2024年4月1日发(作者：)
植物性别鉴定的研究方法及银杏性别鉴定研究进展
修改编辑：广茂银杏苗木基地
摘要：在植物的生活史中，性别决定是一个重要的发育过程，其性别除了受外界环境因素的影响外，更重要的是受自身的遗传物质的影响。银杏，是世界上最古老的孑遗植物，具有“活化石”之称，本文主要阐述了植物性别决定的研究方法及银杏性别鉴定的研究进展。
关键词：银杏，性别鉴定，分子标记
在自然界中，高等植物多数为雌雄同株。在显花高等植物中，雌雄异株植物仅占5 %，常见的物种有：银杏科( Ginkgoaceae) 、罗汉松科( Podocarpaceae) 、红豆杉科(Taxaceae) 、杨柳科( Salicaceae) 、杜仲科( Eucommiaceae) 、柿树科( Ebenaceae) 以及杨梅(
My rica rubra
Sieb. et Zucc) 、番木瓜(
Carica papaya
L . )等。由于不同性别的器官和植株的经济价值不同，所以，研究植物的性别在理论与实践中都具有重要的意义，而性别的早期鉴定对于实际生产中性别的调控更具意义。
[1]1. 植物性别鉴定的研究方法
植物的性别差异源于有性生殖。大多数生物学家认为：有性生殖过程中发生了遗传物质的重组，促进了遗传变异，使生物的进化速度加快，保证了物种能适应复杂多变的环境，并不断地繁衍后代使之延续下去。在植物的进化过程中，有性生殖不但导致了性别的出现，同时也导致了真核生物两性异形的进化，使
植物的性别产生多种状态和类型[2]。对于植物而言，在性器官分化和发育成熟前，其雌雄株的形态差异往往不明显，所以不能作为植物性别早期鉴定的可靠依据。近年来发展了从细胞、生化和分子等不同水平上对雌雄异株植物的性别鉴定进行研究的方法。
1.1 形态特征鉴别
最初对果树性别的研究是从外部形态开始的。早在50 年代初波兰学者Bugala[3]就通过叶色确定了欧洲山杨的性别，后来有人对银杏、沙棘的形态方面进行了研究，证明银杏雌雄株幼苗期在植株、枝、叶、根等方面存在较大的差异[4-5]； 沙棘雌雄株在冬态、花期、生长期、植株形态、植株分布等方面存在较大差异[6]。徐东生[7]等应用多元统计分析中的判别分析方法判别猕猴桃雌雄株，用成年树建立了判别方程。王丙武等[8-9]在对杜仲(
Eucom mia
ulmoides
Oliv. ) 的顶芽进行研究时发现：从1993 年和1994 年的12 月到翌年4 月芽展开前对顶芽的测量说明，雄株顶芽的长度和最大直径都明显大于雌株的( P < 0. 01) ，证明可用芽的大小鉴别杜仲幼株的性别。谭冬梅[10]等用形态学方法对阿月浑子进行性别鉴定，得知无论是已知性别的成龄阿月浑子，还是未知性别的幼龄阿月浑子， 其雌、雄株叶形指数间均表现显著差异，即雌株的叶形指数( 宽/长) 比雄株的小。
1.2 生理生化鉴别
此方法主要是通过对植物代谢过程中某些酶的活性、次生代谢物质及内源激素含量水平
等的分析来鉴定植物性别。研究发现：千年桐的雌株叶部组织的还原能力大于雄株[11]；大麻雄株组织的呼吸速度大于其雌株,而过氧化氢酶的活性也比雌株高50 %～ 70 %[10]。J
aiswal[12]研究了番木瓜无性组织和生殖组织的酸性和碱性磷酸酶活力,发现其雄性中酶活力高于雌性。李国梁[13]等以高效液相色谱( HPLC) 法分析银杏(
Gi nk go bi2loba)
、杨梅( My
rica rubra) 等树种叶片中水溶性酚类物质时发现：雌株体内此类物质的含量均普遍高于雄株。
1.3 化学物质分析鉴别
