二代基因测序
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2023年3月19日发(作者：鸡脯肉的做法大全)1/11
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识
近年二代基因测序（next-generationsequencing，
NGS）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾
病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原
分析及非侵袭性产前筛查等。国内外有关学会已出台相关
共识与指南以推动其在临床中的应用。中华医学会病理学
分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临
床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS的操作流
程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范
NGS在分子病理领域的应用。
临床分子病理实验室NGS样本可采用甲醛固定石蜡包埋组
织（formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE）、新鲜组
织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和
血浆/血液标本等。本共识特色是基于病理评估的组织样本
（FFPE、新鲜）的规范。测序分析范围基于目前临床需
求，本共识着重在于目标区域测序（panel）分析的实践。
随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足
临床需求。
一、实验室总体要求
NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断
实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检
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验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指
南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学
检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应
用技术指南（试行）》进行。
检测人员的资质要求：NGS检测技术人员应具备临
床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过
NGS技术的理论与技能培训合格。数据分析人员应具有临
床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培
训。最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培
训合格的本单位执业医师或者授权签字人（医学博士学位
或高级职称）审核。
检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应
当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本
制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩
增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控
区、测序区、数据存贮区。各工作区空气及人员流向需要
严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导
则》。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库
时，血液样本应与组织样本分开。
检测试剂及项目要求：试剂和测序平台均应选择中国
食品药品监督管理总局（CFDA）认可产品。涉及到实验室
自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（SOP），
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需经过临床实验室自建项目（LDT）验证合格才可使用。每
个NGS检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和
分析工具以及不同的突变类型包括，单碱基突变single
nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失
（Indels）、基因拷贝数变异Copynumbervariations
（CNVs）、染色体结构变异，structuralvariation（SVs）以
及不同的样本类型（如FFPE组织、新鲜组织、全血、胸水
等）对特定panel的准确性、精确性、敏感性、特异性等性
能参数进行LDT验证。应该有经过标准品测试的在不同的
mutantallelefrequencies（MAF）下，不同测序深度的灵敏
