融合蛋白
翠屏教育信息网-霍尔转速传感器
2023年3月19日发(作者：公园设计)·216·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2012,47(2):216−222
LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定
李响1,高向东2,陶磊1,裴德宁1,郭莹1,饶春明1*,王军志1*
(1.中国食品药品检定研究院重组技术产品室,卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室,北京100050;
2.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)
摘要:运用液质联用、两种串联质谱对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定,确证其一级结构。将样品还原烷
基化后,通过胰蛋白酶酶解蛋白,PNGaseF去除多肽混合物中糖肽的糖基化,将去糖后的总肽用于液质联用系统,
通过液相分离后,运用Q-TOF和线性离子阱两种串联质谱测定各个肽段的b,y碎片离子,分析测定融合蛋白FP3
的氨基酸全序列。通过LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76%氨基酸序列测定,通过LC-ESI-Trap完成余下
24%氨基酸序列测定。液质联用、串联质谱法测定蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确,是对重组蛋白结构分析
和确证的重要手段。
关键词:液质联用;融合蛋白;氨基酸序列
中图分类号:R917文献标识码:
A文章编号:0513-4870(2012)02-0216-07
Measurementoftheaminoacidsequenceforthefusionprotein
FP3withLC-MS/MS
LIXiang1,GAOXiang-dong2,TAOLei1,PEIDe-ning1,GUOYing1,RAOChun-ming1*,WANGJun-zhi1*
(mentofRecombinantProduct,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,KeyLaboratoryoftheMinistry
ofHealthforResearchonQualityandStandardizationofBiotechProducts,Beijing100050,China;
ofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)
Abstract:TheaminoacidsequenceofthefusionproteinFP3wasmeasuredbytwotypesofLC-MS/MSand
eductionandalkylation,theproteinwasdigestedwithtrypsinand
edpeptideswereseparatedbyLC,then
Q-TOFandIontraptandemmassspectrometrywereusedtomeasureb,yfragmentionsofeachpeptideto
y-sixpercentoffullaminoacidsequenceofthe
fusionproteinFP3wasmeasuredbyLC-ESI-Q-TOFwiththeremaining24%
LC-MSandtandemmassspectrometryarerapid,sensitive,accuratetomeasuretheproteinaminoacidsequence,
theyareimportantapproachtostructureanalysisandidentificationofrecombinantprotein.
Keywords:HPLC-MS/MS;fusionprotein;aminoacidsequence
蛋白质的空间结构与功能之间有密切相关性,
其特定的空间结构是行使生物功能的基础,而蛋白
质的空间结构取决于它的一级结构。确证蛋白药品的
收稿日期:2011-10-18;修回日期:2011-12-13.
基金项目:国家863计划资助项目(2007AA021601);重大新药创制资
助项目(2009ZX09307).
*通讯作者Tel:86-10-67095380,E-mail:raocm@
Tel:86-10-67095782,E-mail:wangjz@
一级结构是质量控制的根本[1]。蛋白质由20种氨基
酸组成,不同的氨基酸组成和氨基酸序列可能导致
等质量的肽,因此仅从分子量大小来判定一级结构
不够严谨,为了确证从DNA翻译到蛋白质的正确性,
