2024年4月2日发(作者：)
.
临床生化知识系列讲座(三) 临床酶学检验技术
发布日期:2007-08-30 文字选择 大 中 小
第三章 临床酶学检验技术
临床酶学的实际应用可以追溯到上世纪初，至今已有百年的历史。到上世纪30年代，脂肪酶〔LPS〕、淀粉酶〔AMY〕、碱性磷酸酶〔ALP〕、酸性磷酸酶〔ACP〕开场用于临床。尤其在1959年，Karmen、La Due、Wroblewski等人建立了分光光度法，使得丙氨酸氨基转移酶〔ALT〕、门冬氨酸氨基转移酶〔AST〕、肌酸激酶〔CK〕、乳酸脱氢酶〔LD〕等酶活性测定应用于肝胆疾病、心脏疾病的诊断。他们建立的连续监测法和酶偶联技术直到现在仍是最常用的酶活性检测方法。酶这一生物催化剂，在正常机体代谢中起着重要的作用。在病理情况下，尤其一些细胞内酶，当细胞损伤时会释放到体液中造成体液中酶量或酶活性的改变，这就是酶可作为诊断指标的依据。因为有一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度梯度差，所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏度，这就引起临床病理学家和临床医生的极大关注，使酶学得到迅猛开展。上世纪60年代以后，人们发现同工酶及同工酶亚型比总酶活力具有更高的诊断特异性和灵敏度，使临床酶学领域有了更广阔的开展前景。随着免疫学和其它技术的渗透，测定酶质量成为可能。测定酶质量与测定酶活性相比，可以测定无活性的酶，且不受抑制剂的影响，因此，可以提供新的临床信息。
酶具有高效催化性和高度特异性决定了酶作为试剂的生物化学方法具备很多优点：如反响条件温和，不需强酸强碱，不需高温；方法特异性高，可直接测定体液中某组分；反响速度快；灵敏度高等等。因此，以酶试剂方法为代表的生物化学法必将取代化学法。酶作为催化剂，在反响前后无明显变化，即酶可反复使用，近年来以固相酶技术为核心的生物传感器技术的应用和开发研究正如火如荼地进展，可以预测我们将很快进入生物传感器时代。
第一节 酶含量的表示方法
酶具有高效催化性，极少量的酶可催化大量底物进展反响。理论上说，在底物足够和酶未失活的前提下，酶与底物孵育足够长的时间可以产生足够量的产物。假设检测单位时间的产物或底物变化量要比直接测定酶蛋白量显然容易得多。这种用酶促反响的速度来间接反响酶含量的方法就是通常所说的酶催化活性的测定。根据酶催化活性来表示酶含量的方法也称为相对定量法。"相对"的含义还包括酶.精品.
.
催化活性易受测定条件的影响。由于酶催化活性的测定方法简便快速，因此绝大多数的酶都是用此法测定。
一、酶的催化活性
〔一〕 酶活性单位
历史上曾经使用很多酶催化活性的"惯用单位" ，是以方法提出者的姓氏来命名的，他们根据当时的实验条件，提出各自的时间单位和产物或底物量的单位。例如谷丙转氨酶就有赖氏单位〔Reitman-Frankel〕、金氏单位〔King〕、卡门氏单位〔Karmen〕、穆氏〔Mohun〕单位等等。1963年国际生化协会酶学委员会通过广泛讨论，提出一个国际单位〔IU〕来表示酶量的多少。国际单位定义：在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物〔μmol/ min〕的酶量为一个国际单位。由于测定条件〔如温度〕不同，所转化底物的量将有明显差异。为防止临床上误认为只要是同一国际单位的酶量在国际上无论何处所测结果都一样，目前大多数实验工作者常省略国际二字〔简写也由IU改为U〕。几乎都习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度。1979年，国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位SI制相一致，提出了Katal单位，即每秒钟转化1个摩尔底物〔mol /s〕的酶量。国际单位和katal间关系如下：
1U＝1μmol /min＝1×10-6 /60s＝16.67nkatal
〔二〕正常上限升高倍数
酶催化活性或活性浓度是一个相对的概念，与测定方法及测定条件有关。不同的测定方法，酶活性的结果可以相差数倍。例如，乳酸脱氢酶用逆向反响测得的结果是正向反响的３倍。碱性磷酸酶的不同测定方法之间仅仅缓冲液不同，其结果也可以相差１倍以上。即使方法完全一致，配方也完全一致，由于试剂供给商的原料来源不同也会造成较大的差异，尤其是因工具酶的纯度和工具酶活性单位不同而造成。酶活性测定的影响因素如此之多，以至各实验室之间的测定结果难以比拟，参考值也难以统一，给临床医生带来不少麻烦。为了更直观地反映酶含量的变化，很多实验室开场使用正常上限升高倍数〔upper limits of normal, ULN〕这一表示方法。
所谓ULN是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限。这样做的好处是显而易见的，临床医生可以不要因记参考值范围而烦恼，但是对于临界升高的病情判断将带来新问题。在目前尚缺乏统一的校正品或标准以前，测定方法也不能完全统一的前提下，使用ULN有一定的好处，但对其临床意义应重新进展评价。
二、酶蛋白质量
酶的含量严格来说是指酶分子的质量浓度，常以酶蛋白浓度来表示〔单位是g/L或mg/L〕。人体体液中的酶有几百种，但总量不超过1g/L。除脂肪酶〔LPL〕、.精品.
.
卵磷脂胆固醇酰基转移酶〔LCAT〕、胆碱酯酶〔ChE〕、铜氧化酶〔CER 〕外，大多数酶的含量在μg/L水平甚至更低。要想从混合物的体液中别离纯化后再测定，显然是很困难的。但利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法可以直接测定酶蛋白浓度。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶〔G6PD〕、铜氧化酶〔即铜蓝蛋白Cp〕、神经元特异性烯醇化酶〔NSE〕、前列腺酸性磷酸酶〔PACP〕、CK-MB同工酶等。免疫学方法测得的是酶蛋白质量，即绝对含量。与酶活性相比，有很多优点：①灵敏度高，灵敏度到达ng/Ｌ至μg/Ｌ的水平。②特异性高，不象酶活性测定的影响因素那么多，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响，不受药物的干扰。③可测定一些酶活性很难测定的酶，如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白。④与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可能为临床应用提供新的资料和信息。⑤在同工酶测定中，与电泳法和层析法相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量少，重复性好。与化学抑制法相比特异性好。
尽管如此，由于制备具有高效价的酶抗体非常困难，建立免疫学方法的周期和本钱都相当巨大。因此，目前能测定的酶类还非常有限，但这将是一个很有前途的领域。
第二节 酶催化活性的测定方法
一、测定酶促反响速度的两类方法
酶促反响速度可以用单位时间的底物消耗量〔-d[S]/min〕或产物生成量〔d[P]/min〕来表示。一种直接用来测定速度的方法称为连续监测法，另一种在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度的方法称为定时法。
〔一〕 定时法
定时法〔Fixed time assay〕酶活性的结果计算：假设某一样品的酶活性为X U/L，取样品量Vs毫升与底物缓冲液Vr毫升孵育，经过t分钟反响，参加终止液Ve毫升，检测到产物净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数为 ε〔终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准求得〕比色皿光径为b cm。
根据
其中：C为产物的浓度，Vt为反响总体积， ，[P]为产物的总变化量，产物生成速度 样品中酶催化能力表示为：
酶活性 …………………………………………… 2.1
假设把A/t以ΔA/min表示，那么此定时法测定酶活性的计算公式与连续监测法一样
定时法有别于终点法〔end-point assay〕和两点法〔two-point assay〕。终点法是指反响根本到达平衡，信号变化很小，但可以不需要终止反响，例如化学反响或酶试剂测定代谢物，只能说明反响所需的某一组分已接近耗尽。而定时法的.精品.
.
特点是经过一定时间〔固定的时间〕反响后终止反响。两点法是监测反响过程中的两个点，即某一段时间内的底物或产物的变化。
〔二〕连续监测法
连续监测法〔Continuous monitoring assay〕是将酶与底物在特定条件〔缓冲液、温度等〕下孵育，每隔一定时间〔2-60s〕连续测定酶促反响过程中某一底物或产物的特征信号〔如NADH在340nm的吸光度〕的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。一个典型的酶促反响过程一般包括延滞期〔lag phase〕、线性期〔linear phase〕和非线性期〔non linear phase〕〔见图3-1〕。
图3-1酶促反响动力学曲线
1.延滞期 对单一酶促反响而言，是指酶促反响开场到达最大反响速度所需要的时间，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合位点的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活等等；对于酶偶联反响而言，延滞期还包括中间产物堆积到一定程度后，导致指示反响速度增加，直到与待测酶酶促反响速度到达平衡所需的时间。一般来说，辅助酶越多，延滞期越长。
2.线性期 是指酶促反响速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。此期底物虽被不断消耗但还缺乏以明显改变酶促反响的速度，即以初速度进展。初速度是指底物的消耗量小于5%时的速度。不过线性期也仅仅是一个相对的概念，在实际工作中往往需要人为地设定非线性度。
3.非线性期 随着反响的进展，底物消耗越来越明显，反响速度明显下降而进入非线性期。酶浓度越高在选定条件下线性期就越短。其他造成进入非线性期的原因有可逆反响增强、产物抑制增加、酶变性失活增加、酶聚合或解离增加等等。
连续监测法根据连续测得的数据，可以只选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。而定时法测得的酶活性是酶促反响的整个过程中的平均速度，有可能包括延滞期和非线性期。由于酶活性只与线性期的反响速度〔初速度〕成正比例，定时法很难避开延滞期，非线性期也不能完全避开，因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。延滞期、非线性期的速率低于线性期，所以定时法测得的结果往往偏低。自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于自动化仪器。
连续监测法酶活性的结果计算：假设某一样品的酶活性为X U/L，取样品量Vs与底物缓冲液Vr孵育，延滞期为t0分钟，测定间隔时间为t1分钟，读数次数为n，每间隔时间吸光度变化平均值为A，该产物的摩尔消光系数为ε 比色皿光径为b cm。反响速度分别用产物的生成速度和样品中酶的催化能力来表示：
.精品.
.
