基因实验
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2023年2月28日发(作者：voc废气处理)基因工程实验报告
实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定
一、实验目的
学习质粒的酶切及电泳分析。
二、实验原理
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主
复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人
工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价
闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：
碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、
快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异
而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质
粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不
会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来
的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不
同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平
末端，这样有利于DNA片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切
后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点
的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为
对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质
量。
三、实验材料、仪器及试剂
（一）实验材料
含载体质粒pET28a的大肠杆菌
（二）试剂
1、LB液体培养基
2、质粒提取试剂盒(天根生物科技)
3、TBE缓冲液
4、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）
5、琼脂糖
6、NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)
7、DNA回收纯化试剂盒（天根生物科技）
（三）仪器
1、Eppendorf管、离心管架
2、10，50，200，1000μL微量加样器
3、Eppendorf台式高速离心机
4、电泳仪系统
5、恒温水浴箱
6、凝胶成像仪
7、摇床等
四、实验步骤
（一）质粒提取
1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，
12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2、取1.5mL过夜培养的菌液（已备好），加入1.5mL离心管中，使用12,000rpm离
心1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），
使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
4、向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
5、向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将
出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注
意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收
集管中。
7、向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），
12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复漂洗
一次。
8、将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂
洗液去除。
9、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓
冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
（二）琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA
吸取4μL所提质粒，加入2μLloadingbuffer混匀后点样至0.8%琼脂糖凝胶中，电
泳20min左右后拿出放入凝胶成像系统，根据图像判断所提质粒浓度及质量。
（三）质粒载体DNA酶切
1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中。
2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温5h。
3、吸出8μL酶切产物，加入2μLloadingbuffer混匀后点样琼脂糖凝胶电泳，鉴
定酶切是否正确，两个酶切位点之间片段大约150bp左右，理论上双酶切电泳应出
现两条带，一条较亮的长片段和一条很暗的小片段。而单酶切只出现一条带，即线
性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。
4、确认酶切正确后，在酶切产物中加入loadingbuffer终止反应，准备胶回收。
（四）载体片段的获得
1、取酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认酶切完全后，然后进行载体片段的回收。
2、制备胶回收的琼脂糖凝胶。
3、将双酶切样品加入点样空中，进行电泳分离。
4、将凝胶板染色后，在凝胶成像仪中切取DNA大片段。
5、柱平衡步骤：向吸附柱CB2中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，
倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重
量。
7、向胶块中加入等倍体积溶胶PC，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下
翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
