2024年2月21日发(作者：)
（紫外/可见）吸光光度法讲座（1）
吸光光度法是采用分光器（棱镜或光栅）获得纯度较高的紫外/可见单色光，基于物质对单色光的选择性吸收测定物质组分的分析方法。位于波长10～390nm之间的电磁辐射为紫外光，位于波长390～770nm之间的电磁辐射为可见光。各类电磁辐射的波长列于表1。
表1 各类电磁辐射的波长‘
辐 射－－－－－－－波长，λ/nm
无线电波－－－－－－＞10（12）～10（9）【注：10的12次方到10的9次方】
微 波－－－－－－－－－－109～106
红外线
a 、远红外－－－－－－－－106～3×104
b、中红外－－－－－－－－3×104～3×103
c 、近红外－－－－－－－－3×103～770
可见光－－－－－－－－－－770～390
紫外线－－－－－－－－－－390～10
X射线－－－－－－－－－－－10～10－2【10的负2次方】
γ射线－－－－－－－－－－－10－2～10－5
吸光光度法是一种历史久远的分析手段，具有灵敏度高、准确度和稳定性较好、适用范围广、所需仪器简单价廉等优点。它通常用于微量组分的测定，业已广泛应用于各个领域的分析测试。
吸光光度法也称做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指仪器的功能，即仪器进行分光并用光度法测定，这类仪器包括了分光光度计与原子吸收光谱法（AAS）仪。吸光光度法的本质是光的吸收，因此称吸光光度法比较合理，当然，称分子吸光光度法是最确切的。
紫外/可见）吸光光度法讲座（2）
——紫外与可见光吸收光谱的形成
原子或分子中的电子，总是处在某一种运动状态之中。每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。这些电子由于各种原因（如受光、热、电的激发）而从一个能级转到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量就从一个能量较低的能级跃迁到一个能量较高的能级。因此，每一跃迁都对应着吸收一定的能量辐射。具有不同分子结构的各种物质，有对电磁辐射显示选择吸收的特性。正像我们在光度分析中经常见到的，有色物质的溶液对不同波长的入射光线有不同程度的吸收。吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的，它属于分子吸收光谱。分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比，符合普朗克条件：
ΔE＝E2－E1＝hν＝hc/λ （l-28）
式中ΔE是吸收的能量，h为普朗克常数（6.626 ×10－34J·s），ν是辐射频率，c是光速，λ为波长。分子内部运动所涉及的能级变化较复杂，分子吸收光谱也就比较复杂。一个分子吸收了外来辐射之后，它的能量变化ΔE为其振动能变化ΔE振、转动能变化ΔE转以及电子运动能量变化ΔE 电子的总和，即
ΔE＝ΔE振＋ΔE转＋ΔE电子 （1-29）
在等式右边三项中，ΔE电子最大，一般在1～10eV。若设ΔE电子为5eV，则得到相应的吸收光谱中被吸收光波的波长应该是
λ＝hc/ΔE电子＝（6.626×10－34J·s ×3 ×1010cm／s）/（5×1.6×10－19J）
＝2.48×10-5cm ＝248nm
因此由于分子内部电子能级变化而产生的光谱位于紫外区或可见区内。ΔE振大约比ΔE电子小10倍，而ΔE转约比ΔE振小10倍或100倍。分子的电子能级跃迁必定伴随着振动能级和转动能级的跃迁，因此所得的紫外可见吸收光谱常常不是谱线或窄带，而是由一定宽度的若干谱带系所组成。
从化学键的性质来看，有机显色剂与吸收光谱有关的电子主要有三种，（1）形成单键的σ电子；（2）形成复键的π电子；（3）未共享的电子，或称非键n电子。根据分子轨道理论，这三种电子的能级高低次序是：
（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ*）
σ、π表示成键分子轨道；n表示非键分子轨道；σ*、π*表示反键分子轨道。实现σ→σ*跃迁吸收的能量最大，因而所吸收的辐射的波长最短，即在小于200nm的远紫外区。σ→π*
跃迁和π→σ*跃迁相应谱带的波长亦在小于200nm的远紫外区。由于仪器的原因，这三种跃迁的吸收光谱的研究相应较少。产生紫外可见吸收光谱的电子跃迁主要有以下五种类型：