两者含义一致，经过整理，将〔Vs+Vr〕记为Vt， A /t1=△ A/min，可得到以下公式：
酶 ………………………………………………… 2.2
设： ；酶活性〔u/L〕=△ A/min×K ……………………………
二、底物或产物浓度的检测
不管是定时法还是连续监测法，都要通过测定底物或产物来实现。测定底物或产物的手段并不是酶促反响所特有，根据在酶促反响中任一底物或产物有特征性的物理化学特性〔如颜色、浊度、吸光度、pH、气体、荧光、放射性等等〕，设计一些检测装置。常用的检测装置有比色计、浊度仪、分光光度计、荧光分光光度计、量积仪、电位滴定仪、生物传感器等，其中分光光度法最常用。表3-1列举了曾经使用的一些检测技术。
表3-1 酶促反响中底物或产物浓度的检测
测定工程 方法原理 测定手段
胆碱酯酶 氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根 电位滴定法
脂肪酶 三油酸甘油酯悬乳液做底物，生成油酸甘油一酯，浊度下降 浊度法
淀粉酶 淀粉做底物，一定时间后，剩余的淀粉缺乏以使碘呈兰色 时间滴定法
丙氨酸氨基转移酶 赖氏法，利用丙酮酸与2.4二硝基苯肼形成苯腙 比色法
丙氨酸氨基转移酶 IFCC推荐法，利用NADH在340nm的光吸收特性 分光光度法
丙氨酸氨基转移酶 固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢，利用过氧化氢电极 生物传感器
N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶 4-甲基伞形酮N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷做底物，
生成荧光物4-甲基伞形酮 荧光
葡萄糖6磷酸脱氢酶 NADPH在365nm激发下产生荧光 荧光
三、酶活性测定方法原理
如前所述，酶促反响速度用单位时间底物消耗量或产物生成量来表示。通过底物或产物一些特殊的理化性质设计检测方法，分为直接法和间接法：
〔一〕 直接法
是指待测酶酶促反响的底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测。常用的原理有：
1．基于NADH或NADPH的反响原理 NADH或NADPH在340nm处有特异吸收峰，而NAD+或NADP+只在260nm处有明显的吸收峰，监测340nm吸光度变化可以反响NADH或NADPH的变化。利用该原理可以测定以NAD〔P〕+或NAD〔P〕H为辅酶的氧化复原酶。例如LD、葡萄糖6磷酸脱氢酶〔G-6-PD〕、α-羟丁酸脱氢酶〔α-HBD〕、醇脱氢酶〔AD〕、山梨醇脱氢酶〔SD〕、谷氨酸脱氢酶〔GLDH〕等
.精品.
.
2．基于人工合成色素原底物反响原理 一些水解酶类或转移酶类经过酶促反响将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为色素原底物。根据这一原理，人们有意识地合成一系列底物用来测定酶活性，即人工合成色素原底物，利用这类底物测定的酶见表3-2。
表3-2 人工合成色素原底物与待测酶
人工合成色素原底物 待测酶 产物的毫摩尔吸光系数
4-硝基磷酸酚钠盐〔PNPP-Na2〕 碱性磷酸酶〔ALP〕 4-硝基酚PNP〔405nm〕18.5
3-羧基-γ-L-谷氨酰对硝基苯胺 γ-谷氨酰转移酶〔GGT〕 5-氨基-2-硝基苯甲酸
〔405nm〕9.87，pH为8.10
2-氯-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷 淀粉酶〔AMS〕 2-氯酚2-CP〔405nm，pH6.0〕6.1
2-氯-硝基苯-α-岩藻糖苷 α-岩藻糖苷酶〔AFU〕 2-CP〔405nm，pH6.5〕6.2
甘氨酰脯氨酰-对硝基苯胺-对甲苯磺酸 甘氨酰脯氨酸二***氨基***酶〔GPDA〕对硝基苯胺4NA〔405nm〕9.88
3．基于氧的消耗 氧化酶在催化反响时会不断消耗氧气，可以设计氧电极来连续监测氧的消耗速度。
4．其他 胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生乙酸，造成pH下降，可以用pH差示法测定胆碱酯酶。脱羧酶在反响过程中产生CO2，可以用量积法测定。
〔二 〕间接法
是指酶促反响底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反响或生化反响，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法。
1．化学法 大多数定时法都是在酶促反响终止后参加另一个试剂与底物或产物反响，转化为有色化合物，再用分光光度法检测。也有个别酶类不终止反响，参加与酶促反响无关的试剂，但能与酶促反响的某一产物反响生成有特征性的化合物。例如：①胆碱酯酶催化酰基硫代胆碱类底物后，生成的硫代胆碱〔SCh〕与5，5-二硫代-双〔2-硝基苯甲酸〕〔DTNB〕反响，生成黄色阴离子5-巯基-2-硝基苯甲酸〔5-TNBA〕。②酸性磷酸酶测定，利用α-萘酚磷酸盐做底物，经酸性磷酸酶水解后释放萘酚，与试剂中的固红TR发生偶氮反响，生成黄色化合物。
2．酶偶联法 在酶活性测定时，常采用另一个〔指示酶〕或几个酶〔辅助酶和指示酶〕将测定酶的某一产物转化为新的产物，当其他酶的反响速度与待测酶反响速度到达平衡时，可以用指示酶的反响速度来代表待测酶的活性。可以表示为：
.精品.
.
Ex为待测酶，Ea为辅助酶，Ei为指示酶，指示酶是指能监测反响速度的酶，辅助酶在酶偶联反响中可以一个或多个，也可以不需要辅助酶。由于NAD〔P〕+或NAD〔P〕H在340nm的光吸收特性，很容易进展连续监测，因此它是最常用的指示反响，过氧化物酶〔POD〕也可做指示酶。表3-3例举了需要指示酶的酶偶联方法来测定酶活性
表3-3 用酶偶联方法来测定的酶
待测酶 测定方法 辅助酶 指示酶
丙氨酸氨基转移酶 IFCC推荐法 无 LD
门冬氨酸氨基转移酶 IFCC推荐法 LD* MD
肌酸激酶 IFCC推荐法 HK G6PD
5,-核苷酸酶 5,-AMP做底物
ADA-GLDH法 腺苷脱氨酶ADA GLD
淀粉酶 EPS底物法 无 多功能α-葡萄糖苷酶
脂肪酶 GK-GPO-POD法 GK、GPO、共脂肪酶 POD
5,-核苷酸酶 5,-IMP做底物
NP-XOD-POD法 核苷磷酸化酶〔NP〕
黄嘌呤氧化酶〔XOD〕 POD
* LD并不是真正意义上的辅助酶。
第三节 酶活性测定的影响因素与最适条件确实定
一、方法因素的影响
〔一〕 正向反响与逆向反响
选择正向反响还是逆向反响，并不是随心所欲。一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。原那么上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向。当然，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。肌酸激酶就是一个很好的例子，因其逆向反响是正向反响的6倍，而且不受ATP酶、ALP、内源性丙酮酸干扰，所以，目前普遍采用逆向反响。但是，乳酸脱氢酶的测定选择正向或逆向反响，目前尚有争议。国内多采用正向反响〔L→P〕，与IFCC在2001年发表的操作手册一致。理由是经常被组合在心肌酶谱中，正向反响有利于LD1的活性表达，有更高的诊断敏感性，试剂稳定性好。而以前国外常用方法却是逆向反响〔P→L〕，理由是反响速度是正向的3倍，而且试剂本钱低廉，虽然NADH价格高昂但用量很少。
〔二〕 检测底物或检测产物
同样，选择测定底物或产物的方法主要取决于哪个更方便。原那么上应选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。为了让全部的酶能够与底物结合，底物量往.精品.
.
往很高，而且酶促反响测定的是初速度，时间较短。假设测定底物的消耗量〔起始底物浓度-剩余底物浓度〕一方面要求起始底物浓度不能太高，另外在很短的时间内，底物的消耗并不明显，测定误差大。而测定产物因为产物从无到多，检测敏感度必然增加。这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。除了测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少工程采用测定底物消耗量。假设有两个以上产物，选择测定哪个产物，也要从测定的方便性、内源性干扰等方面综合考虑。例如ALT催化以下反响：
丙氨酸+α-酮戊二酸------→谷氨酸+丙酮酸
既可以测定谷氨酸的生成速度，也可以测定丙酮酸的生成速度，IFCC推荐法是测定后者。从理论上讲，测定谷氨酸也是可行的。可以偶联谷氨酸脱氢酶，测定NADH在340nm的增加速度。反响式如下：
谷氨酸+NAD+------→α-酮戊二酸+NH3+NADH
但是该法至少有以下缺点：①α-酮戊二酸作为待测酶ALT的底物又是指示酶GLDH的产物。根据待测酶对底物的要求，α-酮戊二酸的用量往往较大，这样对于指示反响来说是极其不利的，过量的α-酮戊二酸肯定会抑制指示酶的反响速度，结果使延滞期延长，指示酶用量必须加大。②待测酶丙氨酸氨基转移酶的最适pH与指示酶谷氨酸脱氢酶最适pH相差较大，要快速到达平衡，也需要增加指示酶的用量。而待测酶丙氨酸氨基转移酶与乳酸脱氢酶的最适pH接近。③内源性干扰问题。IFCC推荐法测定丙氨酸氨基转移酶存在内源性的丙酮酸干扰，但是，内源性谷氨酸的干扰更常见。综合以上因素，通常测定丙酮酸的生成速度而不是测定谷氨酸的生成速度。不过，生物传感器的方法是通过测定谷氨酸的生成速度，原因是氨电极的技术比拟成熟。
〔三〕 定时法与连续监测法
如前所述，连续监测法可以选择线性期的反响速度〔初速度〕来计算酶活性，因此，测定结果更可靠，而且一般不需做样品空白，干扰相对较小，是首选的方法。但仪器要求相对较高，在我国基层单位还经常使用定时法。
在不具备分析仪的单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比拟准确的结果。例如：碱性磷酸酶的测定就是一个典型的例子。IFCC推荐法以4-硝基磷酸酚钠盐〔PNPP-Na2〕为底物，以2-甲基-2-氨基-1丙醇〔AMP〕做缓冲液。由于①该法延滞期短，小于1分钟；②线性期长，400U的样品，线性期可达15分钟；③产物对硝基酚有标准品供给，④终止液NaOH不会对产物的摩尔消光系数有影响。因此，很容易在酶促反响条件不变的情况下，将连续监测法改为定时法。两法的结果准确性相当，唯一的缺点是需加做样品空白。
〔四〕 底物启动模式与样品启动模式
.精品.
.