8、将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管
中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
9、向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废
液，将吸附柱CB2放入收集管中。重复漂洗一次。
10、将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸
附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。
11、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μL洗脱缓冲
液EB，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液，此就为连接所用
载体Vector。
五、实验结果及分析
1.质粒提取检测结果
由此结果可知，质粒提取的质量比较好，且浓度也比较高。可以作为下一步酶切的模
板。
2.载体双酶切结果
由于未点样质粒对照，且单酶切条带离双酶切较远，不好比较，故此次结果不能充分
说明载体切开。但从图上来看，11,12,13,14泳道很可能是未切开的载体，而1,2,3,4,5,6,7,8
泳道的产物与其相比可判断为已切开的载体。此外，此图上未能看到两个酶切位点间的大
约150bp左右的小片段，可能是浓度太低亮度不够，也可能是由于片段太小已跑出凝胶。
所以，先将1-8泳道的酶切产物胶回收，拟与回收的目的基因连接转化，通过后来的菌落
PCR鉴定是否正确。
另外，此次试验酶切做了两次，第一次结果如下图：
很明显看出有三条带，同样，由于没有质粒对照，不好说明最上面是切开的还是未切
开的载体，但通过底下两条带可以推断出，此质粒可能有问题。其载体上两个酶切位点有
可能并非一个，除了我们预计的那两个，可能序列中还存在同样的酶切位点，所以导致酶
切产物出现多条带的现象。故更换实验材料重新提取质粒和做双酶切。
实验二、目的基因的获得及酶切处理
一、实验目的
1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
3、掌握PCR产物的回收及酶切过程
二、实验原理
聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技
术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操
作。
PCR进行的基本条件：
⑴DNA模板
⑵引物
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
⑷TaqDNA聚合酶
⑸反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性使模板DNA解离成单链；
⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩
增可达106倍。
三、实验仪器及试剂
（一）仪器
PremixEXTaqDNA聚合酶
10×反应缓冲液（含25mmolMgCl
2
）
引物F1:5'-CATGCCATGGGCGAGGGCAAAGCCCGCAC-3’；
R1:5'-CCGCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCATTGG-3’
NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)
胶回收试剂盒（天根生物科技）
DNA模板
（二）试剂
PCR扩增仪等
四、实验步骤
（一）PCR扩增
1、按下表加入试剂，并小心混匀。
2、设置PCR程序并运行：
（二）PCR产物鉴定
反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析。
（三）目的基因片段的回收
步骤同载体片段回收。
（四）目的基因片段的酶切
加样后混匀，置于37℃水浴中，保温7~12小时。然后每个管中加入Loadingbuffer
终止反应。
（五）目的基因片段酶切后回收
同载体片段回收的步骤进行。此为Insert，为连接做好准备。
五、实验结果及分析
1.目的基因的获得
目的基因为VP60，是兔出血热病毒外壳蛋白，目的片段大约1700bp左右，
点样所用的Marker为DL2000。从图上看出，PCR产物大小位于2000偏下一些，
大致与目的基因大小一致。可以说明目的基因获得正确。由于引物设计加了酶切
位点，所以该产物序列两端带有两个酶切位点，便于下一步酶切回收后与载体连
接转化。
实验三、质粒载体和外源DNA的连接及转化
一、实验目的
1、掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
2、掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、实验原理
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化
具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’-5’磷酸二酯键连接
起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末
端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。
在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对
于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段
为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹
配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目
的片段之间能够匹配。
进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可
通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以
减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片
段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去
磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。
在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为
1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，
如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分
