终点法
7的乘法口诀教学设计-吃饭歌儿歌
2023年2月22日发(作者：咖啡文化基本知识).
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生化试剂的基本知识
一、生化试剂的分类1
按照化学性质分类1
按照临床应用分类1
二、反应速度特性2
终点法试剂2
动力学法试剂2
三、显色原理3
NAD-NADH和NADP-NADPH系统3
p-NP和p-NA系统4
H2O2偶联的指示系统4
抗原抗体反应指示系统4
其它显色反应4
四、性能评价方法4
主要性能指标：4
性能评价方法5
一、生化试剂的分类
(一)按照化学性质分类
1.酶类：包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE等.
2.底物/代谢产物类：包括TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,CO2等.
3.无机离子类：包括Ca,P,Mg,Cl等.
4.特种蛋白类：包括apoAl,apoB,Lp,C3,C4,PFB,IgG,IgA,IgM等.
(二)按照临床应用分类
1.无机离子：包括Ca,P,Mg,Cl等.
2.肝功能：包括ALT,AST,r-GT,ALP,MSO,T-Bil,D-Bil,TBA,TP,Alb等.
3.肾功能：UA,UREA,Cr等.
4.心肌酶谱：CK,CK-MB,LDH,α-HBDH,AST,MSO.
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5.糖尿病：GLU等.
6.前列腺疾病：ACP,p-ACP等.
7.胰腺炎：α-AMY.
8.血脂：TC,TG,HDL-C,LDL-C,apoA1,apoB,Lp.
9.痛风：UA.
10.有机磷中毒：ChE.
11.免疫性疾病：C3,C4,PFB,IgG,IgA,IgM,Kappa链,Lambda链.
二、反应速度特性
按照反应速度,可以分为终点法试剂和动力学试剂.而动力学试剂又可再分为零级动力学
法和一级动力学法.
(一)终点法试剂
终点法,指经过一段时间的反应,反应进行到完全,使全部底物
转变成产物,称终点法,更确切地说应称平衡法,这是最理想的分析类型.如图〔1〕.
整个反应达到平衡,由于正向反应的平衡常数很大,可认为所有的被测定物已转变为产物,
反应液的吸光度不再增加,吸光度的增加程度与被测定物的浓度成正比.
终点法对反应条件小的改变不敏感,只要这种改变不影响在一定时
间内反应达到平衡即可,是最理想的反应模型.
图〔1〕
属于终点法的试剂主要有：
TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,Glu,TP,Alb,T-Bil,D-Bil,Cr〔氧化酶法〕,NH
4
+,CO2,Ca,P,Mg,Cl,
apoA1,apoB,Lp,C3,C4,PFB,IgG,IgA,IgM等.
(二)动力学法试剂
1.零级动力学法
零级动力学法,指反应过程中反应速度维持不变,达到最大,与底物浓度无关,因此,在整个
反应过程中,反应物可以匀速地生成某个产物,导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减
小或增加,减小或增加的速度〔△A/min〕与被测物的活性或浓度成正比,主要用于酶活性的测
定.如图〔2〕.
实际上,由于底物浓度不可能足够大,随着反应的进行,底物消耗到一定程度后,反应速度
不再维持不变,同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间.因此,零级动力学法是针对特
定时间而言的,各试剂商对这段时间有严格规定.
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图〔2〕
属于零级动力学法的试剂主要有：
ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE,TBA等.
2.一级动力学法
在一定的反应时间内,反应速度与底物浓度的一次方成正比,由于底物在不断的消耗,因
此整个反应的速度在不断的减少,表现为吸光度的增加〔或降低〕速度越来越小,这类反应达
到平衡的时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时
反应较复杂,杂反应较多,经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,必需在特定时间段内进行
监测,各试剂商对这段时间有严格规定.如图〔3〕.
在一固定时间间隔中,底物浓度的变化量正比于底物的初浓度,这是一级反应的同性.该
段时间内吸光度的增加或降低与被测物的浓度成正比.
图〔3〕
属于一级动力学法的试剂主要有：
Cr〔苦味酸法〕,UREA〔紫外监测法〕
三、显色原理
显色系统主要有以下几种：
➢NAD-NADH和NADP-NADPH系统
➢p-NP和p-NA系统
➢H2O2偶联的指示系统
➢抗原抗体反应指示系统
➢其它显色反应
(一)NAD-NADH和NADP-NADPH系统
NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰,而NAD和NADP在340nm无特征性吸收峰,
利用其偶联的脱氢酶反应,根据340nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性.
作为该指示系统常用的工具酶有LDH、MDH、GLDH和G6PDH
目前利用此指示系统进行测定的临床项目有：ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α-HBDH、
Glu、UREA、NH4+、CO2等.
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(二)p-NP和p-NA系统
p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度
或活性.
目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、ACP、r-GT、AMY等.
(三)H2O2偶联的指示系统
H2O2在过氧化物酶的作用下,可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素,导
致某一波长吸光度的增加,因此可用来测定物质的浓度或活性
用于此指示系统的单一色素原有TMB、ABTS等；成对色素原有酚和4AA、MBTH和DMA
等.
目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu、Cr、UA等.
(四)抗原抗体反应指示系统
特异性抗体与抗原在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物,形成一定
的浊度,导致特定波长透光率的改变.在抗体过剩的前提下,改变程度与抗原浓度成正比.
目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp、IgG、IgA、IgM、C3、
C4、CRP等.
(五)其它显色反应
蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,在一定浓度X围内颜
色反应强度与蛋白质的浓度成正比.用于TP的测定.
溴甲酚绿在非离子去污剂Brij－35的存在下,可与白蛋白形成紧密结合的绿色复
合物.用于Alb的测定.
重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素.用于总胆红素和直接胆红素的测定.
甲基麝香草酚兰在碱性条件下可与Ca、Mg形成有色络合物.用于Ca、Mg的测定.
四、性能评价方法
(一)主要性能指标：
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1.稳定性：指在规定条件下经过一段时间的保存,仍能达到相应的性能指标,如试剂空白吸
光度、线性X围、灵敏度等.
2.反应灵敏度：指单位浓度的测定物反应所产生的反应度,反应度越高,灵敏度越
大.
3.精密度：结果间相互符合的一致程度
4.准确度：与参考测定程序结果的一致性
5.线性X围：在规定的重复性和线性偏差下,测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值
之间的比例关系的X围.
6.基质效应：基质指的是样品中被分析物以外的组分.基质常常对分析物的分析过程有显
著的干扰,并影响分析结果的准确性.例如,溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响,
这些影响和干扰被称为基质效应〔matrixeffect〕.
7.抗干扰性：
8.其它：试剂/样本比例、反应时间、价格等.
(二)性能评价方法
1.稳定性：连续观测,每日试验；热加速试验.
2.反应灵敏度：直接计算单位浓度反应物的吸光度变化或变化率.
3.精密度：按照NCCLSEP5-A进行.
4.准确度：按照NCCLSEP9-A2进行.
5.线性X围：按照NCCLSEP6-A进行.
6.基质效应：通过回收试验确定
7.抗干扰性：按照NCCLSEP7-A进行.