牛津杯

牛津杯

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2023年3月17日发(作者：教材答案)

土壤芽孢杆菌NDD-1及其拮抗菌短小芽孢杆菌NDY-10的

分离、鉴定和抑菌特性

李静泉;高坤;许继飞;张志磊;赵吉

【摘要】从内蒙古大唐国际托总托发电有限责任公司储煤区土壤样品中筛选到1

株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1.通过菌落形态和显微镜观察,结合

16SrRNA、gyrB基因比对分析对菌株进行鉴定;采用牛津杯法对菌株NDY-10进

行抑菌谱试验;通过紫外线照射、不同温度、不同pH值等处理对菌株NDY-10发

酵上清液对菌株NDD-1的抑菌活性及稳定性进行研究.结果表明,经鉴定,菌株

NDY-10、NDD-1分别为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、土壤芽孢杆菌

(Solibacillussp.).短小芽孢杆菌NDY-10对土壤芽孢杆菌NDD-1、大肠杆菌、金

黄色葡萄球菌的抑制作用依次减弱,而对枯草芽孢杆菌、酵母菌、青霉菌没有抑制

作用;短小芽孢杆菌NDY-10发酵上清液抑菌活性受热处理影响较大,受紫外线照射

处理影响较小,在pH值为5～9范围内保持较高的稳定性.首次报道了短小芽孢杆

菌对土壤芽孢杆菌的抑菌作用.

【期刊名称】《江苏农业科学》

【年(卷),期】2017(045)015

【总页数】5页(P91-95)

【关键词】短小芽孢杆菌;土壤芽孢杆菌;分离;鉴定;抑菌;特性

【作者】李静泉;高坤;许继飞;张志磊;赵吉

【作者单位】内蒙古大学环境与资源学院/内蒙古自治区环境污染控制与废物资源

化重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学环境与资源学院/内蒙古自治区

环境污染控制与废物资源化重点实验室,内蒙古呼和浩特010021;内蒙古大学环境

与资源学院/内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室,内蒙古呼和浩特

010021;包头市机动车排气检测管理中心,内蒙古包头014060;内蒙古大学环境与

资源学院/内蒙古自治区环境污染控制与废物资源化重点实验室,内蒙古呼和浩特

010021

【正文语种】中文

【中图分类】Q93-331

由于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)在植物病害防治[1-3]、微生态制剂[4-5]、水

环境保护[6-8]等方面具有巨大的应用潜力，因此近年来逐渐成为研究热点。已有

研究表明，短小芽孢杆菌对多种病原性微生物具有抑菌作用。郑敏筛选出1株短

小芽孢杆菌，在平板试验中对芒果炭疽病病原菌的抑制率为88.87%，在活体试验

中该株菌的抑菌率高于80%，可有效降低芒果自然腐烂[9]。胡晓璐等以水稻稻瘟

病病菌(Magnaporthegrisea)为试验菌株，发现短小芽孢杆菌DX01对水稻稻瘟

病病原菌孢子萌发的抑制率为36%[10]。Ghasemi等从伊朗高盐环境中筛选出1

株短小芽孢杆菌，发现它可分泌2种几丁质酶(ChiS、ChiL)，可抑制多种植物病原

菌[11]。于婷等对分离出的短小芽孢杆菌BSH-4菌株及其抗菌蛋白进行抑菌谱研

究，发现它对8种常见蔬菜病原真菌具有抑制作用，其中对黄瓜蔓枯病病菌、番

茄早疫病病菌和黄瓜立枯病病菌具有较高的抑菌活性[12]。彭虹旎对筛选出具有抑

菌活性的短小芽孢杆菌4D-14进行研究，确定其分泌的抗菌物质为小肽类，受蛋

白酶影响不大，具有较高的热稳定性[13]。颜爱勤等的研究结果表明，短小芽孢杆

菌JK-SX001菌株产生的非蛋白抗菌物质造成病原菌菌丝顶端畸形，形成膨胀，强

烈抑制病原真菌菌丝生长，同时通过抑制病原菌孢子产生芽管来抑制分生孢子的萌

发[14]。Aunpad等从短小芽孢杆菌中首次分离到pumilicin4细菌素，对耐万古

霉素肠球菌(VRE)和一些革兰氏阳性细菌有显著的抑制作用，经鉴定这种细菌素属

于多肽类物质[15]。但有关短小芽孢杆菌对芽孢杆菌属及其近缘属菌株的抑菌作用

却未见报道。本研究分离得到1株拮抗菌株——短小芽孢杆菌NDY-10(B.