子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物
浓度应保持在25--100ng/μL。连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进
行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提
高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。
所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源
DNA的生理状态。通常用0.1MCaCl
2
处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原
本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方
法有多种，如热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，
导致外源DNA进入细胞。
三、实验材料、仪器及仪器
（一）材料
大肠杆菌DH5α菌株
（二）仪器
1、冷冻离心机
2、恒温水浴
3、微量移液器
4、无菌操作台
5、电子天平
（三）试剂
1、目的DNA片段(NcoⅠ/XhoⅠ)
2、载体（pET-28aNcoⅠ/XhoⅠ）
3、T4DNA连接酶（Thermo）
4、ddH
2
O
5、0.1mol/LCaCl
2
6、LB液体培养基
7、LB固体培养基
8、卡那霉素（100毫克/毫升）
四、实验步骤
（一）连接
取一个200μL的PCR管依次加入下列试剂：
使反应体系充分混合，离心30s，37℃连接20,min。
（二）感受态细胞的制备(0.1MCaCl
2
方法)
1、取1.5ml摇好的菌液于1.5mL的EP管中，4℃4000rpm离心3min，
弃上清。
2、加250μL0.1MCaCl2（预冷）温和悬浮菌体，4℃8000rpm离心1min
弃上清。
3、加100μL0.1M的CaCl2（预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置
于4℃存放。12h内使用效果最佳。
（三）连接产物对大肠杆菌的转化
1、1、将连接产物全部加入100μL制备好的感受态细胞中。
2、冰上放置10min。
3、42℃热激90S。
4、冰浴3min。
5、加入800μLLB液体培养基，37℃培养复苏60min。
6、离心浓缩后，留下大约100μL悬起细胞，超净台中涂布于含有卡那霉
素的平板上。
7、37℃倒置培养16-20h。
五、实验结果及分析
本次转化结果不是很好，平板上过夜长的菌都比较小且很少，可能是连接效
果不好，也可能是转化所用感受态细胞活力不高。故将所有的单克隆都挑出，放
入LB培养基中扩大培养，注意做好标记。然后吸出少量菌液进行菌落PCR鉴
定，而后提取重组质粒进行酶切鉴定，通过鉴定结果判断单克隆是否正确。
实验四、重组质粒鉴定及转化
一、实验目的
掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速
鉴定克隆。
二、实验原理
在这个实验方法中，用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆；然后将
有扩增信号的菌落经培养后提取质粒，再进行酶切进一步鉴定；最终将确定好的
重组子转入表达菌株中。
三、实验材料、仪器及试剂
（一）材料
大肠杆菌菌株BL21（DE3）；BL21（DE3）plysiS
（二）仪器
1、电泳仪
2、1.5ml离心管
3、培养皿
4、PCR扩增仪
5、台式离心机
6、凝胶成像仪
（三）试剂
1、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）
2、2×MixTaqDNA聚合酶
3、TBE电泳缓冲液（5×）
4、引物F1:5'-CATGCCATGGGCGAGGGCAAAGCCCGCAC-3’；
R1:5'-CCGCTCGAGTCAGACATAAGAAAAGCCATTGG-3’
5、卡那霉素（100毫克/毫升）
6、NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)
四、实验步骤
（一）菌落PCR快速鉴定法
1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入1.5mLLB液体培养基中37℃摇约3h。
2、吸取1μL菌液作为模板加入20μLPCR体系中（剩余菌液继续摇）：
设置PCR程序：
3、运行PCR程序
4、反应结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析。
（二）重组质粒酶切鉴定
1、重组质粒提取
挑取菌落PCR鉴定的阳性克隆，进行培养后提重组质粒，重组质粒提取参
见前述质粒提取的方法和步骤。
2、重组质粒的酶切鉴定
按下表将各种试剂分别加入每个200μl的Eppendorf管中。
加样后混匀，置于37℃水浴中，保温5~6h。然后进行琼脂糖电泳分析。
（三）重组质粒的转化
用重组质粒转化表达菌BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS，感受态的
制备及转化参考实验三进行。BL21(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，具
有氯霉素抗性。pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于
大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌,，能够降低目的基因的背景表
达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合
酶)。BL21(DE3)是大肠杆菌表达菌株，用于高效表达克隆于含有噬菌体
T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，是以T7RNA聚合酶为表
达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的
表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色
体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。
五、实验结果及分析
1.菌落PCR鉴定
由上图可以看出，大部分单克隆菌是可以扩出目的基因条带的，说明连接转
化成功，故可将扩大培养菌液中菌落PCR鉴定正确的菌液保留提取质粒，不正
确的丢弃。
2.重组质粒酶切鉴定
重组质粒酶切鉴定，预计结果应是：双酶切切出两条带，分别是目的基因和
载体，单酶切只是线性化质粒，只有一条带。加上质粒对照进一步说明酶切结果
的可信度。上图结果说明，重组质粒正确，可硬用于下一步的转化表达菌株进行
