2024年3月31日发(作者：)
显微镜技术
第一节 光学显微镜技术概述
第二节 常规光学显微镜技术
一、普通光学显微镜
二、荧光显微镜
三、倒置显微镜
V型与U型倒置显微镜
四、相差显微镜
及相差装置进展：
第三节 特殊光学显微镜技术
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（一）显微镜的几何光学成像原理 （二）物镜（三）显微镜的照明聚光镜（四）视场光阑与孔径光阑（五）目镜（六）普通光学显微镜的操作要点：（一）荧光的基础知识（二）荧光显微镜（三）荧光显微镜的基本操作步骤（四）荧光显微镜的操作注意事项（五）荧光显微镜标本制作特点和观察要求（一）用途：（二）（三）倒置显微镜的光学与结构特点：（一）基本原理（二）配置（三）操作（四）相差图像特点
一、暗视野显微镜
（一）暗视野显微镜的基本原理：
（二）暗视野显微镜的组成
（三）图像特点：
（四）安装与调试
（五）应用
二、近场光学显微镜
（一）近场光学显微镜的基本原理
（二）近场光学显微镜的基本结构
（三）近场光学显微镜的应用
三、原子力显微镜
（一）原子力显微镜的基本原理
（二）原子力显微镜的组成
（三）原子力显微镜的工作模式
（四）原子力显微镜的应用
第四节 激光扫描共聚焦显微镜
一、激光扫描共聚焦显微镜的基本原理
二、激光扫描共聚焦显微镜的主要特点
三、激光扫描共聚焦显微镜的主要应用
四、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构
五、激光扫描共聚焦显微镜的主要操作步骤
六、双光子（多光子）激光共聚焦显微镜
第五节 显微镜摄影与显微摄影技术
一、显微摄影的基本原理
二、显微镜摄影中CCD的选择
三、显微摄影技术应用
四、CCD成像的操作步骤
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第六节 图像分析技术
一、图像分析处理的基本概念
（一）图像处理和计算机图形
（二）计算机图像分析处理的特点
（三）图像处理的算法形式
（四）图像的特征提取
二、图像分析系统的基本配置
（一）图像分析系统的构成
（二）图像分析系统的基本软件
三、图像分析的医学应用
（一）图像分析的图像来源
（二）图像分析的基本内容
（三）医学图像分析的常用分析软件
主要参考文献
《组织学与胚胎学实验技术》第二章 显微镜技术
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第一节 光学显微镜技术概述
显微镜是观察组织微细结构不可缺少的精密仪器。显微镜的种类很多、型号各异。除普通光学显微镜外，还有各种功能的显微镜，如荧光、倒置、相差、暗视野等各大类。
第二节 常规光学显微镜技术
一、普通光学显微镜
普通光学显微镜（light microscope）是最常用的观察组织切片的工具，机体各部分的微细结构必须用显微镜才能进行观察。显微镜包括光学、照明和机械三个系统，光学系统主要决定显微镜的质量好坏，它由目镜、物镜和聚光镜等组成。
（一）显微镜的几何光学成像原理
1. 有限远光学系统成像原理
图2-1 有限远光学系统成像原理图 尼康YS100教学显微镜
图2-1为有限远光学系统成像原理图及其相应产品，图中L1为物镜，L2为目镜，AB为标本，A′B′为物镜放大的实像，A〞B〞为眼睛看到的由目镜放大的虚像。A〞B〞离眼睛的距离为250mm至∞，该距离因人而异，通过微量调节物镜
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L1与标本AB的距离，以达到A〞B〞离眼睛最舒适的距离要求。
2. 无限远光学系统成像原理
图2-2 无限远光学系统成像原理图 尼康研究级80i万能显微镜
图2-2 无限远光学系统成像原理图及其相应产品，图中标本AB所发出光线经物镜L1后，不再会聚成像而以平行光束射向LT, A′B′为光线经LT后放大的实像，A〞B〞为眼睛看到的由目镜放大的虚像。
无限远光学系统可以得到很好的平坦图像，由此目镜视野得以放大，又由于平行光路中加入各类附件方便，功能延展性好，因此高档显微镜均采用此光学系统。
LT称为镜筒透镜，安装于显微镜双目观察镜筒光线入口处。
有限远光学系统物镜与无限远光学系统物镜不能互换。
无限远光学系统明场图像
（二）物镜
物镜（objective）是显微镜最重要的光学部件，它直接影响成像质量和各项