底物启动模式是指样品先与局部试剂〔缺乏某个底物〕预孵育一定时间，然后参加这个底物，样品中的待测酶酶促反响才开场启动。这样做的好处是在待测酶酶促反响开场之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。而样品启动模式是指反响所需的试剂先混合在一起，然后参加样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反响，只是在延滞期去除局部干扰物，可采用单一试剂剂型，需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。
二、测定条件的影响与最适条件确实定
酶的催化活性只与酶促反响的最大速度成正比例，推导如下：
酶促反响的整个反响过程可简化为：
式中Kp可看成为ES的解离常数.Michaclis和Menten通过推导可得出下式：
此式中V为最大反响速度， , 为米氏常数。上式也可改写为：
在底物[S]>>Km时，Km值由于相对很小可忽略不计：
由于底物[S]浓度很大，使酶饱和。ES已达极限，反响速度不再增加，故此时反响速度为最大反响V。
此时反响速度才和酶量E成正比例。也只有在此根底上建立起来的测定方法才是可靠的、准确的。
国际临床化学联合会〔IFCC〕和不少国家包括我国的一些学会建立了测定酶活性浓度的推荐或参考方法。都毫无例外地提出酶活性浓度测定方法所选择的测定条件应是酶反响的"最适条件"。所谓最适条件是指能满足酶促反响速度到达最大反响速度所需的条件。包括：①适宜的底物和最适底物浓度；②理想的缓冲液种类和最适离子强度；③反响液的最适pH；④最适反响温度；⑤适宜的辅因子、激活剂浓度；⑥假设是酶偶联反响，还需要确定指示酶和辅助酶的用量；⑦合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期；⑧适宜的样品与反响试剂的比例；⑨足够的检测范围；⑩尽量去除各种抑制剂等。
〔一〕 底物种类和浓度
1．底物种类的选择 不同酶对底物的专一性有很大的区别。丙氨酸氨基转移酶对底物有立体构造选择性，只能催化L型丙氨酸。假设选择DL丙氨酸，要到达同.精品.
.
样的反响速度，那么需2倍于L型丙氨酸的用量。对于这些特异性很高的酶而言，选择底物的种类比拟简单。但对于一些特异性较差的酶来说，底物种类的选择必须要有理论依据。例如碱性磷酸酶是一组非特异的磷酸酯酶，能将磷酸盐从一个化合物转移到另一个化合物。历史上用于碱性磷酸酶的底物有：β-甘油磷酸钠、磷酸苯二钠、萘酚磷酸盐，而目前使用最多的是人工合成底物对硝基酚磷酸盐。底物选择的原那么是：
〔1〕选择Km最小的底物：最好是酶的天然底物，要使酶到达同样反响速度的底物用量最低，不受溶解度和价格的限制。
〔2〕要有足够的溶解度：例如GGT测定，过去用γ-L-谷氨酰对硝基苯胺做底物，由于它溶解度差而被γ-L-谷氨酰-3-羧基对硝基苯胺所取代。
〔3〕酶对底物特异性高：例如淀粉酶的测定，以2-氯-4-硝基酚-麦芽三糖苷做底物，不需要偶联酶可以直接测定淀粉酶，但因为它也是体内α-葡萄糖苷酶的底物而不能成为淀粉酶测定的参考方法。假设以2-氯-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷做底物，就不会被α-葡萄糖苷酶所催化，也不需偶联酶，可以直接测定淀粉酶。
〔4〕底物稳定性好：例如用于淀粉酶测定的人工合成底物很多，但都存在一个共同的缺点，即底物本身可以自发水解。淀粉酶测定的参考方法-亚乙基封闭的对硝基酚麦芽庚糖苷做底物〔EPS法〕的优点就是底物的稳定性好。
另外，也要考虑选有较高临床价值的底物。例如临床上测定酸性磷酸酶主要目的是诊断前列腺癌，所选的底物应对前列腺酸性磷酸酶有较高的特异性。在常用的底物中以麝香草酚磷酸盐最适宜。乳酸脱氢酶几乎存在于全身各个组织，对脏器疾病的诊断特异性不高。对底物的选择性也不高，除丙酮酸外，α-酮丁酸也是它的底物。α-羟丁酸脱氢酶测定实质上就是以α-羟丁酸做底物，反映乳酸脱氢酶的H亚基的活性。
2．底物浓度确实定
〔1〕单底物酶促反响：根据Michaclis-Menten方程很容易得出以下结论：在反响速度为最大反响速度V一半时，[S]＝Km，此时的底物就相当于酶的米氏常数Km。以mol/L表示之，大多数酶Km在10-3至10-5mol/L之间；假设[S]＝10Km，那么反响速度到达最大反响速度的90.9%；假设[S]＝20Km，那么反响速度到达最大反响速度的95.2%；只有当[S]无穷大时，反响速度才到达最大反响速度，这在实际工作中是不可能的。因此，底物浓度确实定原那么是选择[S]＝10Km～20Km，此时反响速度根本到达最大反响速度，测定的误差可以承受。某些水解酶如碱性磷酸酶测定，由于另一底物是水，可以按单底物酶促反响对待。
〔2〕双底物酶促反响：双底物酶促反响动力学与单底物相比更复杂，可以分为.精品.
.
乒乓机制、序列有序机制和随机机制等，底物浓度确实定以动力学方程为根底。有关动力学方程可以参考相关论著。所有双底物酶促反响的动力学方程可以用下式表示：
F是指v/V，即反响速度到达最大反响速度的程度，一般要求90%～95%，Ka、Kb分别代表两个底物的米氏常数，在反响条件确定时，是个常数。 [A]、[B]是两个待确定的变量，分别代表两种底物的浓度，K值在乒乓机制是常数1，在其他机制是变量但接近于1，在实际工作中为了方便，可以认为是常数1。如果规定F的值，那么：
也就是说[A]/[B]之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。在实际工作中，可综合价格、溶解度等因素，先确定其中一个底物的用量，再求出另一个底物的用量。
以上所述的底物选择原那么在实际工作中有一定的指导意义，但是需要注意，酶促反响很复杂，可逆反响，产物抑制，其他激活剂和抑制剂的存在都影响着最适底物浓度确实定。
〔二〕缓冲液种类、离子强度和最适pH
为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要适宜的解离状态。酶催化基团作用的发挥也需要酶、辅助因子的有效解离，酶的稳定性也需要适宜的环境。这一切都离不开缓冲液的作用。一个酶促反响的表现很大程度上依赖于缓冲液的选择是否恰当。依据缓冲液对酶活性的影响可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液三大类。
在一系列不同pH的最终反响体系中，酶促反响速度到达最大时的pH称为最适pH。一般来说，血清中大多数酶最适pH接近中性。有些酶在最适pH附近活性变化非常显著，但多数酶在一定pH范围内相对稳定。测定酶活性时一定要选择在最适pH处。最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变，如缓冲液种类、底物浓度、反响温度、样品与反响试剂的比例、各种防腐剂和其它添加剂等等。
缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，一般选择与生理环境的体液比拟接近的离子强度。Allert曾拟定了一种作用模式，并进展数学计算，得出相应方程式来说明反响体系中电解质会影响最大反响速度。结论是：离子强度越高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也会抑制酶活性。缓冲液的离子强度在碱性磷酸酶测定中是个特例。按IFCC推荐法规定，以2-甲基-2-氨基-1丙醇〔AMP〕做缓冲液，缓冲液浓度高达0.85mol/L，这在酶类测定方法.精品.
.
学中极其罕见。其理由是：AMP是作为磷酸转移作用中的磷酸基受体，不仅仅起到缓冲作用，还有类似底物的作用。
理想的缓冲液应具备以下条件：①有足够的缓冲容量，较低的离子强度就可以维持pH的恒定。缓冲液的pKa与最适pH越接近，缓冲容量越大。有酸碱的产生或消耗的酶促反响，对缓冲容量的要求更高。②纯度高，不含有抑制酶活性的杂质。③温度依数性小，受温度波动pH变化小。④对酶活性表达有促进作用那么更好。尽量选择活性缓冲液或惰性缓冲液，不可选择抑制型缓冲液。⑤对酶有稳定作用。
目前酶制剂中或测定体液中酶活性方法使用最多的是GOOD氏系列缓冲液。其它常用的缓冲液有三羟甲基氨基甲烷〔Tris〕、三乙醇胺〔TRA〕、二乙醇胺〔DEA〕、2-甲基-2-氨基-1丙醇〔AMP〕，而磷酸盐缓冲液已越来越少使用，甘氨酸缓冲液对酶有抑制作用，已几乎不在使用。
值得注意的是，缓冲液都有温度依数性，配制缓冲液时不仅要指出其pH值，还应说明配制温度，以防止因温度不同而引起的误差。
由于最适pH不是酶的特征性常数，在实际工作中一般做法是，先确定大致的最适pH，再确定缓冲液的种类，最后重新确定最适pH。
〔三〕反响温度
温度越高，反响活化能越大，酶与底物结合的时机越多，反响速度越快。但是，温度增高，酶的变性失活就会增加，不同酶的最适温度可以不同，至今，对酶活性的测定温度还未统一。目前常规实验室越来越多的使用37℃，这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度越高，反响速度越快，灵敏度越高，延滞时间和测定时间都可能缩短，有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反响系统很快升温并维持在37℃，可防止温度差异引起的误差。对于生化分析仪而言，每个酶测定的温度不同是不现实的。值得注意的是，在比拟不同实验室测定结果时，一定要注意温度不同带来的差异。
在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃，优点是能保证一定的反响速度，又不使酶失活，而且纯镓的熔点为29.77℃，镓作为此温度的基准物质。保证了测定仪器在30℃的高度准确性。
2001年IFCC正式发表了"37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统"，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五个酶在内。
〔四〕辅酶、辅基和激活剂
根据酶催化反响最适条件的要求，原那么上在酶测定体系中应参加一定量的辅助因子。辅助因子〔cofactors〕是指酶的活性所需要的一种非蛋白质成分，包括辅酶、辅基和金属离子激活剂。与酶严密结合的辅因子称为辅基；不含辅基.精品.
.
的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白〔apoenzyme〕，没有催化活性，必须参加足量辅基，和它结合成为全酶〔holoenzyme〕，才有催化活性。脱辅基酶蛋白与辅基孵育一段时间后，酶活性才会恢复，因此，往往需要样品与试剂中的辅基先预孵育的过程。辅基的用量往往较少。
与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开的称为辅酶〔Coenzyme〕。辅酶尽管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物类似，在酶反响过程中与酶结合、别离及反复循环。辅酶用量确实定可将它们按底物处理。例如乳酸脱氢酶中辅酶按双底物动力学方程计算。
激活剂〔activator〕的化学本质是金属离子，可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。作为激活剂的金属离子，其影响酶促反响的动力学更加复杂。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金属离子大多是酶的变性剂。金属离子之间往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶测定体系中经常参加EDTA目的是螯合一局部非必要的离子。适宜的金属离子浓度是必要的，过量的离子往往抑制酶反响速度。由于激活剂的动力学往往与酶的动力学不同，这就可以解释不同的样品与反响液的比例，造成酶活性测定结果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸对肌酸激酶的激活作用与此类似。激活剂的用量一般通过反复实验来确定。
〔五〕抑制剂
酶活性测定过程中最常见的抑制剂有产物的抑制、底物的抑制，分析器材或试剂中的重金属及体液中的药物等造成的抑制。抑制类型也可以各种各样，可以是可逆抑制，也可以是不可逆抑制。按最适条件的要求，不管哪种抑制，都要尽量去除。采取的措施包括：选用高纯度的原料、高纯洁水、器材干净，在反响液中参加金属螯合剂，甚至可以引入一个副反响来去除产物的抑制作用。
〔六〕酶偶联法中辅助酶、指示酶
酶偶联反响原理：酶偶联反响的反响模式如下：
对于待测酶Ex，反响条件要求满足最适条件。反响开场后，经过一个短暂的延滞期，不断地产生中间产物B，启动辅助酶反响Ea，同样经过一个延滞期，产生中间产物C，最后启动指示反响Ei。由于在最初的反响体系中，中间产物B和C的量几乎为零〔不考虑内源性存在〕，此时辅助酶和指示酶的反响速度很小。但是，它们的最大反响速度却很大〔由试剂中参加的酶量来决定〕，甚至远远大于待测酶的最大反响速度。随着反响的进展，中间产物B和C的量逐渐增加，辅助酶和指示酶的反响速度也相应增加，直到辅助酶和指示酶的反响速度到达待测酶的反响速度，即进入动力学的线性期，并会维持一定时间，在此之前的时间称为.精品.
