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酶切位点保护碱基
口技教学-唯美四字词语
2023年2月18日发(作者：舒婷).
.
各种酶切位点的保护碱基
酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个
碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切
(CleavageClosetotheEndofDNAFragments
(oligonucleotides)
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的
短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头
上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则
通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
单位的寡核苷酸。取1µg
已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液
含70mMTris-HCl(pH7.6),10mMMgCl
2
,5mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要
求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现
发夹结构而降低。
酶寡核苷酸序列链长
切割率%
2hr20hr
AccIGGTCGACC
CGGTCGACCG
CCGGTCGACCGG
8
10
12
0
0
0
0
0
0
.
.
AflIIICACATGTG
CCACATGTGG
CCCACATGTGGG
8
10
12
0
>90
>90
0
>90
>90
AscIGGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
AvaICCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
8
10
12
50
>90
>90
>90
>90
>90
BamHICGGATCCG
CGGGATCCCG
CGCGGATCCGCG
8
10
12
10
>90
>90
25
>90
>90
BglIICAGATCTG
GAAGATCTTC
GGAAGATCTTCC
8
10
12
0
75
25
0
>90
>90
BssHIIGGCGCGCC
AGGCGCGCCT
TTGGCGCGCCAA
8
10
12
0
0
50
0
0
>90
BstEIIGGGT(A/T)ACCC9010
.
.
BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
22
24
27
0
25
25
0
50
>90
ClaICATCGATG
GATCGATC
CCATCGATGG
CCCATCGATGGG
8
8
10
12
0
0
>90
50
0
0
>90
50
EcoRIGGAATTCC
CGGAATTCCG
CCGGAATTCCGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HaeIIIGGGGCCCC
AGCGGCCGCT
TTGCGGCCGCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HindIIICAAGCTTG
CCAAGCTTGG
CCCAAGCTTGGG
8
10
12
0
0
10
0
0
75
KpnIGGGTACCC
GGGGTACCCC
CGGGGTACCCCG
8
10
12
0
>90
>90
0
>90
>90
MluIGACGCGTC800
.
.
CGACGCGTCG102550
NcoICCCATGGG
CATGCCATGGCATG
8
14
0
50
0
75
NdeICCATATGG
CCCATATGGG
CGCCATATGGCG
GGGTTTCATATGAAACCC
GGAATTCCATATGGAATTCC
GGGAATTCCATATGGAATTCCC
8
10
12
18
20
22
0
0
0
0
75
75
0
0
0
0
>90
>90
NheIGGCTAGCC
CGGCTAGCCG
CTAGCTAGCTAG
8
10
12
0
10
10
0
25
50
NotITTGCGGCCGCAA
ATTTGCGGCCGCTTTA
AAATATGCGGCCGCTATAAA
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
12
16
20
24
28
0
10
10
25
25
0
10
10
90
>90
NsiITGCATGCATGCA
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT
12
22
10
>90
>90
>90
PacITTAATTAA800
.
.
GTTAATTAAC
CCTTAATTAAGG
10
12
0
0
25
>90
PmeIGTTTAAAC
GGTTTAAACC
GGGTTTAAACCC
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG
8
10
12
24
0
0
0
75
0
25
50
>90
PstIGCTGCAGC
TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
8
14
22
24
26
0
10
>90
>90
0
0
10
>90
>90
0
PvuICCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
8
10
12
0
10
0
0
25
10
SacICGAGCTCG81010
SacIIGCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
8
12
0
50
0
>90
SalIGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA
28
30
32
0
10
10
0
50
75
.
.
ScaIGAGTACTC
AAAAGTACTTTT
8
12
10
75
25
75
SmaICCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
6
8
10
12
0
0
10
>90
10
10
50
>90
SpeIGACTAGTC
GGACTAGTCC
CGGACTAGTCCG
CTAGACTAGTCTAG
8
10
12
14
10
10
0
0
>90
>90
50
50
SphIGGCATGCC
CATGCATGCATG
ACATGCATGCATGT
8
12
14
0
0
10
0
25
50
StuIAAGGCCTT
GAAGGCCTTC
AAAAGGCCTTTT
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
XbaICTCTAGAG
GCTCTAGAGC
TGCTCTAGAGCA
CTAGTCTAGACTAG
8
10
12
14
0
>90
75
75
0
>90
>90
>90
.
.
XhoICCTCGAGG
CCCTCGAGGG
CCGCTCGAGCGG
8
10
12
0
10
10
0
25
75
XmaICCCCGGGG
CCCCCGGGGG
CCCCCCGGGGGG
TCCCCCCGGGGGGA
8
10
12
14
0
25
50
>90
0
75
>90
>90
2.双酶切的问题
参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年
开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完
全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamHI在37℃下有时表
现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
3.酶切底物DNA，切不开
1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产
物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通
常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况
.
.
可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，
由于一些空间因素或不可测因素造成的。
4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用buffer稀释，
因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会
出现底物DNA不能被切断的现象。
不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。
5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒DNA转入甲基
化酶欠损的宿主菌中，重新制备DNA，也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增，再做酶切。常
用的有XbaI容易受甲基化影响，通常选用GM33做宿主菌转化。
6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即
可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。
经酶切后，电泳无带或出现smear现象
DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA
降解。可以用DNA上的其他酶，也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此
情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。
5.甲基化酶
,,不属于CG甲基化，dam甲基化，也不属于dcm甲基化。
甲基化酶作用后，DNA不能被相应的酶切断。