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光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的主要标准。来自标本的光线经物镜第一次放大与经目镜第二次放大后被眼睛接受，又称复式放大，在图像放大的传递中，第一次放大的作用是至关重要的，因此其成像疵病（像差）会被后级镜头传递与放大。
1. 物镜数值孔径：
数值孔径由下式表示：
N．A=n²Sin U
式中：n为物镜前片与标本之间的介质的折射率，U 为光线射入物镜的孔径角。
N．A越大，表征U越大，射进物镜的光通量越大，图像亮度也越大。
油浸物镜需要在物镜前片与标本之间滴香柏油，香柏油的折射率为1.515，从而提高了油浸物镜的N．A。
图2-3数值孔径示意图
2. 物镜的分辨率
分辨率（resolution）又称解像力，指在25cm明视距离处能分辨清楚的两点之间的最小距离。辨认两点之间的距离愈小，分辨本领愈高，人眼的分辨率约为0.2mm；显微镜物镜的分辨率R即是显微镜的分辨率，取决于光的波长，数值孔径以及介质的折射率，用公式表示为：
R=0.61λ/ N．A=0.61λ/
n²Sin U
物镜数值孔径越大，R降低，分辨距离缩小，分辨率好。两只同等倍率的物镜，N．A大者为佳。
3. 放大率
放大率（magnification）又称放大倍数，是指被检验标本经物镜放大，再经目镜或摄影目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小与原物体的比值，是物镜和目镜（或摄影目镜）放大倍数的乘积，可用公式表示为：
M：总放大倍数
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ml：物镜的放大倍数
M＝ml×m2（×m3）
m2：目镜或摄影目镜的放大倍率
m3：中间放大倍率
4. 物镜分类与物镜外壳标志示例：
根据物镜像差校正程度，物镜可分为：
（1） 消色差物镜：外壳上标有“Ach”字样或不加任何消像差标记，其像差校正程度，可满足显微镜的基本要求。
（2） 平场消色差物镜：外壳上标有“Plan”字样，在消色差物镜的基础上，增加了视野平坦度效果。
（3） 半复消色差物镜：是等级介于平场消色差与复消色差物镜之间的一种物镜，常被采用于高档显微镜上。
（4） 复消色差物镜：外壳上标有“APO”字样，是像差校正最为完善的物镜，应用于研究级显微镜，但其光学镜片材料中由于加入了多种稀有元素，导致镜片材料稳定性差，光学工艺复杂，镜头价格昂贵。
图2-4 物镜标记示例
（a） 消色差10³物镜，N．A 0.25，机械筒长160mm（有限远光学系统），盖玻片厚度无严格要求，0～0.17mm均可。
（b） 平场消色差40³物镜，N．A 0.65，适用于无限远光学系统，盖玻片厚度0.17mm。
（c） 复消色差100³物镜，N．A 1.40，油浸，无限远光学系统，盖玻片厚度0.17mm。
（三）显微镜的照明聚光镜
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1. 聚光镜
聚光镜（condenser）又称聚光器，其作用在于将光源发散的光，有效地聚集在标本上，以产生与物镜相适应的光束，造成一个明亮而又均匀的视场。它同时影响分辨率、对比度、景深和光亮度，而这些因素直接影响显微成像的质量，因此，聚光镜的作用非常重要。
2. 聚光镜照明光路
图2-5 照明光路图
聚光镜紧挨于标本下方，用于集中光源来的光线，使被观察的标本得到明亮、均匀的照明。由聚光镜射向标本光线的孔径角应与物镜孔径角U匹配（图2-5），以发挥物镜数值孔径与分辨率的作用。
3. 聚光镜品种
根据对聚光镜消除像差的程度，当前有阿贝聚光镜，消色差聚光镜及消色差/消球差聚光三个等级，后两者由于对像差作了很好处理，可以使照明光线更好会聚，从而提高了照明亮度，降低杂散光。
从结构外形上，聚光镜有非旋出式及旋出式两类，当旋出式聚光镜的上透镜旋出光路时，还可以满足低倍物镜的大视野照明要求。
此外，还有相衬聚光镜，暗视野聚光镜，DIC聚光镜，低倍聚光镜，长工作距聚光镜等特种聚光镜。
（四）视场光阑与孔径光阑
视场光阑（field diaphragm）和孔径光阑（aperture diaphragm）是显微镜上的
