2023年12月19日发(作者：)
高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座 专题九 DNA技术与人类基
高中生物奥林匹克竞赛辅导专题讲座-专题九-dna技术与人类基
高中生物奥运指导专题讲座第9讲DNA技术与人类基因组
【竞赛要求】
操作工具2。质粒是基因3的载体。核酸内切酶和连接酶4。基因克隆5。逆转录6。DNA探针7。PCR技术8。人类基因组
9．dna技术的应用
技术带来的危害和伦理问题
【知识梳理】
一、 基因工程概述
基因工程：是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--dna大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的dna分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中安家落户，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
这一定义表明，基因工程具有以下重要特征：第一，外源核酸分子在不同的宿主生物体内繁殖，可以跨越自然物种屏障，将任何生物体的基因植入新生物体，而这种生物体可以与原始生物体无关。这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，某个小DNA片段在新的宿主细胞中被扩增，因此少量DNA样本复制产生大量DNA，以及大量绝对纯DNA分子群，不会污染任何其他DNA序列。
二、细胞是dna操作必不可少的工具（一）质粒是基因的载体
基因载体或克隆载体。这是为了“携带”感兴趣的外源DNA，并实现外源DNA的无性繁殖
殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些dna分子。其中，为使插入的外源dna序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的dna分子有质粒dna、噬菌体dna和病毒dna。
细菌质粒是一种独立于细菌假核DNA分子的自我复制的环状双链DNA分子。它是基因工程中最常用的载体。最常用的质粒是大肠杆菌质粒。大肠杆菌的质粒通常含有耐药性基
因，如抗四环素标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌假核DNA的1%左右。质粒可以以“友好”的方式在宿主细胞中“借用”。一般来说，质粒的存在对宿主细胞的存活没有决定性影响。然而，质粒复制只能在宿主细胞中完成。根癌农杆菌的质粒通常用于培育转基因植物
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因为植物。（2） 工具酶
1．限制性内切酶：识别特异序列，切割dna
连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键，形成DNA切口
封合，连接dna片段3．dna聚合酶ⅰ：
（1） 双链cDNA第二链的合成（2）作为探针的缺口翻译（3）DNA序列分析（4）填充3'端
4．taq酶:催化pcr反应，聚合dna
5.逆转录酶：的合成。b、 替换DNA聚合酶I用于填充、标记或DNA序列分析6。多核苷酸激酶：催化DNA 5′羟基末端的磷酸化，或标记探针7。碱性磷酸酶：去除DNA的5′端磷酸基
8．末端转移酶:在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾9．dna酶:切割dna10．rna酶:切割rna
在所有的工具酶中，限制性内切酶具有特殊的意义。所谓限制性内切酶是一种识别特定DNA序列并在识别点或周围切割双链DNA的内切酶。根据酶的组成、需要的因素和切割DNA的不同方式，限制性内切酶可分为三类。重组DNA技术中常用的限制性内切酶是II类酶。大多数识别DNA位点的II类酶的核苷酸序列是二元旋转对称的。这种特殊的结构顺序通常被称为回文结构。以下是限制性内切酶的概述
ⅰ类需mg2+、sam及atpⅱ类仅需mg2+ⅲ类需mg2+及atp识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。识别切割特异性强，切割发生在识别位点。切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。（三）基因克隆
1.概念：DNA克隆是利用酶法将来自不同来源的遗传物质与载体DNA在体外结合
成一具有自我复制能力的dna分子――复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一dna分子，即dna克隆又称重组dna。2．重组dna的基本原理
完整的DNA克隆过程应包括：① 获取目标基因，② 基因载体的选择和构建，③ 目标基因和载体的剪接，④ 将重组DNA分子导入受体细胞，以及⑤ 含有重组分子的受体细胞（转化子）的筛选和无性繁殖。（1） 目标基因的获取
目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。
a、 化学合成法：如果已知基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出编码多肽的基因的核苷酸序列，然后利用DNA合成器通过化学合成原理合成目标基因。b、
基因组DNA：通过物理方法（剪切或超声波）或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，然后与适当的克隆载体结合，将重组DNA转移到受体细菌中进行扩增。每种细菌携带一个重组DNA分子的多个拷贝。所有细菌携带的各种染色体DNA片段涵盖了基因组的所有信息，即基因库。在建立基因文库后，通过适当的筛选方法从多个转化株中筛选出含有一个基因的菌株，并对目标基因进行扩增和分离。
c．cdna：以mrna为模板，利用反转录酶合成与mrna互补的dna，再复制成双
二
链cdna片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cdna文库。用适当方法cdna文库中就可以筛选分离到目的基因。
d、 聚合酶链反应：在模板DNA、引物和dNTP的存在下，将热稳定的Taq DNA聚合酶引入DNA合成系统。反应体系被自动修改、退火和放大。重复相关DNA片段的酶促合成，使目标基因呈指数增长。（2） 克隆载体的选择与重建
a.质粒：存在于细菌染色体外，小型闭合环状双链dna分子，可独立自主进行复制，含筛选标记，含多种限制性内切酶的单一切割位点，可插入目的基因。b.噬菌体：egλ噬菌体、mb载体
c、 Cox质粒和酵母人工染色体载体：用于插入大的DNA片段。d、 病毒载体。
（3）外源基因与载体的连接
体外DNA重组。这种DNA重组通过DNA酶在外源DNA和载体之间进行共价连接。a、
粘性端部连接
ⅰ.同一限制酶切割位点连接由同一限制性核酸内切酶切割的不同dna片段具有完全相同的末端。那么，当这样的两个dna片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在dna连接酶催化作用下形成共价结合的重组dna分子。
ⅱ. 两种内切酶的切割限制位点不同，两种内切酶的切割限制位点相同。b、 平端连接
c．同聚物加尾连接
均聚物连接是通过均聚物序列的退火来完成的，例如聚A和聚t。在末端转移酶的作用下，DNA片段中产生粘性末端，然后连接。d、 手动接头连接
（4）重组dna导入受体细胞
根据用于重组DNA的载体的不同性质，有不同的方法引入重组DNA分子，如转化、转染和感染。