（1）n→σ*跃迁。具有未共享电子对的一些取代基可能发生n→σ*跃迁。如含有硫、氮、溴或碘等杂原子的饱和有机化合物，以及含有氧和氯原子的化合物都会发生这种类型的跃迁。
（2）π→π*跃迁。实现π→π*跃迁所需能量也比较小。不饱和的有机化合物，如含有＞C＝C＜或－C≡C－等发色团的有机化合物，都会发生π→π*跃迁。
（3）n→π*跃迁。实现这种跃迁所需能量最小，因此其吸收峰的波长一般都在近紫外光区，甚至在可见光区。
（4）电荷转移。电荷转移产生的吸收带指的是许多无机物（如碱金属卤化物）和某些由两类有机化合物混合而得的分子给合物，它们在外来辐射激发下会强烈地吸收紫外光或可见光，从而获得紫外或可见吸收光谱。在这一过程中，配合物体系内部出现了一个电子从体系的一部分（给予体）转移到体系的另一部分（接受体），因此这样所得到的吸收光谱称电荷转移吸收谱带。
（5）配位体场跃迁。根据配位体场理论，过渡金属离子（中心离子）。具有能量相等的d轨道，而H2O、NH3之类的偶极分子或Cl－、CN－这样的阴离子（配位体）按一定的几何形状排列在中心离子的周围，将使得原来能量相等的d轨道分裂为能量不同的能级。如果d轨道是未充满的，则适当波长的外来辐射就会导致电子在这些不同能级跃迁。由于能级间能量差不大，因此只要能量较小的可见光就可实现这一跃迁，它们的吸收峰多在可见光区。
图1比较形象地表示出这几种常见吸收光谱在光谱区中的位置和大致强度。横坐标是波长，纵坐标是吸光强度（用摩尔吸光系数以10为底的对数表示）。
图1 产生紫外与可见吸收光谱常见的几种跃迁
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（3）
——吸光光度法的基本原理及摩尔吸光系数
实验表明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液的液层厚度、浓度以及入射光的强度等因素有关。如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度（A）与液层厚度及溶液的浓度有关。其定量关系式为：
A＝lgI0/I＝Kcl
式中 I0——单色光通过待测溶液前的强度；
I——单色光通过待测溶液后的强度；
K——吸光系数，为一常数，其数值与溶液的性质及入射光波长有关；
c——溶液中待测物质的浓度；
l——待测溶液的厚度。
1-30式称作朗伯-比尔定律，它是吸光光度分析的基本原理。这个关系式仅适用于单色光及均匀非散射的液体、固体和气体。
朗伯-比尔定律是由表示液层厚度和光吸收关系的朗伯定律（A＝lgI0/I＝K1l）及表示溶液浓度与光吸收关系的比尔定律（A＝lgI0/I＝K2l）合并而得。
在朗伯-比尔定律中，如果有色物质溶液浓度单位为mol/L，液层厚度的单位为cm，则公式中的K就可以用摩尔吸光系数ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1。换言之，摩尔吸光系数就是当有色物质溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度。
在实际分析工作中，我们不可能直接取1mol/L这样高浓度的有色溶液来测定摩尔吸光系数ε值，而是对适当的低浓度溶液测定吸光度，然后通过计算求出ε值。
例：在用新钴试剂（5-Cl-PADAB）测定钴的标准曲线中，用2cm厚度的吸收皿，在575nm波长处测得Co2+为5μg／50mL这一点的吸光度A＝0.383，计算其摩尔吸光系数。
解：Co的相对原子质量为58.93
[Co2+]＝（5×10－6）/（50×58.93）×1000
＝1.70×10－6（mol/L）
所以 ε＝A/cl＝0.383/（1.70×10－6×2）
＝1.13×105（L·mol－1·cm－1）
应该指出，上面测得的摩尔吸光系数是表观摩尔吸光系数。因为在测定中我们把被测组分看作完全转变成有色化合物进行计算的。实际上，溶液中的有色物质的浓度常因离解等因素而有所改变，但通常不考虑这些变化。
摩尔吸光系数是有色化合物的重要特性，也是鉴别光度法灵敏度的重要标志。它与入射光的波长、溶液的性质和温度、仪器的质量有关，而与溶液的浓度和液层的厚度无关。在一定条件下它是一常数，可以表明有色溶液对某一特定波长光的吸收能力。ε值越大，吸光光度法测定的灵敏度就越高。如以硫氰酸盐测定钴，ε620＝1.90×103，而用新钴试剂测定钴，ε＝1.13×105，后法比前法的灵敏度提高了50多倍。灵敏的光度法的摩尔吸光系数ε的值通常应在104～105。