重组蛋白质需要分析鉴定氨基酸序列。
融合蛋白药物是近年市场增长率很快的一类生
物技术药物。本文以一种重组血管表皮生长因子抗体
Fc段融合蛋白(FP3融合蛋白,rVEGFR-Fc)为研究
李响等:LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定·217·
对象,对其一级结构进行了确证,使用两种不同的串
联质谱,通过对肽谱母离子进行能量碰撞解离,形成
子离子碎片图谱,通过分析碎片图谱,测定FP3融合
蛋白的氨基酸顺序[2]。
材料与方法
仪器与试剂高效液相色谱系统(Waters
Alliance2695);二极管阵列检测器(Waters2996);质
谱仪(Q-TOF-Micro,Micromass);质谱仪(Finnigen
LTQ,Thermo);Masslynx4.0数据处理软件。Proteome
discoverer1.2数据处理软件。色谱柱(Eclipseplus
C18RRHD1.8μm,2.1mm×150mm,Agilent)。DTT
(Inalco);IAA(Acros);PNGaseF(NEB,0705L);
TrypsinDigestion试剂盒(Merck)。
样品酶切方法取FP3融合蛋白样品一支(200
μL,4mol·L−1),用7mol·L−1盐酸胍-Tris-HCL溶液
(pH8.0)稀释至482μL,加入新鲜配置的1.0mol·L−1
IAA13μL,混匀,锡箔纸包好避光反应1h。用超
纯水平衡5mL的脱盐柱10个柱体积。流速不超过
1mL·min−1后,将该样品0.5mL注入5mL的脱盐柱
中,再取1%碳酸氢铵缓冲液1mL注入该柱,洗脱的
1.5mL溶液弃去,取1%
碳酸氢铵1.0mL注入上述柱
中,接收洗脱液1.0mL。−20℃保存。取上述处理的
样品200μL,加入胰蛋白酶25μL,混匀后37℃水浴
4h;补加酶25μL,混匀后37℃水浴18h。再加入
PNGaseF10μL,于37℃水浴2h反应完后,100℃水
浴15min,冷却至室温后用0.22μm滤器过滤上清液
于样品瓶中,备用待分析。
色谱方法用超纯水冲洗管路A、B,再用流动
相A(0.1%甲酸)和流动相B(0.085%
甲酸+80.0%
乙腈+20.0%水)分别充满管路A、B。参数为:柱温
60℃,检测波长214nm,流速0.2mL·min−1,用流动
相B冲洗柱子(EclipseplusC18RRHD,1.8μm,2.1
mm×150mm,美国Agilent公司)至与基线水平,再
用流动相A冲洗柱子至与基线水平。上样体积5μL,
流速0.2mL·min−1,记录0～120min内的色谱图。
ESI-Q-TOF质谱方法[3]毛细管电压:3kV;锥
孔(Cone)电压:30V;去溶剂气体温度:200℃;源
温:80℃;飞行管电压:5.63kV;微通道板(MCP)
电压:2.3kV;去溶剂气体流速:400L·h−1,扫描范围:
m/z100～3000。
DDA扫描参数设定为全扫描范围(fullscan):
m/z400～1800;扫描时间2s,扫描间隔0.1s;
MS/MS扫描范围:m/z200～1800,扫描时间1.8s,
扫描间隔0.1s,选择带2、3和4个电荷的母离子分
析。碰撞电压20～50V。色谱柱后经UV检测器后
直接进入质谱检测器,记录总离子流图。用校正溶液
在扫描范围内校正质谱仪后按设定的参数液质联用
进行测定。
ESI-Ion-Trap离子阱质谱方法毛细管温度:
275℃;去溶剂气体流速:15L·h−1;扫描范围:m/z
400～2000;阳极源电压:4.7kV;源电流:100μA;毛
细管电压:40V;Tubelens电压:120V;阴极源电压:
5kV;源电流:100μA;毛细管电压:−35V;Tubelens
电压:200V。MSn扫描参数设定:多级扫描,包括
3个阶段,第一阶段为全扫描,范围:m/z500～2000;
第二阶段为SIM(singleionmonitor)扫描,选择丰度
最高的母离子做精细扫描不加能量;第三阶段为
SRM(selectivereactionmonitor)扫描,同时依次对3
个丰度最高的母离子做SRM扫描。施加能量碰撞,
碰撞电压35V。色谱柱后经UV检测器后直接进入
质谱检测器,记录总离子流图。
结果
1融合蛋白FP3质量肽图绘制
图1为还原、烷基化样品经胰酶酶解后脱糖基液
质联用所得图谱:A为紫外214nm检测结果,B为质
谱总离子流图。质量肽图解析结果见表1。
2HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS测定
质量肽图中的每个肽段作为母离子在质谱仪的
碰撞室经高流速的惰性气体碰撞解离(CID裂解),
沿肽链在酰胺键处断裂并形成子离子。肽键断裂时,
会产生a、b、c型和x、y、z型系列离子(图2)其
Figure1Massmappingofpeptidesample.A:UV:214nm;
B:TIC