pumilusNDY-10)及被它抑制的土壤芽孢杆菌NDD-1菌株(Solibacillussp.

strainNDD-1)，扩大了短小芽孢杆菌抑菌作用的范围，并研究了短小芽孢杆菌

NDY-10的抑菌谱及该菌株对土壤芽孢杆菌NDD-1菌株的抑菌活性。

1.1试验材料

1.1.1土壤样品土壤样品，采自内蒙古大唐国际托克托发电有限责任公司的煤炭储

藏区。

1.1.2主要试剂牛肉浸膏、葡萄糖、细菌学蛋白胨、酵母提取物、NaCl、

MgSO4·7H2O、KH2PO4、琼脂粉，均为化学纯。

1.1.3培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基：0.5%牛肉浸膏，1.0%细菌学蛋白胨，1.0%

NaCl，用3mol/LNaOH调节pH值至7.2，121℃高压灭菌30min。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：每100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入1.5g琼脂

粉配制而成。

水琼脂培养基：蒸馏水加琼脂粉至终浓度为1.5%，121℃高压灭菌30min。

马丁式培养基：1.00%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%KH2PO4，0.05%

MgSO4·7H2O，1.50%琼脂粉，121℃高压灭菌30min。

1.1.4主要设备PowerCyclerSL96Gradient型PCR仪，购自AnalytikJenaAG；

GBOX型凝胶成像仪，购自GeneCompanyLimited；UV-2600A型紫外-可见

分光光度计，购自尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1菌株的分离、鉴定采用稀释平板涂布法从土壤样品中分离菌种。向150mL

无菌三角瓶中加入45mL灭菌水和适量已灭菌小玻璃球，称取5g土壤样品加入

三角瓶中，制成土壤悬液，于30℃摇床振荡2h。用移液器吸取1mL土壤悬液

于无菌试管中，加入9mL无菌水，混匀后从中吸取1mL加入第2个无菌试管中

并加入9mL无菌水，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66

个稀释梯度的土壤悬液。分别吸取200μL10-4、10-5、10-63个稀释梯度的土

壤悬液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，于28℃培养箱中倒置培养3d。

在分离菌株资源过程中发现有拮抗菌及被抑制菌存在，分别挑取、纯化，并验证其

抑菌效果，将拮抗菌命名为NDY-10，将被抑制菌命名为NDD-1，进行菌株鉴定。

对菌株进行划线培养，观察菌落形态，并对菌株分别进行革兰氏染色和芽孢染色，

显微镜下观察染色结果。

采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组

DNA，对菌株的16SrRNA基因和gyrB基因[16-18]分别进行PCR扩增、测序、

构建系统发育树。16SrRNA基因PCR扩增所用引物为27F、1492R，引物序列：

27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-

GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16SrRNA基因PCR扩增程序：94℃5min；

94℃30s，55℃30s，72℃80s，循环26次；72℃10min。gyrB基因

PCR扩增所用引物为UP-1、UP-2S[13]，引物序列：UP-1，5′-

GAAGTCATCATGACCGTTCT-GCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′；UP-2S，

5′-AGCAGG-GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。

gyrB基因PCR扩增程序：94℃5min；94℃40s，60℃40s，72℃2min，

循环30次；72℃10min。

基因测序结果在NCBI上通过BLAST进行序列比对分析，利用MEGA4.1软件构

建菌株的系统进化树。

1.2.2短小芽孢杆菌NDY-10抑菌谱测定为了检测NDY-10菌株的抑菌谱，除

NDD-1菌株外再选择2种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)、1种

革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及2种真菌(青霉菌、酵母菌)进行NDY-10菌株的抑菌谱