（紫外/可见）吸光光度法讲座（4）
——导致偏离朗伯-比尔定律的因素
在吸光光度分析中，导致偏离朗伯-比尔定律的原因很多，但基本上可分为物理和化学两个
方面。属于物理原因的主要是入射光的单色性不纯所造成的；化学方面主要是由于溶液本身化学变化造成的。
（1） 单色光不纯引起的偏离
严格说来，朗伯-比尔定律只适用于单色光。但由于仪器分辩能力所限，入射光实际为一很窄波段的谱带，即在工作波长附近或多或少含有其他杂色光。这些杂色光将导致朗伯-比尔定律的偏离。
（2） 溶液本身引起的偏离
溶液本身引起的偏离有以下原因：
1）溶质和溶剂的性质。碘在四氯化碳溶液中呈紫色，在乙醇中呈棕色，在四氯化碳溶液中即使含有1％乙醇也会使碘溶液的吸收曲线形状发生变化。溶液的折光指数（n）随溶液的浓度改变而变化，并对吸光度有影响。当溶液浓度低于0.01mol／L时，n基本上是一常数，这也说明朗伯-比尔定律只有在低浓度中应用才是正确的。
2）介质不均匀性。朗伯-比尔定律是适用于均匀、非散射的溶液的一般规律，如果被测试液是胶体溶液、乳浊液或是浊液，则入射光通过溶液后，除了一部分被试液吸收，还会有反射、散射使光损失，导致透光率减小，吸光度异常增大，造成对朗伯-比尔定律的偏离。
3）溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化。离解是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素。溶液浓度的改变，离解程度也会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。
溶液中有色质点的聚合与缔合，形成新的化合物或互变异构等化学变化以及某些有色物质在光照下的化学分解、自身的氧化还原、干扰离子和显色剂的作用等，都对遵守朗伯-比尔定律产生不良影响。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（5）
——应用吸光光度法测定配合物的组成
用吸光光度法测定配合物的组成是比较简便有效的，这里介绍几种测定有色配合物组成的方法。
1 连续变化法（等摩尔系列法）
此法又称Job法，在实验条件下，将所研究的金属离子M与试剂R配制成一系列浓度比（cM：cR）连续变化的，而其总浓度（Q＝cM＋cR）相等的溶液。对这一系列溶液，在一定波长下测定其吸光度A，用A作纵坐标，以连续变化的浓度比cM ：cR（常用浓度相同的M与R的体积比）为横坐标作图。吸光度最高点相应的横坐标cM ：cR（在浓度相同时为体积比VM ：VR），即为配合物的组成比。
假设金属离子M和试剂R有如下反应：
aM十bR ＝ MaRb
M和R以各种比例浓度混合，在所得的一系列溶液中，两者的总浓度保持一定（设为Qmol／L）。当反应达到平衡时，若M的浓度为m mol/L，R的浓度为n mol/L，生成的配合物MaRb的浓度为y mol/L，则平衡常数为：
K＝y/（manb）
上式两边取对数得：
lgy＝a lgm＋b lgn＋lgK
将上式微分
dy/y＝a dm/m＋b dn/n
当吸光度达到最大值时，其一阶微分为零，则
dy/y＝0
因此 a dm/m＋b dn/n＝0
由 [M]＝m＋ay；[R]＝n＋by
所以 [M]＋[R]＝m＋ay＋n＋by＝Q
（a＋b）y＝Q－m－n
上式微分得 （a＋b）dy＝－dm－dn
当dy＝0时，dm＝－dn，代入式1-31
－a dm/m＋b dn/n＝0
则 m/n＝a/b 即 m＝na/b
吸光度最高点相应的横坐标CM ：CR，即配合物的组成比。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（6）
——应用吸光光度法测定配合物的组成
2 平衡移动法
在一系列相同体积的容量瓶中，加入一定量的金属离子M，以及逐点增量的显色剂R（保持M尚未全部形成配合物），显色定容使反应达到平衡，相对于各自的空白测量这一系列溶液的吸光度。在另一同体积容量瓶中，加入同样量M，过量的显色剂R，以便使M最大限度地被R配合，然后相对其空白测定最大吸光度Amax，以lg [Ai /（Amax－Ai）]对lg[R]作图，所得直线斜率即为配合比。这种方法称为平衡移动法又叫做有限对数法。此法对离解度较大的配合物以及可形成几种配合物的体系，也能得到满意的结果，因此应用较广。