.
延滞期。此时，Vx=va=vi，va和 vi是辅助酶和指示酶此时的有效反响速度，并不是它们的最大反响速度。这样我们就可以监测产物D的生成速度或中间产物C的消耗速度，既vi来反映Vx，求出待测酶的酶活性。
1．指示酶、辅助酶的种类 指示酶和辅助酶选择的依据是：①考虑特异性，尤其是指示酶，如果指示酶存在副反响，那么使测定酶的结果假性偏高。②考虑辅助酶的数量，减少辅助酶就可以缩短延滞期。③酶偶联反响的合理性，如能直接与指示酶偶联，就没有必要参加辅助酶。④所选用的指示酶、辅助酶应尽量选择Km小的酶，可以缩短延滞期。⑤考虑指示酶、辅助酶的最适条件〔尤其是最适pH〕尽量与测定酶的"最适条件"接近。整个体系的测定条件必须以测定酶为准。⑥还需考虑价格、来源和纯度及酶的稳定性。来源不同的酶，Km有明显差异，甚至辅酶也不同，耐热性也有很大的区别，酶试剂的质量很大程度上取决于工具酶的来源。
2．指示酶、辅助酶的浓度确定 辅助酶或指示酶用量缺乏的后果是延滞期延长，待测酶的可测范围变窄，严重时不出现线性期。辅助酶或指示酶用量过大，本钱增加，杂酶的干扰程度增加。所以在酶偶联测定法中，选用适当量的工具酶是一个重要的问题。一般可用反复试验法，即试验性地选用不同量的工具酶直到偶联酶反响中指示酶反响速度不随工具酶的增加而升高，并在所选用?quot;最适条件"下，延滞期适宜，有足够的线性期，待测酶上限符合临床要求，酶浓度曲线线性关系好等。
很多专业书籍还介绍了一些酶用量的估算方法，这在实际工作中有一定的指导意义。但是应考虑到酶供给商的单位定义和测定方法之间是否存在差异，而且酶在运输保存中会有酶活性的丧失，测定体系中的其它条件如缓冲液、保护剂等都会影响酶的用量。实际用量往往比最适用量增加1倍以上。
〔七〕延滞期、线性期确实定
在以上条件都确定以后，动力学特征和方法的性能根本确定。动力学特征包括延滞期、线性期和非线性期。延滞期可以因酶在样品中所存在的介质不同而略有差异，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存在一些抑制剂。延滞期确实定原那么是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。
线性期确实定离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的缺乏和产物的抑制将导致非线性期的提前到来。不过也与非线性度的大小有关，没有绝对意义上的线性期，线性期是以指定的非线性度作为判断根底的。线性期如何确定呢？主要看读数次数和读数间隔来决定，为了计算非线性度，按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般仪器要求30秒就足够了，线性期在2分钟以上即可。中华医学会.精品.
.
检验学会规定酶活性测定要求线性期不短于2.5分钟。假设规定线性期不短于2.5分钟可以测得酶活性的最高浓度就是该法的测定上限。
〔八〕样品与试剂比例
样品量与反响液总量的比例与方法检测的灵敏度和检测上限有关，与测定误差也有关。根据酶活性计算公式不难看出，改变样品与反响液总量的比例就可以改变K值。按仪器噪音0.001计算，K值不易过大，否那么会造成检测误差加大。
值得注意的是酶活性的发挥与介质有关，经常发现改变样品与反响液总量的比例，测定结果并不会成正比例地改变，可能与激活剂、抑制剂、酶的解聚和聚合、酶的稳定性等因素有关。因此，样品与反响液总量的比例一旦选定，就不能随意更改。
从以上分析中不难看出：酶促反响的影响因素很多，各因素之间有相互影响相互制约，没有绝对的"最适条件"，但只要按照最适条件的目标，在建立方法时，努力靠近最适条件，必将缩小方法之间、试剂之间的差异。
三、其他因素对测定结果影响
〔一〕仪器
不同的仪器，波长的设置有区别，带宽有区别，比色杯的透光性在使用过程中也会发生改变，这些都直接影响仪器对待测物的摩尔吸光系数，也就影响K值的准确性。最好定期检查仪器的摩尔吸光系数。K值的设置还需考虑稀释体积、比色杯的光径、副波长的影响等。
〔二〕校准物
可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，可用于校准仪器的摩尔吸光系数。产物NAD〔P〕H的摩尔吸光系数可以用葡萄糖测定试剂〔己糖激酶法〕来校正。假设用双波长测定那么只适用于该双波长。另一类称酶校准物〔Enzyme calibrator〕，多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比拟接近。国际上已经有5个经IFCC认可的CRM 酶参考物。各试剂供给商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。在实际工作中，使用酶校正物的优点有：①可以缩小因试剂配方差异造成的误差。如因保护剂、原料来源不同等造成的差异。②可以校正在试剂稳定性稍有改变造成的误差。③可以校正仪器的某些系统性误差。如波长带宽、温度、加样误差等。但是它无法补偿分析系统的特异性缺陷和精细度缺陷，而且在不同的检测系统应有不同的校正物。
〔三〕实验参数
实验参数的正确理解和编制对测定结果也有很大的影响。样品量、试剂量、延滞期、测定时间、K值等都是很关键的参数。对于色素原底物的方法，由于底物的.精品.
.
自身水解作用，应采用减试剂空白的速率法；对于辅助酶或指示酶中杂酶引起的干扰，也应采用减试剂空白的速率法；对于内源性干扰的反响，不同的仪器应分别对待，不能盲目采用减空白的速率法，要区分是试剂空白还是样品空白。其他一些质量保证参数在酶活性测定中也应引起重视。
〔四〕副反响
NAD〔P〕H的光吸收特性成为目前使用最多的指示反响。但是，体内存在数以百计的氧化复原酶，它们的辅酶很多是一致的。假设存在内源性代谢物，必然会相互干扰。解决副反响的干扰，一直是人们努力的方向。通过参加副反响抑制剂、样品进展预处理等都是切实可行的手段。双试剂底物启动模式因不增加本钱、不消耗时间是最经济的方法。
总之，酶催化活性浓度的测定影响因素多，只有将各种影响因素都控制好，不同实验室的测定结果才具有可比性。要实现全球可比性的目标，应从以下几个方面着手：首先，测定方法要统一，各实验室都应选择IFCC推荐法或中华医学会推荐的方法。其次，各试剂供给商应严格按照IFCC推荐法所规定的配制方法生产试剂，并提供本测定系统的酶类校正物。另外，各实验室的操作人员应合理编制分析仪参数；参加各地区组织的酶类室间质评工作，不断提升实验室的比对能力；控制样品采集和保存等实验前因素；认真做好室内质量控制，监控试剂质量和仪器性能。
第四节 代谢物的酶法测定
酶试剂法是以酶作为试剂来检测与酶促反响相关物质的一类方法。酶试剂法因具有反响条件温和平安、样品不需预处理可直接测定、方法特异性高、灵敏度高等优点，已广泛应用于体液中各种有机物的测定，如葡萄糖、尿素、肌酐、胆红素、尿酸、胆固醇、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸、氨等等，也可以用来测定无机离子和微量元素如钾、钠、氯、无机磷、碳酸氢根、铜、锌、镁等。
一、方法分类
在所有用酶作为试剂的测定方法中，分光光度法仍然是最常用的测定手段。根据方法设计的原理不同可以分为：
〔一〕直接法
在相对应的氧化复原酶作用下产生可以直接检测的信号的方法称为直接法。尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在293nm有特异的吸收峰，胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造成450nm处的吸光度下降，而乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、碳酸氢根经氧化复原反响，使辅酶在氧化型与复原型之间转换，很容易用分.精品.
.
光光度法检测。体内还有很多代谢物可以直接测定，关键是需要相对应的酶。
〔二〕酶偶联法
与酶活性测定一样，直接法测定工程是有限的。而酶偶联法假设不限制偶联酶的数量，不考虑酶的来源和价格，从理论上讲几乎可以测定所有代谢物。而且，每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法。如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反响主要分为NAD(P)H和过氧化物酶〔POD〕系统两大类。
〔三〕无辅基酶活性恢复法
很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。将脱去关键无机离子、微量元素或辅酶的酶〔无活性〕与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。成功的例子有丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾，α-半乳糖苷酶法测定钠、淀粉酶法测定氯、超氧化物歧化酶法测定铜、碳酸苷酶或碱性磷酸酶法测定锌、异柠檬酸脱氢酶法测定镁等。根据此原理也可用来测定辅酶。
〔四〕激活剂和抑制剂测定法
根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反响动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量，成功的例子有己糖激酶法测定镁、碱性磷酸酶法测定茶碱等。
二、测定原理
如上所述，酶试剂方法可基于不同的原理来设计方法，但从监测类型来分，可分为终点法〔平衡法〕和连续监测法〔速率法〕。所谓平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反响逐渐被消耗，当剩余的底物量很小〔<1%～5%〕时，指示反响信号逐渐到达稳定，即通常所说的终点。该法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是"浓度"。连续监测法是测定速度〔通常指的是初速度〕，依据是当底物的消耗量较小时(<5%)，酶促反响呈一级反响，反响速度〔v〕只与代测物的浓度成正比例。两种方法是相互联系的，因为平衡法的开场一段时间都有可能遵循一级反响规律。相反，连续监测法只要时间足够长，也会到达平衡。酶促反响速度受很多因素影响，只有在其它因素很好控制的前提下，反响速度〔v〕才与代测物的浓度成正比例，该法测定误差较大。但也具有很多优点：①因测定时间短，检测速度快，不需把所有底物转化为产物，酶用量比平衡法小，检测本钱低；②速率法一般不需做样品空白，标本本身因素影响小。平衡法假设要将代测物在较短时间内消耗接近完全，必须使用大量的酶。但其优点是试剂酶活性的下降对测定结果影响远没有速率法明显，仅使到达平衡所需时间延长，检测范围变窄。试剂酶活性下降对速率法来说有时是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反响丧失。由于以上种种原因，酶试剂法多项选择择平衡法。
从以上分析不难看出，对于平衡法来说关键是确定到达终点所需的时间。对于速.精品.
