ssr分子标记

ssr分子标记

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SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重

复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。研究表

明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。

微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复

单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭

示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们

发展起了SSR标记。

SSR标记又称为sequencetaggedmicrosatellitesite,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标

记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而

可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引

物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量

上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列

重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复

数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。?

与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多

态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；

(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前

该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，

22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼

序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发

费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应

用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共

同进行STMS引物的开发。

操作步骤

1、在25μl反应体系中，加入

模板DNA1μl（20ng）；

SSR引物1μl（0.15μM）

10×PCR缓冲液2.5μl

MgCl22μl(25mM)

dNTP2μl(0.2mM)

Tap酶1单位

加ddH2O至25μl

2、反应在PE9600热循环仪上进行。PCR反应先95℃变性4min,接着94℃45s、55℃30s

和72℃60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min。PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙

烯酰胺凝胶分离。点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压

1500V,时间约2～3h。DNA染色采用银染法。电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染

色、显影、固定等步骤染色。电泳和银染具体操作与AFLP相似。

3、数据分析：

用BIO-RAD公司的QuantityOne软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用

UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取

将来自每份参试资源20个随机选取单株100～150mg左右的叶样，在液氮中冻干研

磨成细粉。参照Dellaporta等和Doyla等创立的CTAB法，提取DNA。提取到的基因组总

DNA，采用1.4%琼脂胶电泳，溴化乙锭（EtBr）显影，以已知浓度的λDNA做对照，稀

释标定到25ng·µl-1，放－20℃冰箱备用。

1.2.2SSR反应条件

PCR反应总体积为10µl，反应体系中含1×PCRBuffer，2.5mmol·µl-1MgCl2，4种

dNTP各0.168mmol·µl-1，0.5UTaqDNApolymersae酶，PrimerF和PrimerR引物各0.4

µmol·µl-1，25ng模板DNA。反应在PTC-220型PCR扩增仪（MJResearch，Inc.）上进

行。反应程序为：盖温控制在105℃，94℃预变性3min，随后进行以下38个循环：94℃

变性30s，复性30s（温度依引物的退火温度而定），72℃延伸2min，最后72℃延伸5.5

min。

1.2.3产物检测

扩增产物加1/5体积的上样缓冲液（40%蔗糖，0.025%溴酚蓝），取3.5µl，利用6%非

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测[27]。

1.2.4数据分析

记载同一对SSR引物扩增条带（等位变异）在各参试资源中有或无。如果无，记为0；

如果有，则按其分子量从大到小的顺序，分别记录为1、2、3、……。此种转换方式是根据

SSR标记长于揭示等位基因的特点，配合相应统计软件对SSR原始数据格式特殊要求确

定的[28-30]。不同群体间和同一群体内某一位点的等位变异数和有效等位基因数[31]、

Shannon’s信息指数[32]统计计算，在POPGENE1.32软件包[30]中完成；资源群体遗传多

样性的差异显著性比较，在FSTAT2.9.3.2软件包[28]中完成；参试资源间Nei78遗传距离

计算及群体间遗传距离聚类图绘制，在POPGENE1.32软件包[30]和MEGA3.1软件包[33]

中完成；参试资源间欧氏距离计算，主成分分析（PCA）及三维作图，在NTSYSpc2.20d软

件包[29]中完成；相关系数经MicrosoftExcel计算获得。