假设配合平衡为
M＋nR ＝ MRn
K稳＝[MRn] /（[M][R]n）
lg（[MRn] / [M]）＝lgK稳＋n lg[R]
因为 [MRn] / [M]＝Ai /（Amax－Ai）
所以 lg [Ai /（Amax－Ai）]＝n lg[R]＋lgK稳 （1-32）
用lg [Ai /（Amax－Ai）]对lg[R]作图，所得直线斜率即为n。当l-32式中lg [Ai /（Amax－Ai）]＝0时，lgK稳＝－nlg[R]，因此，本法还可以求出配合物的表观稳定常数。
有时，所用显色剂的纯度并不知道，那么[R]的精确值就难以确定，但这并不影响平衡移动法的使用，可以用加入显色剂溶液的体积Vi去代替[R]。这可以通过简单的推导来说明。
lg [Ai /（Amax－Ai）]＝n lg[R]＋lgK稳
＝n lg（Vic未/V测）＋lgK稳
＝n lgVi＋n lg（c未/V测）＋lgK稳
＝n lgVi＋K’
式中 Vi——系列溶液各点加入显色剂溶液的体积；
c未——尚未精确知道的显色剂溶液浓度；
V测——显色测定溶液的体积；
K’——n lg（c未/V测）＋lgK稳。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（7）
——应用吸光光度法测定配合物的组成
3 摩尔比法
摩尔比法也称饱和法。此法是根据在配合反应中金属离子M被显色剂R所饱和的原理来测定配合物的组成的。
在实验条件下，我们制备一系列体积相同的溶液。在这些溶液中，固定金属离子M的浓度，依次从低到高地改变显色剂R的浓度，然后测定每份溶液的吸光度A，随着[R]的加大，形成配合物的浓度[MRn]也不断增加，吸光度A也不断增加，当[R] ：[M]＝n时，[MRn]最大，
吸光度也应最大。这时M被R饱和，若[R]再增大，吸光度A即不再有明显增加。用测得的吸光度对[R] / [M]作图，所得曲线的转折点相对应的[R] / [M]值，即为配合物的组成比。
用摩尔比法可以求配合物MRn的稳定常数K稳，其反应式为
M＋nR＝MRn
K稳＝[MRn] /（[M][R]n）
当金属离子M有一半转化为配合物MRn时，即[MRn]＝[M]，则
K稳＝1 / [R]n （1-33）
因此，只要取摩尔比法曲线的最大吸光度的一半所对应的[R]，并将已求得的n代入，即可求得配合物的稳定常数K稳。吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（8）
——应用吸光光度法测定配合物的组成
4 斜率比法
它是利用两条直线的斜率之比来测定配合物的组成。主要用来测定离解度小的配合物。
如果溶液中只存在下述反应：
aM十bR＝MaRb
先固定R的浓度，并保证过量，加入少量不同浓度的M，则配合物MaRb的平衡浓度与加入溶液中M的浓度cM成正比：
[MaRb]＝cM / a
A＝εl[MaRb]＝εl cM / a
以A对CM作图，就得到一条斜率为S1的直线：
S1＝εl / a
同理，如果保持M大量过剩并固定浓度，改变R的浓度，则得到一条斜率为S2的直线：
S2＝εl / b
S2 / S1＝（εl / b）/（εl / a）＝a / b （1-34）
因此，两直线斜率之比，就是配合物的组成比a / b。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（9）
——应用吸光光度法测定配合物的组成
5 直线法
此法又称阿斯马斯（Asmus）法。在一系列容量瓶中，加入固定量的金属离子M的标准溶液，加入不同体积V的试剂R的溶液。在实验条件下，显色，定容，测定吸光度A。根据阿斯马斯的计算，对形成MRb型配合物来说，加入试剂R的体积V的b次方之倒数与其吸光度A的倒数成直线关系。
对于下列平衡
aM十bR＝MaRb
K不稳＝[M]a[R]b / [MaRb]
[M]a[R]b＝K不稳[MaRb] （1-35a）
当达到平衡时，溶液中有
[M]＝cM－a[MaRb] （l-35b）
[R]＝cR－b[MaRb]
由朗伯-比尔定律得
[MaRb]＝A /εl （1-35c）
由式1-35a、b、c得
（cM－a×A /εl ）a[R]b＝K不稳×A /εl （1-35d）
当a＝1时，即为MRb型配合物，整理式1-35d得