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两个重要装置，在镜检时，尤其在显微摄影中，它们对获得清晰的物像和高质量的显微照片发挥重要的作用。
1. 视场光阑
视场光阑一般都装在正置显微镜主机的底座上，作用主要是根据不同倍率的物镜，对视场照明范围进行调节，即控制照野，提高显微成像的清晰度。如果视场光阑过大，其照野超过视场直径，视场以外的光线经玻璃和标本的反射和不规则的散射，可造成影像反差减弱，降低影像的清晰度。反之，光阑收缩过小，其视野小于现场直径时，则视野四周被遮挡，不能观察和拍摄到全部物像。
视场光阑的调节方法:
（1）将视场光阑收缩到最小位置，在标本平面中心处看到一个呈正多边形的光斑，此为视场光阑的像。
（2）通过升降聚光镜完成视场光阑的对焦。
2. 孔径光阑
孔径光阑通常与聚光镜联成一体，位于聚光镜前焦面，当孔径光阑收小时（图2-5b），会遮挡住一部分光源来的光线，使照明孔径角U减小，对于4³，10³这类低倍物镜，小孔径照明对提高成像质量有利。这是因为低倍物镜本身的N．A低，若采用大孔径角照明光线，该光线会射在物镜镜筒内壁而产生大量杂散光，这些杂散光是所谓的非成像光线，进入目镜视野会降低图像衬度。
从光学理论分析，通过镜片边缘部分成像光线所产生的像差，远比中心区域的大，因而当物镜镜片边缘部分由于光线通过而参与成像时，图像像差会明显增加。
由上分析可知，当显微镜用高倍物镜观察时（40³，100³），孔径光阑孔应开大，反之则收小。孔径光阑孔的开大、收小应兼顾到图像的分辨率及像差影响。
设置显微镜孔径光阑的目的不是用于调节图像亮度，图像亮度应由照明灯源的电压来控制。
调节孔径光阑的三种方法：
（1）先将标本调准焦点后，从双目镜筒中抽出一个观察目镜，通过镜筒直接观看孔径光阑的像，对孔径光阑进行调节。这种方法直观，可直接看到孔径光阑的变化，但需注意抽出目镜时勿让灰尘落入镜筒内。
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（2）根据所用物镜的数值孔径，经计算后，将孔径光圈拨杆定在聚光镜数值孔径标记的相应位置。这种方法简便易行，对显微镜无危害。
（3）可以通过调焦目镜边观察影像，边调整孔径光阑。当影像的反差、景深和清晰度处于最佳状态时停止。这种方法操作简便，调节迅速，但是掌握这种方法并准确无误的调试，必须具备丰富的显微摄影实践经验。
（五）目镜
目镜（eye lens）因靠近观察者的眼睛，故因此得名。其安装在镜筒的上端，各种目镜的口径尺寸均相同，根据需要可以互换。目镜的作用是放大物镜所产生的初级影像，同时校正物镜成像中的像差、色差和照度，使初级影像形成可见的虚像。目镜只起放大镜的作用，并不增加显微镜的分辨率。有些目镜内装有测微尺或指针，用于显微镜测量或指示。
（六）普通光学显微镜的操作要点：
1. 显微镜上的各光学部件必须位于同一轴线上——光轴，才能充分发挥显微镜的光学性能，因此一旦发现显微镜的图像异常，例如视野里图像半边亮、半边暗等情况，应仔细检查显微镜的各部件是否安装到位。
2. 应熟练掌握孔径光阑与视场光阑的操作，孔径光阑孔大小的理想尺寸，应是使照明光线的孔径角为物镜理论孔径角的70%，拔下目镜，通过目镜筒可以看到孔径光阑孔在物镜后焦面的影像，光阑孔的大小应是物镜通光孔的70%。
3. 油浸物镜使用后，应及时去除物镜前片的香柏油渍，用擦镜纸蘸少量乙醚（70%）与乙醇（30%）的混合液来擦除。
4. 手指不要触及光学零件表面，用上法可以消除光学件表面的油污。
5. 显微镜保管不当会导致光学零件生霉，贮存环境应当是干燥、无高温、无腐蚀气体的地方。
二、荧光显微镜
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（一）荧光的基础知识
1.荧光
图2-6 荧光示意图
在光的照射下，具有荧光特性的物质的电子在吸收能量后，可由低能级电子层跃迁到高能级电子层。高能态的电子是不稳定的，它会在极短的时间内（10-8s），以辐射光的形式释放能量后，回到原来的能态。这时发出的光即为荧光（fluorescence），其波长比激发光的波长要长，原理如图2-6所示。利用物质对光吸收的高度选择性，可制成各种滤片，吸收一定波长范围的光或允许特定波长的光通过，用来激发不同的荧光素，产生不同颜色的荧光（表2-1）。
表2-1 荧光显微镜中常用光的波长与颜色的关系
光谱范围
紫外光区
可见光区
波长范围（nm） 光谱颜色
＜390
390～430
430～450
450～500
肉眼不可见
紫色