.
率法来说关键是如何使酶促反响成一级反响。下面以单底物一个工具酶为例说明它们的测定原理：
〔一〕平衡法
将米氏方程改写为：
………………………………………… 2.4
积分得：
假设反响到达平衡，假设 〔一般"终点"的要求〕，[S0]-[St]≈[S0]，那么可简化为：
说明到达终点所需的时间与Km、Vm、 S0有关，Km越小、Vm越大〔参加酶量越多〕、 S0越小〔代测物越少〕那么到达终点所需的时间越短。
假设[S0]?Km，2.4式简化为：
积分得：
假设同时做标准管，不管反响到达何种程度，只要标准管与测定管反响时间〔t〕一致，那么有：
假设两者的反响程度一致，消耗的比例、剩余的比例与起始的比例一致，那么：
………………………………… 2.5
标准管的[S0-St]与待测管的[S0-St]分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示〔As和Au〕。标准管的[So]与测定管的[So]分别表示为Cs和Cu。
………………………………………………… 2.6
公式〔2.6〕平衡法测定代谢物的根本原理，其前提条件是公式〔2.5〕成立。当[S0]-[St]≈[S0]，即反响根本到达平衡，Au和As根本稳定不变，此时测定误差最小。如果测定管与标准管的反响明显存在基质效应，两者反响程度不一，假设按公式〔2.6〕计算就会带来误差。
〔二〕速率法
根据米氏方程：
按一级反响要求：①[S]?Km，[S]+Km≈Km，②酶量很大，在反响过程中，可将V看成不变。 那么：
.精品.
.
假设同时带标准管，那么有：
…………………………………………… 2.7
标准管的[So]与测定管的[So]分别表示为Cs和Cu，速度用△ A/min来表示。上式改写为：
…………………………………………… 2.8
公式〔2.8〕就是速率法测定代谢物浓度的原理，其前提条件是测定初速度。随着反响进展，[S]越来越小，v也越来越小。说明要使反响速度与代测物浓度成正比例，必须做到测定的速度是初速度，越偏离初速度测定，误差那么很大。
三、常用的指示系统
除个别酶试剂法使用色素原做指示系统外，酶试剂法的指示系统主要使用NAD〔P〕H或过氧化物酶〔POD〕系统，前者主要应用于速率法，后者那么常用于平衡法。
〔一〕以复原型辅酶为指示系统
常用的工具酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等，该法的优点是可以用连续监测法，除在酶偶联反响测定酶活性中应用较多外，像葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸、氨、钾、镁等的酶法测定都使用该指示系统。但该法的缺陷有：
1．灵敏度较低 NAD(P)H的摩尔消光系数只有6.22×103。为此，采取一系列措施提高灵敏度。常用的措施有：
〔1〕利用递氢体PMS或偶联黄递酶：将NADH上的氢交给四氮唑盐如NBT等，即提高了灵敏度，又可以在可见光范围内监测，使仪器要求大大降低。
〔2〕参加另一个酶，增加供体氢的数量：如胆汁酸测定中，合并使用3α-羟类固醇脱氢酶〔3α-HSD〕和3-氧-5 β-类固醇- △4-脱氢酶，使测定灵敏度增加1倍。
〔3〕酶循环法：采用酶循环法〔enzymatic cycling methods〕可大大提高测定的灵敏度,如胆汁酸的测定，在体内的浓度只有微摩尔的水平，远远低于其它代谢物的浓度。其原理是：3α-HSD催化胆汁酸和3-酮类固醇之间的反响，正反响对辅酶硫代氧化型辅酶I的亲和力远远大于辅酶I，而逆反响对复原型辅酶I的亲和力大于硫代复原型辅酶I，在反响系统中有足够的硫代氧化型辅酶I和复原型辅酶I，只要有少量的胆汁酸就可生成少量的3-酮类固醇，并在两者之间构成循环，不断产生硫代复原型辅酶I〔黄色〕，控制好条件，反响速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。底物足够多，时间越长产物越多，直到系统中某一反响物耗尽为止。类似的方法还可以测定雌二醇、微量的乙醇等。循环酶技术在试剂生产中还可以不断补充某些不稳定的组分。
.精品.
.
〔4〕荧光法：NAD〔P〕H的激发波长在365nm，发射波长在460nm，用荧光监测器可以使灵敏度增加100-1000倍。但需要特殊仪器，实用性差
2．干扰严重 NADH系统是体内上百种酶的辅酶，假设存在内源性干扰物，势必造成很大的干扰，尤其是样品用量大的方法。因此，在某些测定系统中常常参加高浓度的丙酮酸来抑制乳酸脱氢酶的内源性干扰。
3．仪器要求高 必须具备340nm的紫外监测器。这可通过复原四氮唑盐生成甲臜的方法来解决。
〔二〕以过氧化物酶为指示系统
利用POD为指示系统已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等工程的测定。其共用的指示反响最早由Trinder氏等人提出。其原理是过氧化氢与4-氨基安替比林和酚一起形成红色的醌亚胺类化合物。最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色，这是它的最大优点。后来，提出了很多酚类衍生物，目的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和色泽的稳定性。也有些生色基团的产物是兰色醌类，能很好防止溶血等引起的色素干扰。该法的主要缺点是容易受维生素C、尿酸、胆红素、谷胱甘***等复原性物质的干扰，严重时测定结果会出现假性负值。干扰机制有竞争过氧化氢、破坏色素、延迟生色反响等，目前一般采用双试剂剂型，在试剂1中参加抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾等来消除维生素C、胆红素的干扰。表3-5例举了一些常用的生色基团。
表3-5 常用的Trinder反响生色基团
化学名 英文缩写 最大吸收峰〔nm〕
酚 P 500
2、4-二氯酚 2、4DCP 510
N-乙基-N-〔3-甲苯〕-N-乙酰乙二胺 EMAE 555
N-乙基-N-〔2-羟基-3-丙磺酰〕间甲苯胺 TOOS 555
N-乙基-N-〔3-丙磺酰〕-3、5二甲氧基苯胺 ESPDMA 585
第五节 同工酶检测技术
1952年，Nielands在乳酸脱氢酶区带电泳中发现了两种有活性区带，1959年，Markert等人提议用"isozyme"来描述一组具有一样催化功能而其构造或化学性质不同的酶，国内曾译为"同功酶"和"同工酶"，1964年，国际生化学会统一用"Isoezyme"来表示"isozyme"，由于"Isoezyme"虽催化同一反响，但在不同组织中具有不同的功能，故国内译为"同工酶"较为适宜，并已得到广泛承受。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多***链单体、纯聚体或杂化体，具有一样的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶。凡酶蛋白构造不同的同工酶称为原.精品.
.
级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶的多种形式。不管是原级同工酶还是酶的多种形式，由于它们在组织分布、细胞内定位、发生发育等方面都有可能存在明显差异，与总酶活性相比它具有更高的诊断特异性和诊断敏感度，所以没有必要进展严格分类。但在遗传学领域中以研究原级同工酶为主。某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型〔isoform〕，如CK-MB可分为MB1和MB2两个亚型，有报道提示亚型比同工酶更有价值。
同工酶的测定方法可以分为直接法和间接法两大类。直接法是指利用同工酶之间酶催化动力学性质或免疫原性的不同，不对同工酶各组分预先别离，直接测定某一种同工酶的方法。多采用化学抑制、免疫抑制、热变性等原理。而间接法是依据同工酶之间理化性质〔带电性、分子大小、糖链等〕的不同先用电泳技术、凝胶层析技术、亲和层析技术将各种同工酶组分分开，再利用酶催化性质对同工酶进展定量的方法。两者区别是：直接法只能测定同工酶的某一组分，由于操作方便，适合于自动生化分析仪。而间接法操作复杂，需要特殊装置，不适合自动生化分析仪，但能同时分析同工酶的各个组分。下面简单介绍同工酶分析的常用原理。
一、化学抑制法
市售的LD1测定试剂盒多采用化学抑制法，个别采用免疫抑制法。化学抑制法的原理是一定浓度某些化学试剂如750mmol/L的1，6-己二醇、240mmol/L的硫氰酸胍能有效地抑制LD2-LD5各种同工酶的活性，而LD1几乎不受抑制。
前列腺酸性磷酸酶〔PACP〕也可依据此原理测定。7.5mmol/L酒石酸盐只具有局部抑制PACP的能力，测定参加抑制剂前后酸性磷酸酶的活性差来反映PACP的活性。
二、免疫抑制法
免疫抑制法与化学抑制法相比，优点是抑制特异性高。化学法往往存在待测同工酶同时被抑制或其他同工酶抑制不彻底的缺点。免疫抑制法的缺点是需要制备抗体，测定本钱高。用于心肌梗死的LD1和CK-MB同工酶都有免疫抑制法试剂盒供给。CK-MB同工酶测定的原理是：ＣＫ同工酶分ＣＫ－ＭＭ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＫ－ＢＢ三种。试剂中含有抗CK-M亚基的抗体，与标本中的CK-MM、CK-MB结合，使CK-MM100%的抑制，CK-MB那么有50%被抑制，假设不考虑CK-BB的含量，抑制后的酶活性的2倍就是CK-MB的酶活性。该法的缺点是巨型CK-MM不被抑制。
三、热变性
这是利用各型同工酶对热的稳定性差异的原理来测定同工酶，因特异性较差而较少使用。如碱性磷酸酶同工酶分为四型：肠型、生殖细胞型、胎盘型和非特异组织型。非特异组织型是在酶蛋白合成后，经过不同形式的修饰和加工，形成的肝.精品.
.