a.感受态细胞。经一定方法处理(如cacl2处理)后具备接受外界dna能力的大肠杆菌。受体菌应为安全无毒菌株，且为限制酶缺陷型及重组缺陷型。
b、 转化、转染和感染。这个定义不涉及真核细胞，只涉及大肠杆菌。转化：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入受体细胞。
转染：以噬菌体为载体，用dna连接酶使噬菌体dna环化，再通过质粒转化方式导入受体菌。
感染：以噬菌体为载体，将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒，感染受体细菌。（5）
重组A.直接选择法的筛选
直接法是针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法，其特点是直接测定基因表型。
ⅰ. 耐药性标记选择：如果克隆载体携带耐药性标记基因，则只有含有耐药性基因的转化菌才能存活并在含有抗生素的培养板上形成菌落。
ⅱ.标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救筛选。ⅲ.分子杂交法b．免疫学方法
通过特异性抗体与靶基因表达产物的相互作用进行筛选属于间接选择方法。具有很强的特异性和灵活性
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它具有很高的灵敏度，适用于选择不为宿主细菌提供任何标记的基因。（6） 克隆基因的表达A.原核表达系统
大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mrna的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。
大肠杆菌表达系统仍存在一些缺陷：① 由于缺乏转录后处理机制，只能表达克隆的cDNA，不能表达真核基因组DNA；② 由于缺乏适当的翻译后处理机制，表达的真核蛋白不
能形成适当的折叠或糖基化修饰；③ 表达的蛋白质通常形成不溶性包涵体，需要复杂的复性使其具有活性；④ 大量可溶性蛋白质难以表达。b、 真核表达系统
与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cdna，而且还可表达真核基因组dna；将表达载体导入真核细胞的过程称转染，常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、deae葡聚糖介导转染、电穿孔法、脂质体转染及显微注射。
三、 DNA操纵技术的其他工具（I）反转录
1970年temin等在致癌rna病毒中发现了一种特殊的dna聚合酶，该酶以rna为核板，根据碱基配对原则，按照rna的核苷酸顺序(其中v与a配对)合成dna。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的dna聚合酶叫做反转录酶。后来发现反转录酶不仅普遍存在于rna病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。
携带逆转录酶的病毒也称为逆转录病毒。入侵宿主细胞后，首先以病毒RNA为模板，在逆转录酶的催化下合成DNA，然后DNA被环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中，在宿主细胞中以前病毒的形式代代相传。后来，人们发现许多逆转录病毒基因组含有癌基因。如果癌基因由于某些因素被激活，宿主细胞可以转化为癌细胞。大多数逆转录酶具有多种酶活性，主要包括以下活性：
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① DNA聚合酶活性；RNA被用作模板，催化dNTP聚合成DNA。这种酶需要RNA作为酶
引物，多为色氨酸的trna，在引物trna3′－末端以5′→3′方向合成dna。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的dna出错率比较高。
② RNaseH活性；逆转录酶合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子由RNA组成
seh从rna5′端水解掉rna分子。
③ DNA定向DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，dNTP为模板
底物，再合成第二条dna分子。除此之外，有些反转录酶还有dna内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体dna中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mrna并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的dna(cdna)，由此可构建出cdna文库(cdnalibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。（二）dna探针
DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性和复性以及碱基互补配对的高精度来检测特定DNA序列的新技术。DNA探针是用同位素和生物素标记的特定DNA片段，可以与寄生虫基因组DNA一样大，也可以小到20个碱基。当DNA探针和待测的未标记单链DNA（或RNA）根据碱基序列互补组合时，两条单链与氢连接，形成标记DNA（或标记DNA RNA）的双链杂交分子。未配对的结合核苷酸溶解后，通过检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。由于DNA分子碱基互补的准确性，单链DNA探针仅与样品中变性的DNA单链配对，这决定了探针的特异性；使用放射性同位素（如32P）或生物素标记的探针，可以同时使杂交试验高度敏感。相关内容：
所谓杂交指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体，杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
DNA探针是最常用的核酸探针，是指长度超过数百个碱基对的双链DNA或单链DNA探针。DNA探针有很多种，包括细菌、病毒、原生动物、真菌、动物和人类细胞。大多数探针都是基因序列或非编码序列的全部或部分。这些DNA片段必须具有特异性，如细菌毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术在细菌分类和菌株鉴定方面比G+C比例更准确。这是细菌分类学的一个发展方向。结合分子杂交技术的高灵敏度，分子杂交在性病临床病原体诊断中具有广阔的前景。
dna探针（包括cdna探针）有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。其次，dna探针不易降解（相对rna而言），一般能有效抑制dna酶活性。第三，dna探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、pcr标记法等，能用于同位素和非同位素标记。
（三） PCR技术
类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
① 模板DNA变性：模板DNA加热到93℃左右一定时间后，模板DNA的双链或PCR扩增形成的双链DNA解离形成单链，与引物结合，为下一轮反应做准备。② 模板DNA和引物的退火（复性）：将模板DNA加热并变性成单链后，温度降至约55℃，
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