蓝色
青色
光谱范围
波长范围（nm）
500～570
570～600
600～630
630～670
光谱颜色
绿色
黄色
橙色
红色
2.荧光物质的特性和种类
荧光物质（fluorescent）又称荧光素（fluorescein或luciferin）、荧光色素或荧光探针，是指能够吸收光并能在较短时间内发射荧光，并且能作为燃料的化合
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物。荧光素通常具有芳香环结构。
（1）荧光物质的特性：
1）荧光效率 荧光色素能发出荧光，除具备合适的能量外，还需具备高荧光效率。荧光效率（fluorescence efficiency）即荧光量子产率，是指荧光物质吸收光后发射出的荧光光量子数与其吸收激发光量子数之比。
荧光量子产率数值反映了荧光物质将吸收的光能转化为荧光的效率，其数值越大，该物质的荧光越强，用于荧光分析的荧光物质荧光量子产率数值要求达到0.35以上。大部分物质没有发射荧光的性质，即使是荧光色素也不能将吸收的光全部转变为荧光，而是在发射荧光的同时，或多或少地以其他形式释放其所吸收的光能。因此，荧光量子产率数值在通常情况下总是小于1。
2）荧光强度 荧光强度（fluorescence intensity）是指荧光色素发射荧光的光量子数，它决定荧光色素检测的灵敏度。在一定范围内，激发光越强，荧光也越强，即荧光强度等于吸收光强度乘以荧光效率。所以，选用适当强度的光源作为激发光源和选用适合于被检荧光物质选择吸收的光谱滤片作为激发滤片，是提高荧光强度的根本方法。
3）荧光物质的吸收光谱和发射光谱 每种荧光物质的吸收光不仅有一定波长，而且在各波长的吸收量也不同，从而构成特殊的吸收光谱曲线；发射荧光的情况也类似。因此，荧光物质在一定条件下有一定的吸收光谱（激发光谱）和发射光谱（荧光光谱），如吖啶橙与不同细胞成分结合后，可产生橙、黄、红、绿等不同颜色的荧光。
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图2-7 斯托克位移
大多数荧光物质的激发光波长处于紫外或可见光区域，发射光波长处于可见光区域。荧光物质的发射波长总是大于激发光波长，两者之间的差值叫斯托克位移（Stocks shift）（图2-7）。在荧光显微镜的应用中，就是通过斯托克位移现象将激发光与发射光分离出来，只检测发射光，从而提高检测的灵敏度。
4）荧光稳定性 一般情况下，提高激发光强度可以提高荧光强度，但是激发光的强度不可能无限度提高。因为当激发光强度超过一定强度时，光吸收趋于饱和，而且将不可逆地破坏激发态分子，引起光漂白现象，严重影响检测。解决光漂白问题最直接的方法是降低光照强度和使用抗淬灭剂（anti-fade
reagent）。
5）荧光色素分子对环境的敏感性 荧光色素的荧光光谱和量子产率受环境影响，这也是众多荧光素具有探针作用的基础。其影响因素主要有：
① 荧光色素染液的pH值 荧光色素是否发射荧光以及辐射何种荧光与其在溶液中存在的状态具有重要关联。荧光色素均含有酸性或碱性助色团，溶液的酸碱性对它们的电离有影响，而且每种荧光都有其最适pH值。如1-萘酚-6-磺酸在pH6.4～7.4的溶液中发射蓝色荧光，但当pH＜6.4时则不发射荧光。
② 温度 荧光色素的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加，如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光量子产率增加3％。降至-80℃时，荧光量子产率接近100％；反之则减弱，甚至导致荧光淬灭。一般情况下，在20℃以下荧光量子产率随温度变化不明显，故在进行荧光染色过程中需控制温度。
③ 溶剂性质对荧光素的影响 同种荧光素在不同性质的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度均有明显差别，在荧光染色时常需要根据所需要的pH值缓冲液配制染液。
④ 荧光素浓度的影响 荧光素浓度对荧光强度的影响更明显。在稀溶液中，荧光强度与荧光素的浓度呈线性关系；浓度增加到一定程度后，荧光强度保持恒定，即便再增加浓度，荧光强度也不发生变化；若浓度继续增加，超过一定限度后，由于荧光物质分子间的相互作用引起自身荧光淬灭现象，使荧光强度随浓度的增加反而减弱。荧光素染色的应用浓度一般为10-3～10-5mol/L。