型、胆型、肾型、骨骼型等酶的多种形式。各型对热稳定性：胎盘型>小肠型>其他型。假设经６５℃１５分钟的样品预处理后只留下胎盘型同工酶。四、电泳法
由于各型同工酶的一级构造或空间构象不同，形状也不同，因而带电性质不同，在电场中的电泳迁移率不同，可以将各型同工酶分开。然后用酶活性的测定原理，选择适宜的显色系统使区带呈色。电泳法同工酶的显色与一般蛋白质不同，需依赖其催化活性，因此，不能经过固定步骤，呈色产物要求非水溶性。常用的显色系统有：
〔1〕重氮试剂染料：人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反响后产生的萘酚或萘胺与偶氮染料如固蓝Ｂ等生成难溶于水的有色的重氮化合物。如ALP、GGT同工酶的测定。
〔2〕电子传递染料：脱氢酶反响产生NAD〔P〕H，其中Ｈ+经PMS传递Ｈ+，交给四氮唑盐生成不溶性有色的甲臜 化合物。如LDH同工酶的测定。
〔3〕脱氢酶偶联的指示反响：如AST、CK等
电泳法的优点是，选择适宜的电泳条件可以获得同工酶谱的全貌，但其显色系统不可能是所有同工酶的最适条件，而且定量也比拟困难，因此，只是一种半定量的方法。另外，酶与体内的白蛋白、免疫球蛋白等形成"矫作物"、酶的聚合形式等都使结果判定复杂化。电泳法的缺点还有操作烦琐、重复性较差。近年降临床实验室使用自动化电泳系统，有配套的商品试剂盒，有效改善了操作烦琐、重复性较差等缺点。
五、亲和层析法
碱性磷酸酶的肝型、胆型、肾型、骨骼型等各型同工酶糖链的组成或长度不同。因此，可以利用糖链亲和剂凝集素〔如WGA、ConA、PSA、PHA-E等〕与同工酶结合率的不同，对某型同工酶加以别离后进展测定。其中骨型同工酶与WGA有较高的亲和力，结合后形成沉淀，总酶活性减去上清液中未结合局部的酶活性就是骨型同工酶的活性，但是，由于肝型、胆型同工酶也有局部结合特性，因此，测定结果需要校正。
第六节 临床诊断中常用血清酶及其同工酶
一、丙氨酸氨基转移酶的测定
丙氨酸氨基转移酶〔L-Alanine aminotransferse，ALT〕广泛分布于全身各组织，尤其以肝脏中最丰富，绝大多数存在于肝细胞的胞浆中。主要催化丙氨酸和2-氧代戊二酸之间的氨基转移反响。需要磷酸吡哆醛做辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白，无催化活性。
〔一〕方法选择与评价
.精品.
.
测定方法根据测定产物的不同分为：测定谷氨酸和测定丙酮酸。测定谷氨酸以酶电极法作代表，因需特殊仪器目前尚未广泛使用。测定丙酮酸的方法又可以分为三类：①以赖氏法为代表的定时法；②以IFCC推荐法为代表的连续监测法；③偶联丙酮酸氧化酶法。在这三类方法中，IFCC推荐法为参考方法，在目前使用最多。改进赖氏法是根据2、4二硝基苯肼与产物丙酮酸生成丙酮酸-2、4二硝基苯腙在碱性环境下呈红棕色，求出丙酮酸的生成量。因该显色反响特异性差，2-氧代戊二酸干扰大，在试剂配方中2、4二硝基苯肼和2-氧代戊二酸的用量严重缺乏，造成该法的准确度和精细度较差。但因试剂本钱低廉和仪器要求低，在我国基层单位还广泛采用。偶联丙酮酸氧化酶法属于定时法，指示反响是Trinds反响，受到体内一些复原性物质的干扰，在可见光范围内比色，即适合自动化分析又适合手工操作，有望取代改进赖氏法，但因试剂本钱高昂，在基层医院推广还有一定难度。IFCC推荐法克制了以上两类方法的缺点，是目前使用最多的方法。
〔二〕IFCC推荐法测定丙氨酸氨基转移酶
1.原理
2.测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂最终浓度如下〕：Tris100mmol/l；L-丙氨酸500mmol/l；2-氧代戊二酸15mmol/l；5，-磷酸吡哆醛 0.1mmol/l；NADH
0.18mmol/l；LD 1700U/L；样品体积分数0.0833；pH〔37℃〕7.15±0.05
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长339±1nm；带宽≤2nm；孵育时间300S；延滞期90S；测定时间180s；测量点≥6；启动模式 2-氧代戊二酸启动；F值1905；
3.影响因素
〔1〕LD应用兔肌来源的干粉制剂，不能选用硫酸铵悬浮液。可参加白蛋白和叠氮钠来保持其活性。但酶制剂和白蛋白中应没有GLDH和ALT的污染。
〔2〕IFCC推荐法是偶联乳酸脱氢酶，以NADH为指示反响物，2-氧代戊二酸对测定几乎无干扰。因此，2-氧代戊二酸的用量从改进赖氏法的2mmol/L提高到15mmol/L，根本满足了对2-氧代戊二酸的用量的要求，扩大了测定范围，提高了测定准确性。
〔3〕本法的缺陷是存在内源性丙酮酸和GLDH的干扰，采用双试剂底物启动模式可以消除局部干扰，延长延滞期也可以消除局部干扰，但关键还是要求用高纯度的试剂〔不含杂酶〕和无氨蒸馏水。
.精品.
.
〔4〕预孵育的目的是使试剂中磷酸砒哆醛与局部脱辅基的酶先结合。使脱辅基的酶恢复酶活性，对肿瘤化疗病人和肾病病人的样品〔有一局部脱辅基的酶〕来说，与不含有辅酶的试剂相比测得结果可以高得多。
二、 门冬氨酸氨基转移酶及其同工酶的测定
门冬氨酸氨基转移酶〔L-Aspartate aminotransferse，AST〕广泛分布于全身各组织，尤其以心脏、肝脏、骨骼肌、肾脏中最丰富。与丙氨酸氨基转移酶不同，它在细胞内定位于线粒体〔m-AST〕和胞浆〔c-AST〕中。主要催化门冬氨酸和2-氧代戊二酸之间的氨基转移反响。需要磷酸吡哆醛做辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白，无催化活性。
〔一〕方法选择与评价
门冬氨酸氨基转移酶与丙氨酸氨基转移酶的测定方法和方法演变大同小异。除了与丙氨酸氨基转移酶三大类测定方法相近外，早期测定门冬氨酸氨基转移酶还利用偶联酮戊二酸脱羧酶生成CO2后用瓦勃呼吸器测定。
m-AST在判断肝实质细胞的损害程度、急慢性肝病的鉴别等方面有一定价值。它的测定方法很多，有电泳法、免疫沉淀法、层析法、动力学方法等。前两者临床使用较多。
〔二〕IFCC推荐法测定门冬氨酸氨基转移酶
1．原理
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：Tris 80mmol/l；L-门冬氨酸 240mmol/l；2-氧代戊二酸12mmol/l；5，-磷酸砒哆醛 0.1mmol/l；NADH
0.18mmol/l；LD 900U/L；苹果酸脱氢酶MD 600U/L；样品体积分数0.0833；pH〔37℃〕7.65±0.05
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长339±1nm；带宽≤2nm；孵育时间300S；延滞期90S；测定时间180s；测量点≥6；启动模式 2-氧代戊二酸启动；F值1905。
3.影响因素 试剂中参加LD的目的是在预孵育期将内源性的丙酮酸转化为乳酸，防止内源性丙酮酸的干扰。GLDH和氨的干扰及其它影响因素与丙氨酸转移酶相似。
三、 肌酸激酶及其同工酶测定
肌酸激酶〔Creatine Kinase, CK〕催化肌酸和ATP之间高能磷酸键转换生成磷酸肌酸和ADP的可逆反响。在人体三种肌肉组织〔骨骼肌、心肌和平滑肌〕中都.精品.
.
含有大量CK，红细胞中CK含量极少。
CK分子为二聚体，由M和B两个亚基构成，可组成CK-MM，CK-MB，CK-BB三种同功酶。骨骼肌里几乎都是CK-MM；平滑肌中CK-BB含量相对较高，脑中CK-BB含量明显高于其他组织；心肌是唯一含CK-MB较多的器官。
〔一〕方法选择与评价
测定CK的方法大致可分为四大类，即比色法、连续监测法、荧光法和化学发光法。后两类方法因需特殊仪器未能应用于临床常规检测，前两类方法简便易行，是迄今广泛应用的方法。在比色法中，以肌酸比色法应用较为广泛，该法以磷酸肌酸和ADP为基质，酶促产生的肌酸与α-萘酚和双乙酰反响，生成红色化合物用于比色。此法试剂易得，且逆向反响速度通常较正向反响快6倍，其灵敏度能满足一般临床诊断的要求。但CK测定公认的较好方法是IFCC推荐法。该法利用CK催化的逆反响生成的ATP，经偶联己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的反响，使NADP转变为NADPH。通过连续监测NADPH在340nm处吸光度的增加速率，推算出酶活性。
测定和鉴别CK同工酶的方法根本上可分为电泳法、离子交换层析法、免疫抑制法和放射免疫法四大类。电泳法虽然准确度和灵敏度不及其他方法，且别离时间也较长，但由于其操作简单、价格低廉、分辨率高，特别是当出现一些异常同功酶时，如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，从电泳图谱上很容易发现，所以迄今仍为多数实验室所采用。近年来有关CK-MB的测定方法和试剂盒很多，从测定原理来分，可分为酶活性测定与酶质量测定两大类方法。测定酶活性方法以免疫抑制法为代表，此法简单迅速，缺点是特异性差，如患者血清中还存在着CK-BB或者异常CK时，都将出现假阳性。故可作为过筛试验，如有疑问时用电泳法核实。测酶质量方法那么是利用CK-MB的抗原性，应用单克隆技术制备出特异性极高的只和CK-MB作用的抗血清，根据抗原抗体反响测CK-MB酶蛋白浓度。CK-MB质量测定的方法防止了活性检测中可能遇到的干扰，具有较好的灵敏性和准确性，并适合于自动化，优于其他检测CK-MB的方法。中华医学会检验分会专家委员会认为免疫抑制法从测定原理讲存在缺陷，实际工作中可出现CK-MB大于总CK的不合理结果。建议有条件地方以质量法取代免疫抑制法。
〔二〕IFCC推荐法测定肌酸激酶
1．原理
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物各种试剂最终浓度〕：咪唑100 mmol/L；EDTA 2 mmol/；醋酸镁10 mmol/L；NAC 20mmol/L；ADP 2mmol/L；AMP 5 mmol/L；二腺苷五磷.精品.
.
