免疫化学
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2023年2月27日发(作者：财务管理制度及流程)免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原
抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它
把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、
电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、
酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免
疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异
性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞
化学反应以及呈色反应；6.观察结果。
3、免疫组织化学染色
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检
免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧
光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、
定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的抗体有哪些？
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细
胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原
直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混
合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）
和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常
用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还
能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行
抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决
定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先
进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修
复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质
对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原
(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下
几个方面：
1.抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针
对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗
原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2.共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3.决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某
一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似
时的结合力小于吻合时的结合力。
多抗和单抗特性比较：
1.均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。
即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化
学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2.稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多
抗的稳定性则较好。
3.特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异
性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特
异性较差，较易引起交叉反应。
4.重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
5.沉淀反应。多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产
生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存：
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的
吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件
下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃
条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快
速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为
防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保
存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，
少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。