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总而言之，在进行荧光探针实验时，应注意合适的pH值、温度、溶剂和荧光素浓度等条件。另外，染色液最好新鲜配制，先配制高浓度储存液，临用前再稀释，避免因储存时间过长而失效。
6）荧光的淬灭及抗淬灭
① 荧光的淬灭 荧光淬灭（quench）是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激发态回到基态，以非辐射跃迁形式释放能量。外部因素包含多方面，主要有：（a）光照射是致荧光淬灭的最常见原因，荧光的产生需要光照射，但同时光照射也会促进激发态分子与其他分子相互作用而引起碰撞，使荧光淬灭；（b） 荧光物质的分子与外部分子（或离子）形成非荧光的化合物；（c） 共振能量转移；（d） 溶剂种类、pH值和温度等。
能够引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂，如卤素离子、重金属离子、具有氧化性的有机化合物以及氧分子等。
② 荧光的抗淬灭 标记样品的荧光淬灭是荧光操作时遇到的主要问题，由于光漂白作用，荧光素的荧光在连续观察过程中逐渐减弱或消失，因此需考虑使用抗荧光淬灭剂。常用的抗淬灭剂有p-苯二胺（para-phenylene diamine, PPD）、n-丙基没食子酸盐（n-propyl gallate, NPG）、1，4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷（1，4-diazobicyclo[2,2,2]-octane, DABCO）等。其中PPD是最有效的抗淬灭剂，但由于其对光和热有较强的敏感性，且具有毒性，因而限制了其在生物体内的应用。理想的抗淬灭剂混合液配方是：9份甘油、1份PBS和浓度在2～7mmol/L之间的PPD，最终pH为8.5～9.0。NPG无毒性，对光和热稳定，但抗荧光漂白的效果不如PPD，可用于体内研究。推荐NPG浓度为3～9mmol/L，用甘油配制效果较好。DABCO是一种稳定的非离子性抗淬灭剂，价格便宜且易使用，可用于体内研究。
（2）常用的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl
rhodamine isothiocyanate, TRITC）、四乙基罗丹明（tetraethyl rhodamine B200,
RB200）、德克萨斯红（Texas red）、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）、花青类（cyanine，如Cy3、Cy5）以及新型荧光燃料（如量子点）等。
1）异硫氰酸荧光素（FITC） FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质
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结合，是检测组织、细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光的影响。最大激发光波长为490nm；最大发射波长为525nm，呈现黄绿色荧光。
2）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定，生理条件下对pH值变化不明显，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫组织化学双重染色。
3）四乙基罗丹明（RB200） 可与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，可长期保存，广泛用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橙红色荧光。
4）花青类染料 常用的是Cy3、Cy5，能与细胞内蛋白质结合。此类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但其水溶性和对光稳定性较强，对pH等环境不敏感，荧光量子产率较高，常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿色光谱波长激发Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，故普通荧光显微镜观察时不推荐使用Cy5。