植物不同树种或特殊个体(如雌雄个体) 所含的酚类组成及其含量具有规律性。李教社[14]等测定中国沙棘雌雄株间在黄酮含量上有差异。王丙武[8]等在对杜仲的研究中发现：在整个生长季节中雌株中的杜仲胶含量明显高于雄株。李国梁[13]等对杨梅雌雄株叶片的水提取液进行酚类总量的比色测定。结果表明，同一性别不同单株水溶性酚类含量亦有差异，但雌株的含量都比雄株的高，经t
测验这种差异是显著的。
另外,根据单宁含量也可鉴别植物性别。如将雌雄株叶片的提取液加入碱性醋酸铅，振荡后可看到雌雄叶液生成不同颜色的沉淀，沙棘的雄株生成浅灰色沉淀，而雌株则形成暗绿色沉淀；猕猴桃雄株形成乳白色沉淀，雌株为橙黄色沉淀。
1.4 同工酶差异鉴别
按照分子酶学“一个基因一个同工酶亚基”的理论，同工酶是分子水平的指标，是基因差异在表达水平的体现。因此，用同工酶可以为植物性别鉴定提供可靠的科学依据。过氧化物酶及多酚氧化酶普遍存在于高等植物中，并在植物的生长发育中起重要作用[15]。由于过氧化物酶是基因表达的产物，因此可以通过雌雄株间过氧化物酶同工酶的差异来鉴别雌雄株。
袁仕禄等[16]以华中五味子的叶、芽、茎为材料，进行POD 同工酶的分析，发现雌株功能叶片的POD 同工酶酶谱比雄株功能叶片的多3 条酶带，表明利用POD 同工酶分析鉴别华中五味子雌雄株是可行的。范双喜[17]等以5 年生石刁柏植株的幼嫩茎尖为材料，分析POD 同工酶酶谱差异，结果表明各处理间POD 同工酶酶谱雄株均较雌株少1 条带，说明石刁柏性别差异与POD 同工酶的数目有关，POD 同工酶酶谱的差异可以作为性别鉴定的指标。
1.5 染色体组型鉴别
染色体的形态特征是鉴别植物雌雄的重要方法之一，特别是对那些由性染色体决定性别的植物，由染色体组型来鉴别植物性别是可行的。根据这种特点，前人已在女娄菜、罗汉松、[19-20]青刚柳、花椒、三角杨及其它杨树树种细胞中发现了与性别相关的染色体[18]。Charles
等研究结果也表明，白麦瓶草的性染色体中Y染色体比X 染色体大数倍，X 与Y染色体的同源区域只占染色体长度的很少一部分，其余为假同源区 。
1.6 分子标记鉴别
植物雌雄株间的差异归根结底是DNA 分子之间的差异，利用分子生物学技术在DNA 分子水平上去研究雌雄株之间的差异性，从中找到鉴别雌雄株的特异性DNA 片段，对此进行测序，进而制备DNA 探针，使得人们在幼苗期就能够对植物雌雄株的性别进行鉴定。
Hormaza[21] 等将RAPD 技术应用于阿月浑子(
Pistacia vera) 的性别研究，经过研究找到1 个945bp 的RAPD 标记可作为雌性特征带。Trebitsh[22]等对黄瓜基因组中特异的Acc 合酶基因进行了研究。在此基础上，叶波平等[23]进一步分析，证明Acc 合酶基因是雌性系黄瓜所特有的。张立平等[24]通过RAPD 分析雌雄异株葡萄基因组DNA 的多态性,结果表明其碱基的排列顺序在雌雄株间有差异。
景建州[25]等 以谭清苏铁雌雄植株半年生羽叶为材料，提取其全基因组DNA，进行RAPD 单因子梯度实验和正交实验以优化扩增条件。应用160 个RAPD 随机引物检测基因组DNA，雌雄植株均扩增出1 450 多条带，其中引物S0465 扩增出与谭清苏铁雌株高度相关的RAPD 标记，其大小约为500 bp，该标记与雄株没有关联。
2. 银杏性别研究进展
银杏集药用、食用、材用和观赏于一身,具有特殊的经济价值和重要的科学研究价值。近几年来在我国发展迅速,种植规模日渐扩大,特别是在园林绿化工程中被广泛使用银杏雌雄株性别的早期鉴别不仅具有理论意义,而且具有重要的实用价值。
