml，均匀
地浇注在载玻片上，注意勿产生气泡，琼脂厚度约为2mm。
2、打孔：待琼脂凝固后，用打孔器据图样（见图4-9）打孔，孔径3mm，孔间距5mm，挑出孔
内琼脂。必要时将玻片底部在酒精灯火焰上略微加热，或在小孔内加入少量溶化的琼脂封闭孔底。
3、加样：用毛细细管于中央孔加入AFP诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP阳性血清作为对
照，2、3、5、6、孔分别加入待检血清。加样时以加满小孔为度，避免出现气泡和溢出孔外。
4、反应：将琼脂板放入湿盒内置37℃恒温箱中，24小时后取出观察结果。
【结果】
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1、4两孔（AFP阳性血清）与中央孔（抗AFP抗体）之
间应出现清晰的乳白色沉淀线。其余各孔则根据与中央孔之间有无沉淀线及沉淀线的特征判断结果。
如图4-9所示，2、6孔待检血清标本与中央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产生的沉淀线相融合，
则表示阳性；3孔无沉淀线出现，5孔虽形成沉淀线，但与阳性对照沉淀线相交叉，表明为另一对抗
原抗体反应，故3、5孔均为阴性。
【注意事项】
1、加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。
2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不
清楚。
3、加样时抗体、阳性血清及每份待检标本应各用一支吸管，以免混淆，影响试验结果。
试验、对流免疫电泳试验
（Counterimmunoelectrophoresistest）
对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。将琼脂板置于电场中，在pH8.6的缓
冲液中，大多数蛋白质抗原带负电荷向正极移动，而抗体为球蛋白，由于暴露的极性基团少，所带负
电荷低，且分子量较大，移动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极移动（电渗是指在电场中液体对于
一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的液体带正电
荷，因此液体向负极移动，产生电渗）。这样抗原抗体相向运动，在比例适当处形成乳白色沉淀线。
由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向移动，因而增加了试验的灵敏度，并缩
短了反应时间。此试验常用于检测甲胎蛋白（AFP）、乙肝病毒表面抗原（HB
S
Ag）。
【材料】
1、HB
S
Ag阳性血清、待检血清、抗HB
S
Ag血清。
2、巴比妥钠—盐酸缓冲液（0.05mol/L，pH8.6）、1%离子琼脂（用缓冲液配置）。
3、载玻片、直径3mm打孔器、毛细吸管、电泳仪、滤纸片等。
【方法】
1、琼脂板的制备：将已制备好的离子琼脂在水浴中加热溶化，用吸管吸取3.5ml浇注在玻片上，
冷凝后备用。
2、用打孔器按模型打成双排孔，孔径3mm，孔间距4mm，行间距4mm。
3、加样：用毛细吸管在双排孔的一侧加入抗HB
S
Ag血清，另一侧分别加入HB
S
Ag阳性血清和
待检血清，注意抗原抗体的位置要一致。加样时以加满小孔为度，注意不能让液体溢出。
－＋
AgAbAgAb
4、电泳：将加好样的琼脂板放置电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分
别用双层滤纸片与电泳槽中的pH8.6的巴比妥钠缓冲液相连，接通电源，调节电流为2—4mA/cm板
宽或电压为4—6V/cm板长，电泳45—60分钟。
5、电泳毕，关掉电源，取出琼脂板，观察在相应抗原抗体孔间有无白色沉淀线出现。
【结果】
阳性对照孔与抗血清孔间出现清晰白色沉淀线。若待检血清与抗血清孔间出现沉淀线为阳性，反
之无沉淀线为阴性。若沉淀线不够清晰，可在37℃下放置数小时，以增强沉淀线清晰度。
【注意事项】
1、对流免疫电泳试验的灵敏度较双向免疫扩散试验高，但由于电泳时缓冲液的离子强度、pH值、
端电压和电泳时间等因素的影响，有时可能出现假阳性反应。
2、抗原与抗体量应相接近，如抗原量过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。
试验、火箭免疫电泳试验
（Rocketimmunoelectrophoresis）
火箭免疫电泳是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。将抗体溶入琼脂后制板，在
琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极
移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。峰的高度与抗原浓度呈正相关。（见图
4—11）当琼脂中的抗体浓度固定时，以不同浓度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度