度及特异性数据，确定不同样本的可信的测序深度。经验
证后，SOP发生的任何改动，包括试剂、仪器、基因项目
等都需要重新做验证。验证实验结果签名留底备案。
检测实验室的质量管理要求：NGS检测主要包括实
验操作和生物信息学分析两部分。实验操作部分包括样本
准备、文库制备、编码（barcoding）、目标区域富集、测
序等；生物信息学分析部分包括定位（mapping）、比对、
变异识别、变异注释、变异解读及报告等。上述流程均需
要建立实验室质量管理体系文件和SOP及机器运行和维护
SOP，具有严格的室内质控措施；定期参加室间质评以有及
持续的质量保证和改进计划。
二、NGS分析样本、基因panel和转运要求
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NGS分析样本类型可采用FFPE样本、新鲜组织、各种体液
上清液、体液离心细胞块石蜡包埋标本和血浆/血液标本
等。
对于肿瘤体细胞变异初次NGS检测应首选经病理评估的组
织样本，在此数据基础上的再次检测可选取液体样本动态
监测。
NGS检测前需通过病理诊断明确其肿瘤的性质及含量，根
据不同肿瘤类型选择合适的基因panel测序。
不同疾病的基因panel列表，必须由临床与检测机构的专家
共同决定，已达到不同实验室之间的可比性和完善性。
未经病理评估的基因检测结果不可单独用于分子病理临床
诊断目的。
样本质量对检测结果和分析至关重要，病理医师需要对可
评估的样本进一步明确病理诊断，并评价标本有无出血、
坏死和不利于核酸检测的前处理（例如含HCl脱钙液处
理），病变细胞（如肿瘤细胞）的总量和比例，避免假阴
性。组织标本中肿瘤细胞含量建议达到20%以上，低于此标
准可富集后检测。
NGS检测实验室应对不同类型的样本有采集及处理SOP指
导。对于不同的样本（FFPE、体液、血液等）实验室应有
不同的样本运送SOP，物流环节（含冷链运输）应有相关
运送记录，确保样本运送安全、无污染、无降解。
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三、NGS检测流程中的质量标准
1.核酸提取及其质量分析：提取的核酸质量是NGS检测成
功的关键因素，在制备文库前应采用多种方法对核酸质量
评估，包括纯度、浓度和完整性分析。需要根据不同的样
本类型制定相应的SOP用以鉴定核酸的纯度、浓度、完整
性或降解程度等。并对应明确接受和拒绝的标准。
2.文库制备及其质量分析：文库制备方法主要有杂交捕获和
扩增子建库，无论采用何种方法制备文库和平台检测，都
应对检测基因、区域或突变热点进行描述，并建立实验室
检测SOP。建立好文库后上机测序前需对文库进行质量分
析。每个检测项目应设定其文库质量的要求，明确接受或
拒绝的标准。
测序仪上机分析及其质量分析：NGS建库主要有扩
增法和捕获法两大策略，测序时根据检测样本量和质量要
求确定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。录
入样本编号、检测内容、设定参数等信息，按仪器操作流
程进行测序。产生的测序数据质量参数要求详见后文。
检测中的样本追踪及对照设置：（1）样本追踪：为
确保检测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个SNV位
点或其他标签作为样本身份标识（sampleID），在检测前
对每个样本进行SNV位点信息的测定，在NGS检测后对上
述位点进行追踪，证明没有交叉污染。（2）阳性对照：应
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用组合型质控材料，可采用已知突变信息的混合样本，以
模拟样本的复杂性。实验时同时检测，以确保其检出能
力。（3）阴性对照：用无核酸或明确无突变的样本作为模
板同时进行检测，以确保检测过程中没有污染或非特异
性。（4）应对方案和替代方法：各个质量控制步骤中如出
现异常或失败，实验室应有应对措施或备选方案；对于测
序结果质量差或有问题的区域应建立替代方法（如Sanger
测序）。
四、生物信息分析
NGS数据的生物信息分析可分为两个主要步骤：一是对测
序数据进行质控分析及过滤。二是对通过质控的序列进行
变异位点鉴定分析并注释。所用各种生物信息分析软件，
都要通过适量标准品测序数据进行验证，证明所用软件及
参数可达到临床报告的要求。
生物信息分析流程标准：（1）质控分析：为保证分
析结果的可靠性，需要对原始的测序数据进行质量控制与
过滤。测序数据的质量控制主要包含4个方面：质量评
估、去接头序列、去低质量序列、去重复序列。（2）序列
比对（mapping）：将通过质控后每一条read与参考基因
组进行比对，回贴到基因组上最佳位置。（3）变异鉴定：
对每个位点进行变异鉴定。在肿瘤panel测序中，主要检测
SNV和Indel两种突变类型，参数调整后可分析CNV。部分
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panel的设计还可以鉴定染色体易位。对于肿瘤panel基因
测序数据，鉴定后的变异位点都需要进行该位点可视化查
看和确认，如TheIntegrativeGenomicsViewer（IGV）。
（4）变异注释：基于通用数据库，对突变基因位点进行功
能注释，详见下文。
生物信息分析流程质量管理：实验室应建立生物信息
学程序/Pipeline的书面质量管理（QM）计划文件。必须包