1 / [R]b＝εlcM / K不稳×1 / A－1 / K不稳 （1-35e）
式1-35e中，K不稳、ε、l、cM在实验条件下，均为常数，且[R]与其加入的体积V成正比，则式1-35e可写为：
1 / Vb＝α×1 / A－β （1-35f）
式中 α＝εlcM / K不稳，β＝1 / K不稳
将式1-35f改写成一般函数式：
1 / Vb＝f×1 / A （1-35g）
令b＝1，2，3，…，用1 / Vb对1 / A作图，得出数条曲线，其中为直线的一条，其相应的b即为配合物中R与M之比
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（10）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
1.2.5.1 示差吸光光度法
示差吸光光度法是用一已知浓度的标准显色溶液与未知试样的显色溶液相比较，测量吸光度，从测得的吸光度求未知浓度。
设标准溶液的浓度为c，试样溶液的浓度为cx，则
A0=-－lg(I/I0)=abc
Ax=-－lg(Ix/I0)=abcx
lgI0－lgI＋lgIx－lg I0＝abc－abcx
lgIx－lg I＝ab（c－cx）
A差＝－lg（Ix / I）＝ab（c－cx） （1-36）
以A差对（c－cx）作图，可以求出c－cx，c为已知，则cx可求得。按所选择测量条件不同，示差吸光光度法有三种操作方法：
（l）高吸光度法。光电检测器未受光时，其透光度为零，光通过一个比试样溶液稍稀的参比溶液后照到光电检测器上，调其透光度（T）为100％，然后测定试样溶液的吸光度。此法适用于高含量测定。
（2）低吸光度法。先用空白溶液调透光度为100％，然后用一个比试样溶液稍浓的参比溶液，调节透光度为零，再测定试样溶液的吸光度。此法适用于痕量物质的测定。
（3）双参比法。选择两个组分相同而浓度不同的溶液作参比溶液（试样溶液浓度应介于两溶液浓度之间），调节仪器，使浓度较大的参比溶液的透光度为零，而浓度较小的参比溶液的透光度为100％，然后测定试样溶液的吸光度。
示差吸光光度法可以提高光度法的精确性，从而实现用吸光光度法对物质中某一含量较高或较低的组分的测定。例如对高含量成分的测定，有时可达到与重量法、滴定法同等的精确度。其降低分析误差的主要依据就是对刻度标尺的放大作用。例如，假定用普通光度法测量参比溶液的透光度为10％，试样溶液的透光度为 7％，仅相差 3％。若用示差法，将参比溶液的透光度调到100％，则试样溶液的透光度为70％，两者之差增为30％，相当于放大读数标尺10倍。从而相对地增大了这种测量方法的精确性（图1-4）。
在示差吸光光度法的测量中，要求一个实际具有较高吸收的参比溶液的表观刻度读数为A＝0或T＝100％，故所用的仪器必须具有出光狭缝可以调节，光度计灵敏度可以控制或光源强度可以改变等性能。
图1-4 不同测量方法的示差吸光光度法的精确性
Figure 1-4 The accuracy of differential spectrophotometry with different measurement methods
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（11）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
2 双波长吸光光度法
由于传统的单波长吸光光度测定法要求试液本身透明，不能有混浊，因而当试液在测定过程中慢慢产生混浊时就无法正确测定。单波长测定法对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样，也难于得到正确的结果。此外，试样池和参比池之间不匹配，试液与参比液组成不一致均会给传统的单波长吸光光度法带来较大的误差。如果采用双波长技术，就可以从分析波长的信号中减去来自参比波长的信号，从而消除上述影响，提高方法的灵敏度和选择性，简化分析手续，扩大吸光光度法的应用范围。
双波长吸光光度法是将光源发射出来的光线，分别经过两个可以调节的单色器，得到两束具有不同波长(λ1、λ2)的单色光，利用斩光器使这两束光交替照射到同一吸收池，然后测量并记录它们之间吸光度的差值⊿A。若使交替照射的两束单色光λ1、λ2强度都等于I0，则
－lg（I1 / I0）＝Aλ1＝ελ1bc＋As
－lg（I2 / I0）＝Aλ2＝ελ2bc＋As