为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待侧抗原的含量。反之，当琼脂中抗原
浓度固定时，便可测定待检抗体的含量（即反向火箭免疫电泳试验）。本试验以检测甲胎蛋白为例。
【材料】
1、甲胎蛋白诊断血清、待检血清、已知含量的甲胎蛋白标准溶液。
2、巴比妥缓冲液（0.025mol/L，pH8.6）、2%巴比妥琼脂、生理盐水。
3、电泳仪、5cm×9cm玻璃板、直径4mm打孔器、微量加样器等
【方法】
1、免疫琼脂板的制备：将甲胎蛋白诊断血清用巴比妥缓冲液稀释成1:100。取溶化并冷至56℃
左右的2%巴比妥琼脂3.5ml与1:100稀释的甲胎蛋白诊断血清3.5ml混合，立即浇于5cm×9cm之
洁净玻板上制成厚薄均匀的含抗体琼脂板。
2、打孔：琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板一端1cm处打一排小孔，孔径3mm，孔距5mm。
3、加样：用微量加样器分别准确吸取待检血清10μl加于孔内，同时将不同稀释度的甲胎蛋白标
准液10μl加于另外几个孔内用于制作标准曲线。
4、电泳：将琼脂板放入电泳槽，样品孔靠近负极端，用双层滤纸与电泳槽相连。以电流强度为
40mA进行电泳1~2小时，或端电压为3V/cm电泳6~8小时。
5、电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板。
6、将琼脂板放在生理盐水中漂洗1天，其间更换2~3次生理盐水以洗去未结合的抗原和抗体。
从生理盐水中取出后，在琼脂板上滴加5%甘油以防止凝胶断裂，再取一条湿滤纸盖于琼脂板上，置
37℃烘干，干后将滤纸打湿轻轻移去。
7、将琼脂板浸入0.05%氨基黑溶液中染色10分钟后取出，用5%醋酸脱色1小时，直到背景呈
无色为止。脱色后，在琼脂板上滴少量5%甘油，放37℃温箱干燥后取出，分别量取各孔形成的沉淀
峰的高度。
【结果】
以已知浓度的甲胎蛋白标准抗原形成的沉淀峰的高度作为纵坐标，以抗原浓度为横坐标绘制标准
曲线。根据待侧血清沉淀峰的高度，从标准曲线中查出该血清中甲胎蛋白的含量。
【注意事项】
1、如采用高压电泳时（8~10V/cm），需配冷却装置。
2、待检样品多时为避免先加样孔抗原自由扩散造成电泳后出现孔周扩大的沉淀峰，可先将琼脂
板放入电泳槽，在1V/cm电泳状态下加样。
3、正式试验前应作预试，调整好抗原、抗体的比例。
4、沉淀峰应呈圆锥状，如峰前端出现云雾状为过剩抗原引起的沉淀峰弥散。遇此情况，重复试
验时可将样品适当稀释。
试验、免疫电泳试验
（Immunoelectrophoresistest）
免疫电泳是免疫扩散与电泳相结合的免疫学分析技术，具有极高的分辨力。主要用于抗原组成的
定性分析。免疫电泳实际上分为两步：
1、电泳：将待检的可溶性物质在琼脂板上进行电泳分离，由于各种可溶性蛋白分子的颗粒大小、
质量与所带电荷不同，在电场的作用下，其带电分子的运动速度（迁移率）具有一定规律，因此通过
电泳能够把混合物中的各种不同成分分离开来。以血清为例（图4-12A），电泳后各种成分的位置是
电泳速度与电渗速度的代数和。白蛋白分子量较小，所带负电荷较多，泳动最快，其次为α1、α2及
β球蛋白，γ球蛋白泳动最慢。
2、琼脂扩散：当电泳完毕后，在琼脂板一端挖一条长的槽，加入相应抗血清，置湿盒内让其进
行双向扩散。在琼脂板中抗原和抗体互相扩散，当两者相遇且比例适当时，可形成不溶性抗原抗体复
合物，出现乳白色的特异性沉淀弧线（图4-12B、C）。
【材料】
1、巴比妥缓冲液（0.05mmol/L，pH8.6）。
2、1.2%离子琼脂（用巴比妥液配置）。
3、待检血清，纯化的人的IgG（1mg/ml），兔抗人血清。
4、载玻片、直径3mm打孔器、电泳仪、电泳槽、万用电表等。
【方法】
1、琼脂板的制备：将载玻片置于水平台上，用吸管吸取4ml事先已溶化好的1.2%离子琼脂浇注
在载波片上，待其冷凝后按图4—13打孔。
2、加样：用微量加样器在上孔加待检血清15μl，下孔加纯化的IgG溶液15μl。
3、电泳：将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，两端用2~3层纱布或滤纸搭桥，将靠近孔的一端
连接负极，另一端连接正极，接通电源。通常按琼脂板长度电压4—6V/cm，电泳1~2.5小时。
4、扩散：电泳完毕后，取出琼脂板，按图4—13开槽，挑去长槽内琼脂，用已溶化的1.2%离子
琼脂封底。在槽中加入兔抗人血清后将琼脂板置于湿盒内，于37℃恒温箱中进行双向免疫扩散，24
小时或48小时后观察结果。
【结果】
观察并描记沉淀弧的数目、位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图（图4—14），识别主要
Ig。
【注意事项】
1、挖槽时要注意平行整齐，加入抗体不要外溢。
2、有时抗原抗体反应形成的沉淀线很弱，肉眼不易观察，可用氨基黑染色液染色。
3、染色标本应在白色背景下观察，不染色标本需在斜射光的暗色背景下观察。
4、对分子量过小的抗原（如游离Ig轻链）要随时观察结果。
【思考题】
1、试分析双向琼脂扩散中沉淀线的位置及形状与抗原、抗体的浓度及扩散速度的关系。
2、试分析双向琼脂扩散试验、对流免疫电泳试验、免疫电泳试验的优缺点。