·218·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2012,47(2):216−222
inealkylationconsidered;bGlycosylgroupsremoveconsidered;
cTerminallysinedeletionconsidered
M
wNameSequence
TheoreticalMeasured
t
R
/min
T1GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR2490.202490.1874.26
T2aELVIPCR903.48903.4341.98
T3bVTSPNITVTLK1171.681172.8949.89
T4-5KFPLDTLIPDGK1342.751342.7760.71
T5FPLDTLIPDGK1214.651214.7066.87
T6-7RIIWDSRK944.52944.5138.67
T7IIWDSR788.42788.3839.69
T7-8IIWDSRK916.51916.4432.71
T9bGFIISNATYK1112.591112.5649.61
T8-9bKGFIISNATYK1241.671241.4443.98
T10aEIGLLTCEATVNGHLYK1934.981935.0035.75
T11TNYLTHR903.46903.5921.18
T12QTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEK2435.292435.2276.93
T13a,bLVLNCTAR963.52963.4135.75
T14TELNVGIDFNWEYPSSK1997.941998.0071.12
T15HQHK548.28548.192.03
T16-17KLVNR628.40628.262.03
T17LVNR500.31500.213.12
T18DLK374.22374.213.06
T19TQSGSEMK866.38866.3629.52
T20-21KFLSTLTIDGVTR1449.821450.1654.65
T21FLSTLTIDGVTR1321.721321.6660.78
T22aSDQGLYTCAASSGLMTK1806.811806.6848.56
T23-24bKNSTFVR851.45851.5021.25
T24bNSTFVR722.37722.3526.28
T25VHEKPFVAFGSGMESLVEATVGER2575.272575.4971.12
T26-27VRIPAK682.45682.4321.25
T28YLGYPPPEIK1175.621175.6151.06
T29WYK495.25495.2719.80
T30bNGIPLESNHTIK1321.701322.1537.06
T31AGHVLTIMEVSER1440.741440.7848.56
T32bDTGNYTVILTNPISK1634.851636.1761.98
T33-34EKQSHVVSLVVYVPPGPGDK2134.142134.4752.60
T34QSHVVSLVVYVPPGPGDK1877.001877.0156.30
T35aTHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPK2895.502895.7674.15
T36DTLMISR834.43834.3738.38
T37aTPEVTCVVVDVSHEDPEVK2156.032155.3655.56
T38FNWYVDGVEVHNAK1676.791676.7453.17
T39TKPR500.31500.293.13
T40bEEQYNSTYR1188.501189.5723.87
T41VVSVLTVLHQDWLNGK1807.001807.2574.15
T42-44aEYKCKVSNK1154.581154.6739.09
T45ALPAPIEK837.50837.4638.38
T46TISK447.27447.243.08
T47-48AKGQPR655.38655.583.08
T49EPQVYTLPPSR1285.671285.6743.98
T50DELTK604.31604.3570.39
T51aNQVSLTCLVK1178.631178.3849.61
T52GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK2543.122543.0664.47
T53ATPPVLDSDGSFFLYSK1842.901842.9668.63
T54LTVDK574.33574.3219.21
T55-56aSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK3045.373044.99104.30