王涛[26]在银杏生产实践的基础上经过总结，分别从发芽和落叶的迟早、主干与主枝的夹角大小、同龄树冠形成时间的早晚、成龄树短枝的长短、叶片大小及缺刻深浅、花芽大小和花序形态等7 个方面进行了阐述：在苗木时期，雌株比雄株小，粗壮，横生枝多，叶小且裂刻少，秋季叶黄时期早。对于已结果的成龄大树，雄株树体高大，轮生枝明显，短枝较少，长枝发达，枝角较小，枝条垂直向上，大多数为塔形树冠；而雌株树冠为广卵形，短枝密集。雌花芽瘦而稍尖，雄花芽大而饱满，顶部稍平。雄花序为荑花序状，每1 朵雄花具1 个短柄，上有30 个以上花药柄，每柄上有1 对花药；每1 朵雌花有1 个珠柄，珠柄上端着生2 个胎座，每胎座着生1 个胚珠。
日本的阪本荣作[27]通过对银杏雌雄株叶柄的大量镜检，发现雌株叶柄下方维管束周围有油状空隙，而雄株叶柄下方维管束周围都没有。赵云云[28-29]等对银杏雌雄株氨基酸组分及含量进行了研究，发现银杏雌雄株的氨基酸平均含量有差异，雄株高于雌株，其中胱氨酸和酪氨酸含量较为突出。对银杏雌雄株的代谢差异检测发现雌雄株叶绿素和维生素C 的含量有差异。
王白坡[30]等分析了银杏雌雄株芽尖及叶片中内源激素含量，结果表明：在整个生长季节雌株芽尖中GA3 和ZT 的平均含量比雄株高20 %以上；而IAA 和ABA 相反，雄株高于雌株，证实了成年银杏不同性别间内源激素水平存在着一定差异。蔡汝[31]等作了银杏雌雄株叶片光合特性、蒸腾速率及产量的比较研究，结果表明：银杏雌雄株叶片的光合能力、蒸腾速率及构成叶片产量的部分因子存在明显差异；银杏雄株叶片光合速率高于雌株15.19 %～20.88 %，蒸腾速率高于雌株41.91 %～52.92 %，雄株的叶面积与鲜质量均高于雌株。
钟海文[32]等经过4 a 对2 株已知雌雄性别的银杏采用不同提取液提取、不同电泳方法和不同的显色方法进行鉴定，所得的过氧化物酶图谱基本相同，雌雄株间存在有规律性的差异，即雌株幼叶较雄株有较多的过氧化物酶区带，并利用这一区带对12 株已知性别的银杏植株进行了过氧化物同工酶的普查，显示出与定点观察同样的结果，在对9 株未知性别的银杏植株进行鉴定中，取得了与雌雄株一致的2 种类型的过氧化物同工酶的图谱，从而说明了银杏苗木之间过氧化物同工酶的差异，可能成为银杏性别鉴定的生理生化指标。四川林业科学研
究所种源组[33]分析了银杏中的过氧化物同工酶，结果表明：雄株酶谱带具有1 条活性强的和1 条活性弱的，而雌株具有3 条活性中等和2 条活性弱的，二者差异明显。岩崎文雄[34]对同样材料的研究结果发现，从原点起可看到以A , B , C , D 顺序表示的4酶带，雌株没有C 带，而雄株则有明显的C 带。何业华[35]等对银杏叶片进行了过氧化氢酶活性的测定，结果发现，银杏雄株叶片过氧化氢酶的活性显著高于雌株，并在实生苗中也证实了同样的现象。陈学森[36]分别从5 株实生雌株和5 株实生雄株上取叶片进行过氧化物酶及酯酶同工酶分析，结果表[37]明，雌株或雄株个体间酶带差异明显，但雌雄株找不到相互区别的特征酶带。
李鸿勋根据银杏叶部提取液加入裴林试剂水浴后产生的不同反应和沉淀来鉴定银杏雌雄株。结果表明，不论是性成熟的成年银杏，还是幼龄苗木，反应基本上一致，只是幼龄银杏水浴时间需加长，且所生成沉淀物较成年银杏多，但总的比较，不同雌雄株的反应差别还是明显的。张雪明[38]则采用溴麝香草酚兰(BTB) 和氯化三苯基四氮唑(TTC) 对银杏和杨梅叶片浸提液进行显色反应，结果发现：银杏和杨梅雌雄株对一定浓度的BTB 反应敏感，呈不同颜色反应，即雌株呈黄色，雄株呈兰绿色。