试验。供试菌株及来源信息见表1。

使用牛津杯法检测NDY-10菌株的发酵液对6种供试菌株的抑菌作用。先在培养

皿中倒入10mL左右的水琼脂培养基，待其冷却后，对供试菌株作下述处理：对

于细菌供试菌株，将装有50mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的三角瓶灭菌后，待其

降至60℃左右时加入1mL供试细菌菌株菌液，轻轻转动使菌液均匀分布在培养

基中，在水琼脂平皿中倒入10mL左右已加入菌液的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；

真菌供试菌株接入马丁式培养基中作相同处理。待培养基凝固，在平皿中等间距放

入3个牛津杯，轻轻加压使牛津杯固定在培养基上，每个牛津杯中加入100μL

NDY-10菌株发酵液。细菌在37℃的恒温培养箱中培养7d，真菌在28℃恒温

培养箱中培养7d。

1.2.3短小芽孢杆菌NDY-10的抑菌活性及其稳定性测定NDY-10菌株在220

r/min、37℃摇床中培养2d，12000r/min离心15min，收集上清液。无菌条

件下，对发酵上清液作如下处理。80℃处理：上清液在80℃水浴锅中水浴1h；

121℃处理：上清液在灭菌锅中121℃条件下处理30min；将上清液用3mol/L

HCl、NaOH分别调节pH值为3、5、9、11，处理1h，分别记为pH3、pH5、

pH9、pH11处理组；紫外处理：将上清液在超净工作台中于紫外线照射下处理1

h；对照：不作任何处理。

然后将高温处理过的发酵上清液降至室温，将不同酸碱度处理过的发酵上清液pH

值调为7.8。

分别取上述处理过的和未处理的发酵上清液各6mL于试管中，向每支试管中加入

3mLNDD-1菌株菌液；同时设置空白对照组，其处理方法为6mL牛肉膏蛋白

胨培养基与3mLNDD-1菌株菌液混合。在37℃、220r/min摇床中发酵培养6

h，测定培养前、培养后菌液的D600nm。每个处理3次重复，D600nm取平均

值。

抑菌率计算公式：

式中：r为抑菌率；A为空白对照组(添加牛肉膏蛋白胨培养基)菌液的D600nm；

A0为0h时菌液的D600nm；A1为6h时菌液的D600nm；B为处理组(添加

NDY-10发酵上清液)菌液的D600nm；B0为0h时菌液的D600nm；B1为6

h时菌液的D600nm。

相对抑菌活性计算公式：

式中：a为相对抑菌活性，%；r2为经过处理的发酵上清液的抑菌率，%；r1为

未经处理的发酵上清液的抑菌率，%。

2.1菌株鉴定

拮抗菌株NDY-10为革兰氏阳性菌，菌落外圈呈现半透明状态，中间乳白色，形

状不规则，菌落扁平，边缘不整齐，表面湿润、光滑，有黏性；在显微镜下观察菌

体呈细杆状，比较长，多数单独存在，少部分成链排列，芽孢为近端生。将菌株

NDY-10的16SrRNA、gyrB基因序列进行BLAST比对分析，发现菌株NDY-10

的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中短小芽孢杆菌(s)的16S

rRNA基因序列相似性最高，最大相似度达99%。菌株NDY-10的gyrB基因序

列与sHTC38的gyrB基因序列相似度为99%(覆盖率87%)，与B.

pumilusLLTC93的gyrB基因序列相似度为98%(覆盖率86%)，与s

NJ-V2的gyrB基因序列相似度为91%(覆盖率97%)，与sSH-B9的

gyrB基因序列相似度为90%(覆盖率99%)。因此，将菌株NDY-10鉴定为短小

芽孢杆菌(s)。sNDY-10的16SrRNA基因序列的GenBank

登录号为KT036668，其gyrB基因序列的GenBank登录号为KT036670。菌株

NDY-10的16SrRNA、gyrB基因序列系统发育树分别如图1、图2所示，聚类

结果与BLAST比对分析结果一致。

被抑制菌株NDD-1为革兰氏阳性菌，菌落呈半透明状态，淡黄色，圆形，菌落饱

满凸起，边缘整齐，表面湿润、光滑，有黏性，在显微镜下观察菌体呈短杆状，多

数单独存在，少部分成链排列，芽孢为端生，芽孢呈圆形，而芽孢杆菌属菌株的芽

孢呈椭圆形，这是土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)菌株区别于芽孢杆菌属(Bacillus)