5）乙酸乙酯 本身不发荧光，但当其透过膜进入细胞质后，在酯酶作用下转变为具有荧光特性的乙酸乙酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈现绿色荧光。
6）Indo-1 是典型的双发射荧光探针，无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度呈线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度。因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发波长为330/346nm，最大发射光波长为405/
485nm，呈紫色（405nm）或青色（485nm）荧光。
7）量子点 量子点（quantum dot）是近年来研制的新型荧光染料，又称半导体纳米晶体（semiconductor nanocrystal），是由几百个或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长，可产生多种颜色，检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发
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光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时到多种颜色，因而可以同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，用于检测靶分子的分布和功能。
（二）荧光显微镜
荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜进行观察。这样在高对比度的背景下，即使荧光很微弱也易辨认，灵敏度高。所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。
Reichert在1911年设计了第一台荧光显微镜，之后，通过荧光染色方法和荧光装置的改进，特别是荧光抗体技术的建立和激发光源及滤色片系统的发展，使荧光显微镜技术在细胞学、微生物学、组织胚胎学、免疫学等多个学科得到了广泛的应用。荧光显微镜主要的应用包括：① 通过免疫荧光标记（单标、双标或三标）进行如细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布，两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位分析；② 细胞凋亡机制的研究；③ 荧光原位杂交（FISH）, 染色体基因定位；④ 细胞骨架装配：分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系；⑤ 细胞黏附行为；⑥ 通过离子探针可进行细胞内钙、镁、钠离子和pH值的测量。
1.荧光显微镜的分类
按高压光源的激发光路不同，分为落射（反射）荧光显微镜和透射荧光显微镜（图2-8）。新型落射光装置是来自光源的光照射到干涉分光滤镜后，波长短的紫外光和蓝紫光由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对光源呈45°倾斜时，光便垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本中的荧光物质收到激发，这时物镜直接起到聚光器的作用。同时，波长长的部分光（绿、黄、红等）对滤镜是可透的，不向物镜方向反射。因此，滤器起激发滤板的作用。由于标本的荧光处在可
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见光波长区，可透射滤镜到达目镜而被观察到。透镜荧光显微镜的激发光束来自载物台下方，经聚光器射向标本，使标本中的荧光物质受到激发。前者荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大倍数时比透射光源强。新研制的荧光显微镜多采用落射光装置，称之落射荧光显微镜。
图2-8 落射荧光显微镜和透射荧光显微镜激发光路比较图
（a）落射荧光显微镜 （b）透射荧光显微镜