酸 10μmol /L；D-葡萄糖20 mmol/L；NADP 2 mmol/L；HK 4000U/L；G6PD 2800
U/L；pH在37℃时为6.5±0.05；磷酸肌酸30mmol/L； 样品体积分数0.0435。
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长339±1nm；带宽≤2nm；孵育时间180S；延滞期120S；测定时间120s；测量点≥6；启动模式G6PD启动；F值3651；
3.影响因素
〔1〕缓冲液和pH：醋酸咪唑缓冲液是最好的缓冲系统；而双〔2-羟乙基〕亚氨基-3羟甲基甲烷〔Bis-Tris〕缓冲系统中酶的活性最高。pH值随缓冲系统和测定温度不同而有差异。
〔2〕巯基激活物：CK是巯基酶，需双硫键维持酶的分子构造，因此需要巯基试剂活化。常用N-乙酰半胱氨酸；也可使用谷胱甘***和半胱氨酸，但应注意试剂纯度。假设有氧化性谷胱甘***污染，因血清中含有谷胱甘***复原酶，可将酶偶联反响中产生的NADPH重新氧化成NADP+，导致CK活性假性降低；
〔3〕腺苷酸激酶的干扰和消除：虽然红细胞中不含CK，但含有大量AK，目前常用的测定CK的酶偶联法反响体系中含有ADP，因AK能催化ADP直接转化成ATP，
生成的ATP在指示酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下，可使NAD+生成NADH，使CK活性假性增高。10U/L的AK约相当于1U/L的CK。为消除其干扰必须使用AK抑制剂，常用的AK抑制剂以二腺苷-5-磷酸(AP5A )和AMP联用效果最好。如试剂盒中未参加AP5A和AMP，此时溶血标本将产生明显干扰，故采血时应防止溶血并及时别离血清。
〔4〕EDTA的作用：CK与大多数激酶一样，需要Mg2+作激活剂，各法配方中均含有Mg2+。但样品中的Ca2＋ 是Mg2＋的竞争性抑制剂，参加EDTA既可以络合样品中的Ca2＋又能防止N-乙酰半胱氨酸由于二价离子的催化发生的氧化，有利于试剂的稳定。尽管EDTA也能络合Mg2＋，但参加的Mg2＋浓度较高，故不影响其对CK的激活作用。
〔5〕样品保存：CK活性不稳定，血清样品室温4小时、4℃ 8～12小时、冰冻下2～3天维持活性不变，由温度增加引起的灭活是不可逆的，参加巯基试剂不能恢复。样品采集后应尽快别离血清，保存于4℃冰箱。
四、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定
乳酸脱氢酶〔lactate dehydrogenase，LD〕存在于所有体细胞的胞浆中，以肾、心和骨骼肌中含量最为丰富。主要催化乳酸和丙酮酸之间的氧化复原反响。
LD是由M(肌)和H〔心〕亚基组成的四聚体，形成5种构造不同的同功酶，其中H型亚基中酸性氨基酸较多，电泳时负电荷多，因此电泳速率较快。按电泳向阳极泳动快慢，分别命名为LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。.精品.
.
这5种同功酶按组织中的分布大致可分为三类：一类以LD1为主，主要在心肌，可占总LD1活性50%以上，也存在于红细胞内；另一类以LD5为主，主要存在于横纹肌和肝脏；第三类以LD3为主，存在于脾、肺。
〔一〕方法选择与评价
测定LD的方法根据酶促反响方向不同，分为两大类：一类方法是利用正向反响〔L→P〕，以乳酸为底物，测定反响中NAD＋的复原速率。该法的优点是：底物乳酸和NAD＋比逆向反响所用的丙酮酸和NADH稳定；NAD＋较NADH含抑制LD 的杂质少；乳酸对LD的抑制作用小于丙酮酸；线性范围较宽，重复性好于逆向反响。缺点是：需要的底物浓度较高，反响速度较慢。另一类方法是利用逆向反响〔P→L〕，以丙酮酸为底物，测定反响中NADH的氧化速率。该法的优点是：NADH用量少，试剂本钱低；反响速率快，灵敏度高。缺点是：丙酮酸和NADH的稳定性差；过量丙酮酸对LD的抑制作用大。上述两大类方法又根据其最终检测手段的不同而分为连续监测法、比色法和荧光法等。连续监测法以正向反响〔L→P 〕应用较为广泛，是IFCC和我国检验学会的推荐方法。比色法可通过用2，4二硝基苯肼显色〔金氏法〕测定丙酮酸生成量或以吩嗪甲酯硫酸盐或心肌黄酶为电子传递体，使四唑蓝复原成蓝色染料后比色测定NADH生成量，在基层单位还有使用。荧光法灵敏度高，但限于仪器，难以在临床常规中应用。
测定LD同功酶的方法主要有三种：电泳法、免疫沉淀法〔immunoprecipitation
assay〕和化学抑制法。电泳法操作简单、价格低廉，可以知道五种同工酶的全貌，但测定费时。免疫沉淀法是分别将抗M亚基〔或抗H亚基〕的抗血清，参加待测血清中，抗原抗体形成复合物后在一定条件下可变为不溶性沉淀，离心去除沉淀后测定上清液中酶的活性，可反映LD1 〔或LD5〕的活性；有商品试剂盒出售。化学抑制剂法是利用1，6-己二醇具有抑制LDH分子中M亚基的特性，当终浓度为0.75mol/L时，血清中LD２～LD5活性被完全抑制，可直接测定LD１活性。
〔二〕IFCC推荐法测定乳酸脱氢酶
1．原理
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：N-甲基-D-葡糖胺325mmol/l；L-乳酸50mmol/l；NAD＋ 10mmol/l〔含游离酸3.15 mmol/l，锂盐6.85 mmol/l〕；pH在37℃时为6.5±0.05；样品体积分数0.0435。
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长339±1nm；带宽≤2nm；孵育时间180S；延滞期90S；测定时间180s；测量点≥6；启动模式.精品.
.
NAD+启动；F值3651；
3.影响因素
〔1〕缓冲液：选择缓冲液必须首先考虑缓冲剂的pKa值与最适pH及NAD+稳定性之间的匹配，另外还要兼顾激活或抑制效应以及LD1和LD5最适pH等。30℃时，反响的最适pH为8.9，而Tris的pKa值为8.1与最适pH接近，因而是最常用的缓冲剂。37℃时最适pH为9.4，使用Tris缓冲液显然不适宜，而改用N-甲基-D-葡糖胺做缓冲液
〔2〕乳酸与NAD+的选择：在各类乳酸盐中，乳酸锂因纯度高、稳定性好而首选。关于NAD+应选择游离酸型与锂盐的混合型。理由是：单独使用游离酸型，会使最终反响pH下降，而NAD+ 本身在340nm的光吸收依赖于pH，导致空白吸光度呈非线性变化。但假设选择混合型可以大大降低空白吸光度呈非线性变化的程度。由于NAD+的用量较大，应特别注意杂质对LD的抑制作用，要求在使用前进展纯化。
〔3〕样品：样品以血清为宜。当用血浆为样品时，宜采用肝素作抗凝剂，草酸盐对LD有抑制作用。红细胞中LD活性比血清约高100倍，故样品应严格防止溶血。样品采集后，最好在0.5小时内别离血清，1和3小时别离的血清LDH活性较0.5小时别离者分别高20%和30%。LD4和LD5对冷不稳定，故样品不宜冰箱存放。
五、碱性磷酸酶及其同工酶的测定
碱性磷酸酶〔Alkaline phosphatase，ALP〕是一组底物特异性较低，在碱性条件下能水解磷酸单酯化合物的酶。广泛分布于机体各器官组织，在肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等组织含量较高。成人血清中的ALP主要来源于肝脏，小局部来源于骨骼。
碱性磷酸酶同工酶分为四型：肠型〔IAP〕、生殖细胞型〔GCAP〕、胎盘型〔PALP〕和非特异组织型〔TUAP〕。非特异组织型是在酶蛋白合成后，经过不同形式的修饰和加工，形成的肝型、胆型、肾型、骨骼型等酶的多种形式。临床价值较大的同工酶及酶多种形式有骨骼型、Regan和高分子型等。
〔一〕方法选择与评价
碱性磷酸酶是一组底物特异性较低的酶，因底物不同，测定方法很多。具有代表性的方法有：①以布氏〔Bodansky〕法为代表：β-甘油磷酸钠做底物经ALP作用后产生磷酸根，通过定量磷来测定。②以金-阿〔King-Armstrong〕法为代表：磷酸苯二钠做底物经ALP作用后产生酚，通过定量酚来测定。③以皮-劳〔Bessey-Lowery-Brock〕法为代表：人工合成底物磷酸对硝基酚二钠盐〔PNPP〕做底物，经ALP作用后产生对硝基酚，在碱性条件下呈黄色而可以连续监测。前.精品.
.
两类方法因操作烦琐，不能连续监测，试剂稳定性差，受产物抑制明显等缺点，已很少使用。后一种方法根据缓冲液不同又分为多种方法。其中以磷酸酰基的受体-2-甲基-2-氨基-1-丙醇〔AMP〕做缓冲液，是IFCC和我国检验学会的推荐方法。
碱性磷酸酶同工酶的测定方法有电泳法、层析法和动力学方法等，其中以聚丙烯酰胺凝胶电泳和植物凝集素层析法使用较多。
〔二〕中华医学会推荐法测定碱性磷酸酶
1．原理
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：EAE 1.00mmol/l；PNPP
15mmol/l；MgCl2 0.5mmol/l；pH〔30℃〕9.9±0.05；样品体积分数0.0196
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长401±1nm；带宽≤2nm；延滞期30S；测定时间60s；测量点≥4； F值2757；
3.影响因素
〔1〕PNPP的纯度对测定结果影响很大。合格的PNPP所含杂质应尽量低，要求：游离4-NP小于0.03%，无机磷小于1%。
〔2〕各类分析仪的波长设置有可能不同，401nm、405nm、410nm等都可使用。但是假设测定波长不是401nm，那么4-NP的摩尔消光系数不同，F值应随之改变。
〔3〕用于ALP测定的缓冲液分为三类：①惰性型：如碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液；②抑制型：如甘氨酸缓冲液；③活性型：如AMP、Tris和2-乙基氨基乙醇〔EAE〕缓冲液。根据酶活性测定最适条件的要求，尽量选择活性缓冲液，AMP缓冲液虽然活性不如EAE缓冲液，但因具有杂质含量少，温度依数性小等优点而被IFCC推荐。我国检验学会的推荐方法采用EAE，理由是EAE在pH9.9〔30℃〕条件下，ALP各型同工酶相对催化反响性较一致，即肝型100％，骨型90％，胎盘型89％，肠型99％。相反，用别的活化型缓冲剂，小肠型ALP相对活性往往在50％以下，不利于测定此型同工酶占优势的肝脏病人血清。考虑到我国ALP标本大多来自肝脏，故建议用EAE作缓冲剂的方法。假设用不同缓冲液测定ALP时，其参考值不同。
〔4〕 底物有一定自身水解作用：酶活性计算时应扣除试剂空白变化速率，试剂空白增加说明底物有自身水解作用，为保证足够的底物浓度需设置试剂空白吸光度限额。
六、γ-谷氨酰基转移酶及其同工酶的测定
γ-谷氨酰基转移酶〔L-γ-glutamyltransferase，GGT〕也称γ-谷氨酰转***.精品.
.