菌株的一个重要特征[19]。将菌株NDD-1的16SrRNA基因序列和gyrB基因序

列进行BLAST比对分析，发现菌株NDD-1的16SrRNA基因序列与GenBank

数据库中的Solibacillus、Bacillus中部分菌株的16SrRNA基因序列的相似度均

达到99%。菌株NDD-1的gyrB基因序列与土壤森林芽孢杆菌(tris)

StLB046的gyrB基因序列相似度为92%(覆盖率99%)，与trisDSM

12223的gyrB基因序列相似度为91%(覆盖率99%)，与nsisMTCC

7902的gyrB基因序列相似度为96%(覆盖率67%)。因此，将菌株NDD-1鉴定

为土壤芽孢杆菌()[19-20]。NDD-1

的16SrRNA基因序列的GenBank登录号为KT036669，其gyrB基因序列的

GenBank登录号为KT036671。菌株NDD-1的16SrRNA、gyrB基因序列系统

发育树分别如图1、图3所示，聚类结果与Blast比对分析结果一致。

2.2短小芽孢杆菌NDY-10的抑菌谱

通过牛津杯法检测NDY-10菌株对6株供试菌株的抑菌效果，由表2可知，菌株

NDY-10对NDD-1的抑制作用最强，对大肠杆菌的抑制作用较强，对金黄色葡萄

球菌的抑制作用较弱，而对枯草芽孢杆菌、酵母菌、青霉菌则没有抑制作用。

2.3短小芽孢杆菌NDY-10的抑菌活性及其稳定性

由表3可知，对照组对NDD-1菌株的抑制率为78.2%。对NDY-10菌株的发酵

上清液作不同处理后，其发酵上清液表现出不同的抑菌活性。

高温处理后，NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1菌株的抑菌率下降。80℃处理

后其抑菌率下降至37.2%，相对抑菌活性为47.57%；而121℃处理后其抑菌率

下降至23.7%，相对抑菌活性为30.31%。表明热处理对NDY-10菌株发酵上清

液的抑菌活性有明显的影响。

在pH值分别为3、5、9、11的处理条件下，NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1

菌株的抑菌率分别为30.9%、69.3%、72.5%、41.3%，相对抑菌活性分别为

39.51%、88.62%、92.71%、52.81%。可见在pH值为5～9的处理范围内，其

发酵上清液的抑菌活性保持较高的稳定性，抑菌率高于69%，相对抑菌活性高于

88%。

紫外线处理后NDY-10菌株发酵上清液对NDD-1菌株的抑菌率为66.4%，相对

抑菌活性为84.91%，可见紫外照射对NDY-10菌株发酵上清液的抑菌活性影响

较小。

本研究从内蒙古大唐国际托克托发电有限责任公司储煤区土壤中分离、筛选到1

株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1，经鉴定，两者分别为短小芽孢杆

菌、土壤芽孢杆菌。在已报道的抑菌性短小芽孢杆菌中，如sDX01[10]、

sSG2[11]、sBSH-4[12]、s4D-14[13]、B.

pumilusJK-SX001[14]、sWAPB4[15]等均未见有关短小芽孢杆菌对

芽孢杆菌属及其近缘属菌株的抑菌作用的报道。sNDY-10对.

strainNDD-1的抑制作用扩大了短小芽孢杆菌抑菌作用的范围。同时通过抑菌谱

试验发现，sNDY-10虽然对NDD-1具有非常强的抑制作

用，但对枯草芽孢杆菌却无抑制作用，说明sNDY-10对芽孢杆菌属及

其近缘属菌株的抑制作用具有选择性，其选择抑制的机制有待进一步研究。

对sNDY-10发酵上清液的抑菌活性及稳定性进行研究，结果显示，其

发酵上清液的pH值为7.8时，抑菌率为78.2%；抑菌活性受热处理的影响较大，

80℃处理后其抑菌率下降至37.2%，121℃处理后，其发酵液的抑菌率下降至

23.7%；抑菌活性受紫外线处理的影响较小，紫外线处理1h后，其发酵上清液的

抑菌率为66.4%；在pH值为5～9的范围内其发酵上清液保持较高的抑菌活性，

抑菌率高于69%。

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