As为光散射或背景吸收，若λ1和λ2相距不远时，As可视为相等，则
－lg（I2 / I1）＝Aλ2－Aλ1＝⊿A
＝（ελ2－ελ1）bc
上式说明，试样溶液在波长λ1和λ2处吸收的差值，与溶液中待测物质的浓度呈正比关系。这就是应用双波长吸光光度法进行测定的依据。
双波长测定法对混合组分分别定量时，一般是测定两个波长处的吸光度差，因此方法本身不能提高测定灵敏度。但是，用双波长法进行单组分测定时，如果选择显色剂的极大吸收波长和配合物的极大吸收波长作测定使用的波长对，由于形成配合物而降低之显色剂的吸收值直接加合在所形成的配合物的吸收上，使得配合物的表观摩尔吸光系数显著增加，这样使测定的灵敏度有所提高。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（12）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
3 导数吸光光度法
在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号。如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数吸光光度法有可能克服这些困难。
其原理是因为吸光度和摩尔吸光系数为波长的函数，所以朗伯-比尔定律可以用下式表示：
Aλ＝ελcl
将上式对波长进行一次微分，得
若对波长进行n次微分，可得
由此可知，吸光度对波长进行微分的微分值与吸收物质的浓度之间符合朗伯-比尔定律，因此它可以用于吸收物质的定量分析。
获得微分光谱的方法可分为光学微分法和电学微分法两类，后者已在多种类型的微机控制分光光度计中得到了应用，它通常可以获得一、二、三、四阶导数光谱。
导数光谱的测量有多种方法：
（1）如果基线是平坦的，可以测量峰-谷之间的距离，这是最常用的方法。
（2）在基线平坦的情况下，也可以测量峰-基线之间的距离，这时灵敏度虽有些降低，但精度较高。
（3）作两峰的连接线，测量两峰连线到谷的距离。只要基线是直线，不管它是否倾斜，总能得到正确的值。
（4）作峰顶与谷顶的切线，使其平行于基线，然后测量两平行线的距离。
关于导数吸光光度法提高灵敏度的规律，有人指出n阶（n＝1～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（13）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
4 三元配合物及其在光度法中的应用
（1） 三元（多元）混配配合物
由一种中心离子和两种（或三种）配位体形成的配合物称为三元混配配合物。例如Mo（Ⅵ）与NH2OH和硝基磺苯酚K形成的三元配合物。其结构式如图1-5所示。
图1-5 Mo（Ⅵ）-NH2OH-硝基磺苯酚K三元配合物结构式
Figure 1-5 Structure pattern of Mo（Ⅵ）-NH2OH-nitrosulfaphenol K complex
混配配合物形成的条件首先是中心离子应能分别与这两种配位体单独发生配位反应，其次是中心离子与一种配位体形成的配合物必须是配位不饱和的，只有再与另一种配位体配位后，才能满足其配位数的要求。混配配合物ML1L2中，L1和L2可能都是有机配位体，亦可能其中之一是无机配位体。由于配位反应的空间效应，其中一种配位体最好是体积小的单齿配位体，如NH2OH，H2O2，F－等，另一种是多齿配位体。混配配合物的特点是极为稳定，并且具有不同于单一配位体配合物的性质，不仅能提供具有分析价值的特殊灵敏度和选择性，并且常常能改善其可萃性和溶解度。例如，用H2O2测定V（Ⅴ），灵敏度太低（ε450nm＝2.7×102 L·mol-1·cm-1），用 PAR显色灵敏度虽较高（ε550nm＝3.6×104 L·mol-1·cm-1），但选择性很差。如果在一定条件下使之形成 V（Ⅴ）-H2O2-PAR三元配合物，不仅灵敏度较高（ε540nm＝1.4×104 L·mol-1·cm-1），选择性亦较好。
（2） 三元离子缔合物
离子缔合物型三元配合物与三元混配配合物的区别是一种配位体已满足中心离子配位数的要求，但彼此间的电性并未中和，因此，形成的是带有电荷的二元配离子，当带有相反电荷的第二种配位体离子参与反应时，便可通过电价键结合成离子缔合物型的三元配合物。这类配合物体系多属M-B-R型。M为金属离子，B为有机碱，如吡啶、喹啉、安替比林类、邻二氮菲及其衍生物、二苯胍和有机染料等阳离子，R为电负性配位体，如卤素离子X－，SCN－，SO42－，ClO4－，Hg I2－，水杨酸，邻苯二酚等。