酶，是催化γ-谷氨酰基转移反响的一种酶，主要参与体内谷胱甘***的代谢。主要分布在肾、胰、肝、肠和前列腺中，血清中的GGT主要来源于肝胆，以多种形式存在，在红细胞中含量甚低。
GGT具有多种含量不同的唾液酸、带电性质不同的分子形式，目前主要用电泳法来测定。但使用不同的支持物进展电泳别离出来的同工酶区带数量和位置可以不同。
〔一〕 方法选择与评价
GGT不同测定方法之间的区别主要是底物的不同,可分为三类：①L-γ-谷氨酰-α〔β〕-萘胺做底物，催化生成的α〔β〕-萘胺与重氮试剂生成红色化合物。该法简便，试剂易得，采用定时法，适合一般分光光度计应用。但反响时间长，灵敏度低，底物溶解度差。②γ-L-谷氨酰对硝基苯胺〔GNA〕做底物，催化生成的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。但底物溶解度差，达不到最适条件对底物浓度的要求，曾经作为AACC和SSCC的推荐法。③3-羧基-γ-L-谷氨酰对硝基苯胺〔GCNA〕做底物，催化生成的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色，可以连续监测。GCNA与GNA相比，含有亲水基团羰基，溶解度增加，而且底物稳定性好，自身水解作用小，是IFCC的推荐方法。
血清GGT同工酶的测定方法主要有：用磷钨酸-氯化镁沉淀法测定LDL-VLDL-GGT和用电泳法测定肝癌标志物GGT-II等。
〔二〕IFCC推荐法测定γ-谷氨酰基转移酶
1．原理
连续监测2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm处的吸光度变化速率。
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：甘氨酰甘氨酸150mmol/l；GCNA 6.0mmol/l；样品体积分数0.0909；pH〔37℃〕7.70±0.05
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长410±1nm；带宽≤2nm；孵育时间180S；延滞期60S；测定时间180s；测量点≥6；启动模式：GCNA启动；F值1382。
3.影响因素
〔1〕反响温度37℃时的最适pH为7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系。
〔2〕5-氨基-2-硝基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为7.96 ×103〔pH为7.70〕，受pH和温度影响较大。假设选择401nm或405nm时需注意校正。
〔3〕GCNA的纯度要求较高，含对硝基苯胺应小于0.5%，含5-氨基-2-硝基苯甲.精品.
.
酸应小于0.1%，否那么需先纯化。对甘氨酰甘氨酸的纯度也要求含甘氨酸小于0.1%，因后者对酶活性有抑制作用。
〔4〕由于样品用量大，样品体积分数0.0909，为了样品和反响液在37℃平衡，故需要孵育时间180S和底物启动模式。
〔5〕底物有一定自身水解作用，酶活性计算时应扣除试剂空白变化速率。试剂空白增加说明底物有自身水解作用，为保证足够的底物浓度需设置试剂空白吸光度限额。
七、淀粉酶酶及其同工酶的测定
α-淀粉酶〔α-Amylase，AMY或AMS〕即1，4-α-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶，作用于α-1，4糖苷键，是一种钙依赖性金属蛋白酶，卤素和其他阴离子有激活作用。主要存在于胰腺和唾液腺中。AMY有两种同工酶，即唾液型〔S-AMY〕和胰腺型〔P-AMY〕，又可以分为多种亚型，S1、S2、S3、S4、和P1、P2、P3，淀粉酶分子量小，可以从肾小球滤过出现在尿液中。有时淀粉酶与抗淀粉酶自身抗体形成高分子复合物，称为巨型淀粉酶。
〔一〕方法选择和评价
迄今为止，淀粉酶的测定方法有200多种，根据底物不同分为两类。一类是以天然淀粉为底物的测定方法：可利用淀粉水解前后粘度或浊度的改变来测定；也可以利用测定产物葡萄糖的各类方法；还可以利用淀粉与某些活性染料呈色的原理来测定；但最具代表性的方法是依据碘遇淀粉呈兰色的原理设计的样品稀释法、时间滴定法、碘淀粉比色法等，碘淀粉比色法曾一度作为临床最常用的方法。以天然淀粉为底物的方法共同缺点是，天然淀粉的分子构造和葡萄糖组成不确定而难以标准化，测定的准确性和重复性都较差。另一类底物是人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法，与天然底物相比，最突出的优点是底物的构造和分子量确定。常用的人工合成底物有麦芽寡糖〔三糖、四糖、五糖、七糖等〕用对硝基酚或邻氯对硝基苯酚修饰，又有不需偶联酶或偶联α-葡萄糖苷酶和偶联多功能α-葡萄糖苷酶之分。为了提高底物的稳定性，对底物连接一些保护基团如亚乙基、苄基、亚丁基和半乳糖等。这里主要介绍目前最常用的方法是以4，6-亚乙基-4-硝基酚-α-D-麦芽七糖苷(E-G7 -PNP)做底物，辅助酶是多功能α-葡萄糖苷酶，简称EPS法。
〔二〕EPS法测定淀粉酶
1．原理
2.测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：HEPES 50mmol/l；EPS
2.0mmol/l；NaCl 50mmol/L；MgCl2 10mmoL/L; 多功能α-葡萄糖苷酶 10KU/L;.精品.
.
样品体积分数0.0196；pH在37℃时为7.10±0.05
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长405±1nm；带宽≤2nm；孵育时间180S；延滞期60S；测定时间180s；测量点≥6；启动模式：EPS启动；F值4811；
3.影响因素
〔1〕 HEPES缓冲系统随着pH升高PNP的摩尔消光系数会加大，同时在不同的蛋白质体系中摩尔消光系数也有变化.
〔2〕α-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，假设将PNP-G7的非复原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，就可以阻止α-葡萄糖苷酶对底物的水解作用，提高底物的稳定性，封闭试剂的稳定性是未封闭的5-9倍。
〔3〕多功能α-葡萄糖苷酶对EPS的所有降解产物〔PNP-G1-PNP-G5〕都有一样的转换率，从而使底物中的所有PNP被回收，可以直接用PNP的摩尔吸光系数计算酶活性。
〔4〕IFCC酶学小组认为，在α-淀粉酶检测中麦芽五糖苷是最理想的底物，因为人的α-淀粉酶的活性中心是五个葡萄糖结合的位点; EPS法需要辅助酶，与理想的参考方法还有差距。用2-氯-4-硝基苯酚-α-麦芽三糖(CNP-G3)做底物，由于淀粉酶对CNP-G3的水解速度是G3的10倍，因而不需要用辅助酶，直接由淀粉水解产生CNP，在405nm监测CNP。从酶学理论上说这是一种最理想、最准确的酶测定方法，但易受内源性α-葡萄糖苷酶的干扰。
八、 胆碱酯酶及其同工酶的测定
胆碱酯酶〔Pseudocholinesterase，PChE〕是一类催化酰基胆碱水解的酶类，又称酰基胆碱水解酶。按照分布不同和理化性质不同可分为两类，它们之间的区别见表3-6。假性胆碱酯酶也即血清胆碱酯酶，由肝脏合成，测定其血清中的酶活性能反映肝脏合成功能；有机磷中毒时酶活性也被抑制，可作为有机磷中毒的辅助诊断指标。全血中乙酰胆碱酯酶〔Acetylcholine acetylhydrolase，AChE〕的测定主要反映真性胆碱酯酶的活性，是有机磷中毒的诊断指标。羊水中乙酰胆碱酯酶的测定可以用于神经管缺陷的产前诊断。
表3-6 AchE与PchE的比拟
名称 乙酰胆碱酯酶 AChE 〔拟〕胆碱酯酶 PChE
别名 真性胆碱酯酶、特异性胆碱酯酶、 假性胆碱酯酶、非特异性胆碱酯酶
底物水解速度 乙酰>丙酰>丁酰胆碱 丁酰>丙酰>乙酰胆碱
分布 神经组织、红细胞等 肝脏、血浆等
苯甲酰胆碱 不能催化 能催化
.精品.
.
硫酸奎尼丁 不受抑制 严重抑制
毒扁豆碱 严重抑制 严重抑制
〔一〕方法选择与评价
真性胆碱酯酶的测定根本上是以乙酰胆碱酯做底物，常用的底物有氯化乙酰胆碱、碘化乙酰胆碱，通过酶促反响生成乙酸，造成pH下降，可以有以下几种方法测定：①pH差示法：即血气分析仪的pH通道〔恒温、pH精度高〕直接测定酶促反响前后的pH变化量，在一定范围内与胆碱酯酶的活性成正比。该法的优点是方便快速，可以用全血标本，但要求试剂的缓冲容量要适宜，即能稳定标本pH的影响，又能灵敏地反响酶促反响产生乙酸造成的pH变化。②pH指示剂法：使用邻甲酚酞络合酮〔OCPC〕等高灵敏的酸碱指示剂，可以用终点法和连续监测法测定，但必须做样品空白。③羟胺比色法：以乙酰胆碱酯做底物，利用乙酰胆碱与碱性羟胺生成乙酰羟胺，后者在酸性溶液中与高铁离子形成棕色复合物，测定酶促反响的底物消耗量来求出胆碱酯酶的活性。该法操作复杂，试剂稳定性差，已很少使用。④以碘化乙酰硫代胆碱做底物，酶促反响生成硫代胆碱与5-巯代-2-硝基苯甲酸〔DTNB〕生成黄色产物5-硫代硝基苯甲酸〔5-TNBA〕，可以连续监测吸光度的变化。假设使用酶抑制剂毒扁豆碱后也可用终点法测定。这类方法是目前最常用的方法。尤其是连续监测法。⑤硫代胆碱还可以使黄色的高铁氰化钾复原为无色，连续监测405nm的吸光度下降速度可以计算出胆碱酯酶的活性。本法是德国临床化学联合会的推荐方法。
假性胆碱酯酶的测定方法与真性胆碱酯酶的测定方法大同小异，主要区别是以丁酰胆碱酯或丙酰胆碱酯做底物，最常用的方法是碘化丁酰硫代胆碱做底物的连续监测法。另外，也可以用硫酸奎尼丁做酶促反响终止剂，进展比色测定。
〔二〕丁酰硫代胆碱法测定假性胆碱酯酶
1．原理
2．测定方法
〔1〕试剂组成〔反响混合物中各种试剂的最终浓度〕：磷酸盐缓冲液 50mmol/l；DTNB 0.25mmol/l；丁酰硫代胆碱 6.0mmol/L；样品体积分数0.001；pH在37℃时为7.60±0.05
〔2〕测定条件：温度37℃±0.1℃；光径10.00±0.01mm；波长410±1nm；带宽≤2nm；孵育时间180S；延滞期30S；测定时间120s；启动模式：丁酰硫代胆碱启动；F值7426。
3.影响因素
〔1〕由于该法灵敏度高，样品中酶活性浓度高，假设反响速率超过酶反响线性范围需将样品稀释后测定。在稀释可疑氨基甲酸酯类农药中毒的样品时尤其要引.精品.
.
起注意，因为氨基甲酸酯抑制胆碱酯酶时，酶的活化会因为稀释而加快，造成结果假性偏高。另外，在胆碱酯酶测定时应尽量快速。
〔2〕硫代乙酰胆碱的纯度应>99.5%,其中硫代胆碱的含量应<0.5%。底物也有自身水解作用，测定时应扣除试剂空白变化速率。
〔3〕从酶动力学进程分析，采用双试剂，试剂1中的DTNB先与血清孵育可以消除干扰物，再用底物启动酶促反响可以得到较好的线性期。
。
.精品.