T57cSLSLSPG659.35659.3135.88
李响等:LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定·219·
中b型和y型离子在质谱图中较多见,丰度较高[4,5]。
y、b离子系列相邻的离子的质量差,即为氨基酸残基
质量,根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨
基酸的序列。图3为保留时间为48.56min的酶解肽
段的一级质谱图,图中A2是带有双电荷的T31肽段,
A是带有单电荷的T31肽段。图4为T31肽段一级
质谱图。图5为T31肽段的串联质谱图。串联质谱
产生的子离子质谱图要比单一肽段的质量肽图谱复
杂,用Masslynx4.0数据处理软件帮助计算识别b、y
等各系列的离子,根据肽谱母离子质量,综合考虑
一些修饰方式(如脱糖基、脱氨基等)。在CID裂解
中,往往难以获得全部的b离子或者y离子,但由于
它们成对出现,通过b或y离子的综合判定可以完
成氨基酸顺序的测定。y离子的形成有
-H转移,并
且胰酶酶解的蛋白C端氨基酸是碱性氨基酸赖氨酸
(K)或精氨酸(R),电荷保留在其碱性侧链上,故C
端开始的y
1
离子的结构是NH
2
-CH(R)(H+)-COOH,
m/z相对于氨基酸残基多了一个–H、-OH和侧链上
的质子,共增加19D。从N端开始的b
1
离子的结构
是NH
2
-CH(R)-CO-+(R是氨基酸侧链)m/z相对于
氨基酸残基
-NH-CH(R)-CO-多了一个-H,质量上加了
1D。表2为T31肽段串联质谱结果分析。以T31肽
段为例,通过b,y离子的综合分析,结合其理论序列,
测得T31肽段的氨基酸序列为AGHVLTIMEVSER。
用同样的方法得到融合蛋白FP3酶解肽段T1,T2,T3,
T4-5,T6-7,T7,T8-9,T11,T12,T14,T15,T16-17,T17,
T18,T19,T21,T22,T24,T25,T27,T28,T29,T30,
T33,T34,T36,T37,T38,T39,T40,T41,T42,T43,
T44,T45,T46,T48,T50,T51,T52,T53,T54,T55和
T57的测序结果。
Figure2Diagramofproductions
Figure3Massspectrumofthepeptide(t
R
=48.56min)
Figure4MassspectrumofthepeptideT31(m/z1441.78)
·220·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2012,47(2):216−222
Figure5TandemmassspectraofpeptideT31
Table2ResultoftandemmassspectrometryofpepdideT31
m/z
Production
TheoreticalMeasured
Sequence
y
1
175.12175.14R(C-terminal)
y
2
304.16304.16E
y
3
391.19391.24S
y
4
490.26490.31V
y
5
619.31619.40E
y
6
750.35750.46M
y
7
863.43863.54I
y
8
964.48964.58T
y
9
1077.561077.67L
y
10
1176.631176.80V
b
3
266.13266.16H
b
2
129.07129.12G
b
1
72.0472.09A(N-terminal)
3HPLC-ESI-Ion-Trap-MS/MS测定
采用Q-TOF质谱得到了融合蛋白76%的氨基酸
覆盖率。用Ion-Trap线性离子阱串联质谱测得了余下
的肽段T5,T9,T10,T13,T20-21,T22-23,T26-27,T35,
T47-48,T49和T55-56肽段的氨基酸顺序,图6为肽
Table3ResultoftandemmassspectrometryofpepdideT5.
*Deamidationconsidered,-17D
m/z
Production
TheoreticalMeasured
Sequence
y
1
147.11147.14K(C-terminal)
y
2
204.13204.07G
b
9
1012.541012.49D
y
4
416.21416.36P
y
5
529.29529.30I
y
6
642.38642.38L
y
7
743.43743.41T
y
8
858.47858.51D
y
9
971.54971.53L
y
10
1068.59534.82(z=2)P
y
11
*1215.76599.57(z=2)F(N-terminal)
段T5的串联质谱图,表3为肽段T5的串联质谱结果
分析。
4融合蛋白FP3氨基酸全序列测定
样品全序列测定结果见图7,序列中未画方框的