离子缔合物型三元配合物在金属离子的萃取分离和萃取光度法中占有重要地位。由于在光度测定之前需要经萃取法分离、富集，因此，提高了测定的灵敏度和选择性。例如，在硫酸溶
液中，InI4－配阴离子可与孔雀绿阳离子（B+）形成离子缔合物 B+［InI4］－，用苯萃取，测定吸光度，ε＝l.05×105 L·mol-1·cm-1，用于测定铟，非常灵敏。需要指出的是，为了克服离子缔合物用于光度分析需经萃取分离，操作比较麻烦和有机污染的缺点，采用水溶性高分子，如聚乙烯酸、阿拉伯树胶等增溶分散的方法，不仅可以直接在水相中进行测定，而且提高了测定灵敏度。例如，在 1.1 mol／L HCl介质中，在聚乙烯醇存在下，Zn2+-SCN－-罗丹明体系的ε607nm＝2.6×106 L·mol-1·cm-1。
（3） 三元胶束配合物和增溶吸光光度法
当在金属离子和显色剂的配位体系中加入被称为表面活性剂的物质时，由于表面活性剂的增溶、增敏、增稳和褪色等作用，不仅能使某些原本难溶于水的显色体系可以在水溶液中测定，而且能大大提高分析的灵敏度，有时还能提高测定的选择性和改善测量条件。这类方法称为胶束增溶吸光光度法。
表面活性剂是一类既含有能与水相溶的亲水基，同时又含有能与油相溶的亲油基（疏水基）的物质。按其电离后活性部分是阳离子或阴离子而分为阳离子型、阴离子型和两性型表面活性剂。还有一类极难电离的表面活性剂称为非离子型表面活性剂。表1-4列出了常用的数种表面活性剂。
表1-4 吸光光度法常用的几种表面活性剂
Table 1-4 Common surfactants used in spectrophotometry
类 别/ 符 号/ 中 文 名 称
阳离子型/ CTMAB /溴化十六烷基三甲基铵
Zeph /氯化十四烷基三甲基苄基铵
阴离子型 /SDS /十二烷基硫酸钠
SLS /十二烷基磺酸钠
两性型 /DDAPS /3-（二甲基十二烷基铵）丙基-1-磺酸钠
非离子型/ TritonX-100/ p-1,1,3,3-四甲基丁基酚聚氧乙烯（9-10）醚
在低浓度时，表面活性剂在水中以离子或分子状态存在，但浓度超过一定值后（此值称该表面活性剂的临界胶束浓度），由于分子中烃链的疏水性而相互聚集形成胶束。由于吸光光度法中加入的表面活性剂量都在cmc值之后，所以称为胶束增溶吸光光度法。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（14）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
5 萃取光度、浮选光度和固相光度法
这三类方法都是将待测组分先分离、富集到另一相后再进行光度测定，从而提高测定灵敏度和选择性。
（1） 萃取光度法
把待测组分从一种液相（水相）转移到另一种液相（有机相），以达到分离和富集目的的过程称为萃取。萃取是基于溶质在两种基本不相混溶的溶剂之间的分配差异来实现分离的。只
要溶质在有机溶剂中的溶解度大于在水中的溶解度就可能实现萃取。由于带电荷的化合物不能进入有机溶剂，金属离子必须转变为不带电荷的配合物，或与带相反电荷的离子形成离子（对）缔合物后才能被萃取入有机相。
萃取光度法就是将溶剂萃取与光度测定相结合的一种分析方法。它将水相中的有色物质直接萃取到少量与水不互溶的溶剂中后进行吸光度测定，它特别适用于显色产物难溶于水的体系。由于萃取的分离和富集作用，能有效地提高测定的灵敏度和选择性。例如，用乙醚萃取Mo（Ⅴ）与 SCN－形成的配合物后进行光度测定，比直接在水相中测定灵敏度提高九倍；利用Pd（Ⅱ）与DDO（双十二烷基二硫代乙酸胺）二元配合物的萃取光度法测定钯，其ε高达3.6×106 L·mol-1·cm-1，是一种超高灵敏度的测定方法。
（2） 浮选光度法
浮选光度法可分为溶剂浮选和泡沫浮选两类。前者靠有机溶剂将水相试液中的待测物带到两相界面上，经分离和除去溶剂后，再把待测物溶于少量的另一种溶剂中进行光度测定。例如，在［H+］＝0.45 mol / L介质中，用环己烷作浮选剂浮选 Hg（Ⅱ）-I－-亚甲基蓝配合物使之与水相分离，蒸发除去环己烷，残余物溶于少量甲醇中后进行光度测定，ε670nm＝1.5×105 L·mol-1·cm-1。泡沫浮选法则使用适当的起泡剂（如表面活性剂），使待测组分以离子形式或配合物形式随泡沫一起与原试样溶液分离，随后加入合适的消泡剂消泡后进行光度测定。例如在pH7的条件下，以CTMAB作起泡剂浮选CN－-氯胺T-异烟酸吡唑啉酮配合物，然后用乙醇作消泡剂，可用于CN－的测定，ε638nm＝5×104 L·mol-1·cm-1。