含每次运行时监测和评估运行性能的指标和质控参数，以
及定期（例如每月、每季度）监测的指标和质控参数。指
标和质控参数可包括但不限于标准品的突变类型及百分
比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知变异类型和
变异频率的标准品进行验证，验证其特异性和灵敏度是否
达到实验室要求。验证结果签名留底备案。（1）NGS数据
存储：实验室需要在生物信息分析过程中对原始数据及最
后的结果数据进行标准化存储，并要保存相应的年限以备
查。（2）版本可追溯性：每份病例数据分析报告中，生物
信息数据分析流程所涉及软件、算法、参数及数据库的版
本必须可溯源。（3）异常记录。实验室需要建立一个异常
记录文档，用来记录偏离NGS生物信息分析标准分析流程
的检测。
生物信息分析质量指标：原始文件及比对结果文件的
质量指标见表1。
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表数据存储格式标准：为了规范和管理各类数据，
各个实验室需按照编号进行数据管理，所有数据按照国际
标准格式进行存储。必须建立本地变异数据库（用于检验
变异真实性）。
数据存储传输及共享安全标准：实验室需要制定规章
制度以确认测序数据在内部及外部存储及传输过程中的安
全性和机密性。正常人群的变异数据应该共享。
五、NGS结果解释及报告
临床报告包含内容：基于高通量测序技术，临床实验
室比较容易的获取更高通量的临床样本检测数据，不可避
免会检测到意义未知的变异位点，在实际工作中会有一定
的不确定性。但NGS的检测报告建议体现以下内容：
（1）检测名称，如XXX基因变异检测报告。
（2）患者基本信息，姓名，年龄，性别，住院号，送样医
院科室及医师等。
（3）样本信息，病理号，取材部位，样本类型（FFPE、新
鲜、血液等）、送检日期、报告日期等。
（4）病理信息，肿瘤组织类型、位置、TNM分期、细胞含
量、肿瘤细胞比例、特殊说明（出血、坏死、酸脱钙处理
等）。
（5）检测技术，包含所用基因panel、检测平台名称，分
析软件版本号等。
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（6）结果列表应包含，基因名称、变异在染色体位置、变
异频率、cDNA的Genbank号（NM开头）及符合人类基因
组变异协会（HumanGenomeVariationSociety,HGVS）书
写规范的突变类型、编码蛋白Genbank号（NP开头）及突
变类型、杂合/纯合状态等。
（7）临床意义解读和批注：体细胞突变，报告各个肿瘤检
测到的变异位点及临床意义。胚系突变，对于检测到的变
异位点的致病性予以相应的临床解释。临床意义解读要客
观平实的描述，在疾病相关性只描述既往研究中的疗效或
预测，不能出现使用何种治疗手段或策略的语言。
（8）若检测失败，应阐述失败原因。
（9）最终报告应由检测者、报告医师或指定审核人联合签
发。
2.基因变异的命名：在描述所检测出的基因变异时要遵循一
定的原则和规范，推荐使用人类基因组变异协会命名指南
（）。对于遗传病相关基因变异命名，推荐美国医学遗传
学学院（AmericanCollegeofMedicalGeneticsand
Genomics；）的遗传疾病变异分类指导的命名、遗传背景
说明以及权威文献说明。
3.临床意义的解读和批注：对于肿瘤体细胞突变，根据突变
的类型和已有的报道及指南，基因变异提倡分级的处理方
式：
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A级：美国食品药品管理局（FDA）或中国食品药品管理局
（CFDA）批准的用药治疗靶点；写入中外诊疗指南有明确
诊断/治疗/预后意义的变异。在报告注释该变异位点的临床
诊断/治疗/预后意义的权威指南来源。
B级：尚未进入诊疗指南，但已经写入该领域的专家共识的
变异位点。注释时要批注研究报道及专家共识的来源，明
确其药物及其临床意义、正在开展的状态等信息。
C级：FDA或CFDA批准用于其他肿瘤可预测疗效的基因变
异，或者正在进行中的临床试验变异位点。注释时要批注
用于其他肿瘤的权威指南，研究文献及临床试验正在开展
的状态等信息。
D级：处于学术争议或临床意义不明确的基因变异。同一实
验室应该有统一的政策用来应对检测过程中出现的临床意
义不明变异情况。
对于以上几种情况在报告的时候注意客观平实地描述检测
的结果，在病理报告中不能出现建议使用何种治疗手段或
策略的语言。
对于遗传疾病（germlinemutation）检测，除了中外诊疗指
南及重要参考文献以外，推荐两个数据库：Online
MendelianInheritanceinMan（）和美国医学遗传学学院
（）的遗传疾病变异分类指导注释临床意义，并附上数据
库和参考文献内容。遗传注释还可以参考各亚专科的专业
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数据库进行注释（比如乳腺癌BRCA1/2基因等）。
4.意义不明位点的处理：由于通量的增加和人种差异，临床
肿瘤样本可能发现新的变异位点。实验室必须制定相关政
策方案用来应对检测过程中出现的临床意义不明变异情
况。政策可以是一发现变异就报告，但附上说明和意义。
也可以是不报道这些发现或只报道小部分变异结果，并附
上说明和参考文献及数据库。但是在报告的备注里一定要
声明本实验室的报告规则。
5.知情同意：建议提供患者手写或在线版的知情书。