IPTG诱导蛋白表达。
3.转化
此次转化结果较上次好一些，单克隆很多且菌落比较大。可以用于下一步蛋
白诱导。
实验五、目的蛋白的诱导及表达
一、实验目的
1.学习用诱导物诱导外源基因表达；
2.掌握SDS-PAGE原理和技术，
3.应用于基因工程产物的分析鉴定。
二、实验原理
SDS-PAGE（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophpresis）
是目前用于测定蛋白质分子量的一种最好方法。该技术在1967年由Shapiro等
建立，此方法用于多肽分子量的测定，变性蛋白的分离，和溶解在离子去污剂
中的膜蛋白和层析分离的蛋白和酶的纯化控制。
SDS是一种阴离子去污剂，作为蛋白的变性剂和助溶剂，它能断裂多肽分
子内和分子间的氢键，破坏蛋白的二级，三级结构，使的多肽链失去天然构型
折叠。强的还原剂例如巯基乙醇（β-mercaptoethanal）或者二硫苏糖醇
（dithiothretol,DTT）多肽链间和链内的二硫键断裂。当样品和凝胶中加入还原
剂和SDS后，分子解聚并结合SDS，形成蛋白质-SDS胶束，带有大量负电荷
的SDS掩盖了蛋白质本身所带电荷，这一胶束在水溶液中，短轴对不同蛋白亚
基均为，18AO；而长轴则与亚基分子量大小成正比。根据经验所得，当SDS的
浓度在8×10-4mol/L以上时，1g蛋白质几乎恒定的结合1.4g的SDS。当处理
好的样品进行SDS-PAGE时，不同亚基将根据所带负电荷和和凝胶介质的分子
筛效应而相互分离，其中浓缩胶和分离胶，PH值的不连续凝胶系统使的各亚基
得到更好的分离。
三、试剂与仪器
（一）试剂
1、标准分子量蛋白溶液
2、Tris-Gly电极缓冲液：Tris6g,Gly28.8g，SDS1g，ddH2O溶解后，
用HCL调PH至
8.3,水定容至1000mL。
3、30%(w/v)凝胶贮存液：Acr30g,Bis0.8g加蒸馏水溶解至100mL。过
滤，棕色
瓶4℃保存。
4、Tris-HCL分离胶缓冲液(3mol/LpH8.7)：Tris36.3g,1mol/LHCL48mL,
加ddH2O
至100mL。
5、Tris-HCL浓缩胶缓冲液(0.5mol/LpH6.7)：Tris5.98g,1mol/LHCL48
mL,加
ddH2O至100mL。
6、10%SDS：1gSDS加水10mL溶解。
7、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加水10mL溶解（现配）。
8、四甲基乙二胺（TEMED）4℃棕色瓶中贮存。
9、样品处理液：Tris-HCL浓缩胶缓冲液20mL,β-巯基乙醇10ml,SDS
2g，甘
油20mL，溴酚蓝0.1g，加ddH2O至100mL。
10、0.05%(W/V)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2500.5g异丙醇250
ml，冰乙酸
110ml，蒸馏水740mL。
11、脱色液：异丙醇100mL，冰乙酸100mL，蒸馏水800mL。
12、标准分子量蛋白溶液
13、卡那霉素（100毫克/毫升）
14、IPTG（1M，0.1M）
15、LB液体培养基
（二）仪器
1、稳压稳流电泳仪
2、垂直板电泳槽
3、烧杯（50mlx2）
4、脱色摇床
5、台式高速离心机
6、恒温摇床
7、无菌操作台（含酒精灯、）
四、实验步骤
（一）目的蛋白的诱导
1、分别挑取空载菌和重组菌菌落，接入5ml含Kan（50μg/ml）的LB培
养液，37℃振荡培养过夜，同时设置空菌对照，接入不含Kan的LB培养基作为
空白对照。
2、取5ml过夜培养物接入500ml含Kan（50μg/ml）的LB培养液，37℃
振荡培养2h左右，至对数中期（OD600=0.5~0.6）。
3、向诱导管中加入0.1和1M的IPTG，同时设置不加IPTG的阴性对照管，
25℃振荡培养过夜。
（二）SDS-PAGE检测目的基因的表达
1、将制胶装置固定在制胶架上。
2、按照下表配制分离胶。（注意TEMED和APS最后加，防止凝胶）
将分离胶注入玻璃夹层中。上部25%乙醇或蒸馏水封面，保持胶面水平，
待分离胶聚合
好，再配制浓缩胶。
3、配制浓缩胶（4%。15ml）
灌入浓缩胶，插入梳子。胶凝固后待用。点样前再拔掉梳子。
4、样品处理
收集过夜诱导的菌液，10000rpm离心1min收集菌体，而后倒掉上清，加
入200μL的蒸馏水混匀后，加入loadingbuffer，100℃水浴5分钟，然后插入
冰浴冷却后离（10000r/min.5min）,取上清备用。
5.加样
电泳槽中加入电极缓冲液，拔掉点样梳，用微量进样器点样，上样量40μL，
蛋白Marker
9μL。
点样顺序按照：①Marker、②DE3空菌+IPTG、③pET28a空载+IPTG、
④pET28a-IPTG、⑤重组质粒5DE3-IPTG、⑥5DE3+IPTG、⑦18DE3-IPTG、
⑧18DE3+IPTG、⑨19DE3-IPTG、⑩19DE3+IPTG。
6、电泳
接好电路，打开电源，在低电压100V下电泳，至样品在浓缩胶部分聚集成
线，改用电压140V电泳，待溴酚蓝前沿到达凝胶底部时停止电泳。
7、剥胶和染色
倒掉电极缓冲液，轻轻敲开玻璃板，取出凝胶并在角上做好记号（注意不
要污染了凝胶）；
用蒸馏水洗涤凝胶；然后将凝胶置于染色液中，振荡染色2小时。
8、脱色
取出凝胶，先用蒸馏水漂洗数次，然后置于脱色液中振荡脱色至背景干净，
条带清晰。
9、照相保存
五、实验结果及分析
目的蛋白大小为60KD左右，本次蛋白胶结果不好，可能由于上清较为粘稠
（尽管已经离心），但没有过柱子进一步纯化，导致上样样品较粘；且点样时存
在飘样情况，这对于胶图结果也有影响。空载泳道在目的蛋白区无明显条带，符
合预期结果，但其他泳道加IPTG诱导和未加IPTG诱导区分不是很明显，理论
上未加IPTG诱导应该无目的蛋白或含量极少，这有可能是由于点样时产生的飘
样，也可能表达的蛋白未经纯化浓缩，导致胶图上出现很多杂带。从上图来看，
66KD-45KD区域有蛋白条带，但量不是很大，也可以初步判断目的蛋白表达。
如果要进一步确认目的蛋白的表达及其表达量，则可以进行westernblot验证，
将蛋白胶转膜后采用目的蛋白的特异抗体与其杂交，只有目的蛋白部分能杂交上
带，照相后可以看出是否有目的蛋白以及它的含量。
致谢：感谢学院提供的实验平台，特别感谢张老师一周以来的实验讲授和指导，
从目的基因的获得到载体酶切验证再到蛋白表达，一个基本完整的实验流程走下
来收获很多，而且此次制蛋白胶也没有出现生化实验中多次反复胶未混匀不凝的
情况，说明多联系还是有用的；此外，对于一些实验突发状况，如载体出现问题，
老师为保证实验进度做处理方法：一边保存菌液培养，一边进行酶切和PCR验
证，而后综合两者，获得正确重组质粒。既保证了质量，又节省了时间，通过这
点也学到了一些处理方法。总之，通过本次大实验，在生化实验的基础上又新学
到了很多技能，而且对于以后的实验也是非常有帮助的，再次感谢老师！
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