（3） 固相光度法
这是利用固相载体（离子交换树脂、泡沫塑料或滤纸）对待测组分进行分离、富集并显色，随后直接测定固相吸光度的方法。例如，已有强碱性阴离子交换树脂作载体，用于BiI4－，Bi（Ⅲ）-4邻苯三酚红，Hg（Ⅱ）-双碱腙和磷（砷）杂多蓝等显色体系；强酸性阳离子交换树脂作载体用于Nb（Ⅴ）-5-Br-PADAP-酒石酸显色体系；泡沫塑料作载体用于Au（Ⅲ）-硫代米黄酮，Zn（Ⅱ）-双硫腙等显色体系的报导。
吸光光度法（紫外/可见光谱）讲座（15）
——提高吸光光度法灵敏度和选择性的某些途径
6 长光路毛细吸收管吸光光度法
根据朗伯-比耳定律，A＝εbc，当浓度不变而增大b时，A增大。换言之，可以通过延长吸收光程b来降低待测吸光物质的浓度c，从而提高光度法的测定灵敏度。近年来，提出了
全反射型长光路毛细吸收管吸光光度法。该法使用长至数十米的毛细管吸收池（Long Capillary Cell，简称 LCC），可以高灵敏度地测定溶液极其微弱的吸收。已有的报导表明，它已能顺利地测定水中pg／g级的磷和ng／g级的氟，使光度法测定铜、汞的灵敏度提高了三个数量级。用50m长的毛细管液芯光纤系统，可使Hg，I，Cu，P等元素的测定灵敏度达0.02pg／g。
从LCC的管型而言，已从最初较短的“直线型”、“弧型”和“圈型”，发展到较长的“螺旋型”和“光导纤维型”（图1-6）。例如，用内径为lmm，长10m的螺旋型耐热玻璃管作吸收池，或者用内径为250μm，长25m或50m的硅树脂涂覆的毛细纤维管作吸收池，后者称为“光导纤维型”吸收管。因此又称为液芯光纤长光路吸光光度法。
图6 长光路毛细吸收管
Figure 6 Long light path capillary absorption tube
从光在LCC中的传输方式而言，已有的研究认为，大致可设想为图1-7所示的两种形式：镜面反射和全反射。当光的传输介质满足全反射条件时，光主要以螺旋光线的形式通过LCC；当反射率不是100％，则光按镜面反射方式传输，此时入射光主要以较少的反射次数在同一平面内，按子午光线的形式通过LCC管。
图7 长光路毛细吸收管中的反射光路
Figure 7 Reflection light path in long light path capillary absorption tube
按Snell的折射定律
Sin（90°－θ）≥ n2 / n1 （1-39）
式中θ为入射角，n1为溶剂折射率，n2为 LCC材料的折射率。只有n1＞n2，即只有使用折射率大于 LCC材料折射率的液体做溶剂，才能在LCC中实现全反射。例如，常用作 LCC材料的石英玻璃和耐热（Pyrex）玻璃，在20℃时对589.3nm光的折射率分别为1.459和1.474。相同条件下，水的折射率为1.333，苯和二硫化碳的折射率分别为1.501和1.627。显色反应以水为溶剂时，入射光在LCC中主要以镜面反射方式传输。为了满足全反射的条件，必须把显色物质转入（如萃取）到高折射率的溶剂中。用于全反射的溶剂可以是单一溶剂，亦可以是混合溶剂（称为混折射溶剂）。
已有的研究表明，即使在镜面反射（如水作溶剂）的LCC中，灵敏度（吸光度）增加的倍率亦明显大于吸收管增长的倍率。例如，磷钼蓝法测磷，用1m的LCC比用通常1cm吸收皿灵敏度增加约300倍而不是100倍。这主要是由于吸收管壁的反射，增加了有效的吸收光程长度。在全反射条件下，由于高折射率的溶剂使入射光多重反射，进一步增大了有效的吸收光程长度，从而吸光度增加的倍率又明显高于镜面反射时的倍离，大约增至700倍。
由于随溶液浓度的增加，吸收增加，反射率下降，LCC内反射光的光路长减小。因此，吸光度增加的倍率随溶液浓度的增大而减少，从而使LCC的工作曲线曲率加大，偏离朗伯-比尔定律。所以，长光路毛细吸收管吸光光度法与普通吸光光度法不同，其工作曲线不是直线。
综上所述，全反射长光路毛细吸收管法可以高灵敏度地测定溶液中极其微弱的吸收，大大提高了光度法的灵敏度。虽然目前它的研究和应用还不够深入和广泛，其理论研究尚不成熟，但毋容置疑它是一种有发展前途的超微量分析法。