为采用Q-TOF串联质谱得到的测序结果,画方框的
为采用离子阱质谱串联质谱得到的测序结果,结果
Figure6TandemmassspectraofpeptideT5
李响等:LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定·221·
Figure7FullaminoacidsequenceofthefusionproteinFP3
与氨基酸理论序列一致。
讨论
在对氨基酸序列的质谱测定中,作者采用了两
种不同的串联质谱,在实验中发现Q-TOF串联质谱
的信号较弱,作者尝试了一些办法,如增加进样量,
调整参数通过降低分辨率来达到提高灵敏度,根据
母离子的m/z值,采用10～40V的梯度碰撞电压,在
数据采集上采用DDA模式和保留时间限定模式相结
合的方式。通过Q-TOF串联质谱分析得到了76%
的
氨基酸序列图谱,为完成100%的测序工作,作者又
采用了串联离子阱质谱。虽然分辨率较低,但灵敏度
高、丰度高,容易得到余下的氨基酸序列图谱。离子
阱质量分析器有离子富集作用[6,7],可使几乎所有离
子都能够循环进入检测器中。质谱分析系统最常运用
的是四级杆、离子阱和飞行时间质量分析器,在蛋白
质测序和鉴别领域运用中,离子阱和飞行时间发展
很快,分辨率、质量范围、扫描速率和灵敏度有了很
大提高,各种质量检测器的组合也不断出现,如四级
杆-离子阱联用的质量检测器综合了各自的优势,应
用也越来越多[8]。每一种质量分析器各有优缺点,应
该将其有机结合以提高蛋白测序工作的效率。
得到高质量的碎片离子谱是串联质谱测定氨基
酸顺序的关键,碎片离子图谱是通过碰撞诱导解离
(collision-induceddissociation,CID)产生的,其中要
分析的多肽母离子在碰撞室内被惰性气体打碎和分
离成碎片子离子,这些碎片子离子信号被记录下来
形成碎片离子谱,在低能CID碰撞下,断裂是有特异
性和规律性的。采用胰蛋白酶酶解蛋白后,除了原始
的蛋白C端肽段,赖氨酸和精氨酸残基是所有肽段
的羧基端,C端的赖氨酸或精氨酸得到一个电荷易产
生一个完整的y离子碎片,相对于其他的蛋白酶酶解
结果,采用胰蛋白酶的串联质谱图质量更高。在实验
中选择双电荷的多肽母离子得到的碎片子离子图往
往质量较高[9]。
对碎片子离子图谱的解析方法有很多种,作者
在实验中采用碎片离子图谱与数据库蛋白相关的分
析方法,该方法通过肽段的分子质量信息,获得其所
有可能的氨基酸组成,将这些理论推导的氨基酸序
列的碎片子离子图谱与测得的实际图谱进行相关分
析匹配,来确定测定图谱的氨基酸序列。在判断b、y
离子碎片时,经常会出现b-H
2
O和y-NH
3
的高丰度
离子,在分析时需要考虑。通常还有一些氨基酸的侧
链特定基团会中性丢失,常见的有谷氨酰胺和精氨
酸的氨基丢失,将会减少17D,丝氨酸、苏氨酸、天
冬氨酸和谷氨酸上的水丢失,减少18D。另外,在解
谱中考虑了蛋氨酸的氧化及半胱氨酸的烷基化情况,
蛋氨酸的氧化会增加16D,半胱氨酸烷基化会增加
57D。随着计算机算法和越来越成熟的数据库的发展,
运用相应的计算软件来分析使得解谱越来越自动化。
串联质谱法测序通过碎片离子的质量差值来推
测氨基酸顺序,无法区分质量数一样的同分异构体
氨基酸,这是串联质谱法的一个缺陷。传统的Edman
降解法是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的
序列。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰,然后
从多肽链上切下修饰的残基,根据色谱保留时间的
不同得到鉴定,余下的多肽链(少了一个残基)再进
行下一轮降解循环。这个过程可以因同分异构体保留
时间的不同而得到鉴别。但是Edman降解法无法检
出半胱氨酸,而串联质谱法可以很方便的测出。串联
·222·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2012,47(2):216−222
质谱法测定蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确,是
Edman降解法的重要补充,更是对重组蛋白结构分
析和确证的重要手段[10]。
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祝贺《药学学报》被评为2010年“百种中国杰出学术期刊”
在2011年12月2日召开的“中国科技论文统计结果发布”会上，中国科学技术信息研究所公
布了《2011年版中国科技期刊引证报告》核心版数据。根据最新数据，《药学学报》综合评价总分
排在药学类期刊第1位，再次荣获“百种中国杰出学术期刊”。
《药学学报》从2002年开始，连续9年被评为“百种中国杰出学术期刊”。
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