外周血单核细胞
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2023年3月18日发(作者：美国地名)实验预备
一．人外周血单核细胞分离
1.抗凝血的预离心别离取正常人新鲜抗凝全血
A:20mL于50mL离心管中，以2000r/min离心20min，吸弃上层血浆，
取得基层沉淀细胞约10～mL。
2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀
A中的细胞中加入Hank′s液(不含Ca2+、Mg2+,pH～体积比仍未1:1，混
匀，制成细胞悬液。
B:无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。
另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上
1cm处将细胞悬液警惕而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。现在稀
释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000r/min离心
20min，离心终止后，掏出离心管，可见管中液体已经分层。
管内可见分为4层：最上层是血浆，含部份血小板：第二层为薄薄的白膜层，
要紧台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及
红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞那么紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜(图
21—3)：
3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁
吸去最上层的血浆，搜集血浆层和淋巴细胞分离液交壤面的单个核细胞，尽可能
全数吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛
细吸管轻轻吹判均匀，幸免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心
1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。
注意：还能够先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰着雾状层，然后在把
要的部份慢慢吸出来。第二种方式，比较简单一些。
再用一样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞
分离液。再以RPMI-1640培育基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂
质。按每毫升血液标本加mL含20%小牛血清的Hank′s液(或含10%胎牛血清及25
mmol/Lhepas的RPMI-1640液3～4mL)从头混悬细胞37℃、5%CO2孵育箱中
培育2～3h后去除上清，取得贴壁的单核细胞。于各培瓶中别离加入含10%胎牛
血清的RPMI-1640液3～4mL，按需调定细胞密度,于37℃、5%CO2孵育箱中培
育备用。
4.单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定
取必然体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56等检查,以测定所得细胞的
纯度。取1滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。
取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着
色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。