[39] Tanaka 等描述了叶片的染色体组成，并发现第1对大染色体的短臂上及第8 对染色体的长臂上有随体， 但没有报道性染色体存在的证据。Newcomer[40]通过观察发现大染色体存在二型性，推测这种二型染色体与银杏的性别决定有关。C. L. Lee(李正理) 及Pollock 的研究[41-43]结果表明，银杏雌雄株的染色体具有形态上的不同，雌株4 条染色体上有随体，而雄株只有3 条染色体上有随体。在雄株中的1 对最短的次端部着丝粒染色体中，只有其中的1 条染色体上出现随体，因此认为这1 对染色体即为性染色体，并提出银杏的性别决定机制属XY型，雌株为XX型，雄株为XY型。这与陈瑞阳[44]认为银杏的性别决定机制属WZ 型，雄株为ZZ 型，雌株为WZ 型的结论不尽一致。陈学森[45-47]等研究结果表明，银杏雌雄株染色体数目及核型一致，唯一区别是雌株4 条染色体上有随体，而雄株仅有3 条染色体上有随体， 与李正理的结论完全一致，但同时发现雌株第10 对亚中部着丝粒染色体的长臂上各有1 个随体，而雄株第10 对亚中部着丝粒染色体的长臂上仅有1 个随体，属异型染色体。因此，第10 对亚中部着丝粒染色体可能为性染色体，并给出了银杏雌雄株的核型。
谭晓风[48-49]等用12 种引物对15 个银杏品种进行了RAPD 分析，结果表明5 个品种之间在分子水平上存在很大差异，并且构建了银杏RAPD 分子遗传图谱。王晓梅[50]等应用Random
Amp lified Po lymo rph ic DNA (RA PD) 技术，筛选与银杏性别相关的分子标记，应用150
个10bp 随机单引物及110 对随机引物组合，检测了雌雄银杏的基因组DNA ，获得1 个与雄性相关的RA PD 标记。同时王晓梅[51]等利用AFL P 技术检测雌雄银杏基因组DNA 的多态性,筛选与银杏性别相关的分子标记，其中3 个引物组合各提供了1 个与雌性相关的分子标记,经South2ern 点杂交证实，有2 个分子标记为银杏雌性基因组所特有的。
3.结论
银杏性别鉴定中，形态鉴别法技术水平要求不高、经济节约、简单易行，但它的可靠度不高，需要在一定的年龄条件下才易实施，一般作为初步鉴定；生理生化鉴别法可以看出雌雄株在生理代谢方面的差异，但多表现在量的方面，在实际生产中很难应用，常常作为辅助鉴别的证据；化学物质鉴别法是一种简单而易行的鉴别方法，准确度有所提高，但这种方法
只在已性成熟的雌雄株间应用，在未性成熟的雌雄株间还没有固定的标准，此种方法的结果仅供参考；同工酶图谱法，有可靠的科学依据，但在早期鉴别时，可以选择的酶种类少，显色的酶带不多，有时不能区分雌雄；同时由于品种的差异和同工酶的组织器官的特异性，对鉴定结果也会有影响；染色体的形态特征是鉴别性别的重要的并最直接的遗传学证据，但银杏染色体的性别决定机制意见不一，有待于进一步研究证明。
4.展望
80 年代发展起来的分子标记技术是一组可以检测出大量DNA 位点差异性的分子生物学技术，它是在遗传信息的载体———DNA 水平上研究不同生物个体间的差异，不受环境条件、发育阶段、不同器官和组织的影响，而且基因组DNA 的变异非常丰富,分子标记的数目几乎是无限的，DNA 分子标记技术应用于雌雄异株植物的性别鉴定，提高了鉴定结果的准确性和可靠性。尤其是DNA 分子标记的方法不受发育时间及组织特异性的影响，用于雌雄异株植物的早期性别鉴定可以得到常用方法无法获得的可靠的鉴定信息。尽管DNA 分子标记方法在植物性别鉴定的研究中仍存在操作繁琐、雌雄株间特异性条带筛选困难、费用高等技术上的不足以及不便于在生产实践中推广等问题，但是,近年来随着DNA 分子标记和基因芯片等分子技术的不断发展，这些问题将会得到解决。相信随着雌雄异株植物性别决定机制的深入研究和分子生物学的飞速发展，应用DNA 分子标记进行雌雄异株植物的早期性别鉴定具有广阔的应用前景。
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