按结构形式分为正置式荧光显微镜和倒置式荧光显微镜。正置式荧光显微镜可满足样品制成薄片后的观察方式，既可作为普通显微镜使用，也可做荧光观察。倒置荧光显微镜和正置荧光显微镜的区别在于物镜与照明系统颠倒，前者物镜在载物台之下，后者物镜在载物台之上。倒置荧光显微镜能观察各种活细胞，通常用于培养细胞的观察。
2.荧光显微镜的结构
荧光显微镜的主要由照明系统、滤光片系统、荧光光学部件等核心的三部分构成（图2-9）：
（1）照明系统：
荧光显微镜的照明光源传统常用的是汞灯和氙灯。
汞灯发射光谱的波长范围在200～650nm之间，且有多个高能量发射峰，足以激发目前常用的荧光物质，因此在荧光显微镜被普遍采用。汞灯启动时需要高
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压激发，启动后维持在一个较低的工作电压。常用的汞灯为103W，平均工作寿命为200h。超过200h后，其光效率会降低很多。在汞灯使用过程中需要注意：汞灯工作后至少需要开启15min以上，关闭后至少间隔15min以上，待汞灯冷却后才能再次开启。
图2-9 尼康正置荧光显微镜结构 图2-10 尼康新型荧光光源
现在市场上流行的荧光光源有着较长的工作寿命，如达2000h以上的金属卤化物灯，并且在开启和关闭时有自我保护装置，不存在常规汞灯使用时的时间间隔影响。这种荧光光源通过光纤与显微镜连接，且带有光闸。图2-9为尼康公司的长寿命荧光光源。
由于荧光光源比较强尤其是紫外区域的光线，故在开启时不要用眼睛直视光源。
（2）滤光片系统：
滤光片系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤色片（excitation
filter）、发射滤色片（barrier filter）和二向色镜（dichroic mirror）组成（图2-11）。
激发滤色片位于光源和显微镜之间的光路内，其作用是将照明灯发出的全波段光过滤成激发样品荧光所需波段的光。过滤后的光经二色镜反射至样品以激发其荧光。滤去其他波长的光有图2-11 滤光片结构
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四个作用：① 降低背景亮度；② 防止干扰荧光体被激发产生杂色荧光；③ 防止待观察样品被强光照射发生荧光淬灭；④ 防止待观察样品被强光照射发生分解。按照透过光的波长带宽，激发滤片可分为宽带型（wide band pass）和窄带型(narrow band pass)，前者透过光的带宽一般在30nm以上，后者在30nm以下。宽带型滤片的光通量大，激发能量强，但若样品中有激发波长在此范围内的多种荧光体，则均被激发而出现干扰荧光；窄带型则相反，激发能量较小，但对荧光体激发的选择性好。
二向色镜上镀有一层铝，铝对紫外光和可见光的蓝紫光吸收较少，反射率可达90％。它的作用是将激发光反射至样品上，并透过样品荧光探针发出的荧光（波长较激发光长），阻挡被玻片及样品反射的紫外或短波激发光进入目镜，保护眼睛和进一步降低背景亮度。
发射滤色片安装在物镜和目镜之间的光路中，它再次过滤已通过二向色镜的光，滤除干扰荧光或杂色荧光，使进入目镜的荧光色调更纯，以获得清楚的荧光影像和保护观察者的眼睛。发射滤色片按透光波长分为带通（band pass,BP）和长通（long pass, LP），前者只透过一个波段的光，后者可透过比标明波长更长的光。
荧光滤光片按激发滤色片和发射滤色片的光波段数还可分为单色、双色和三色，经这些滤光片过滤后的光分别为一个、两个和三个分立的波段，后二者分别用于含有两种或三种不同激发和发射波长荧光探针的样品，用以同时观察多种荧光（图2-12）。此外，针对各种高级荧光应用还通常配置各种荧光探针的专用滤光片，以期达到最佳的荧光效果。因此选择荧光显微镜的一个关键是正确选择荧光滤光片组。
（3）荧光光学部件
在荧光显微镜中使用的光学部件（物镜和目镜）采用了特殊的光学材料——石英，防止吸收紫外光线，同时为了消除色差的影响，光学部件都采用了多层透镜组合。
图2-12 三色荧光标记样品
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在荧光显微镜的物镜选择上，大多要采用专用的荧光物镜，即半复消色差物镜，对于一些高级荧光应用还需选择自身荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光的全复消色差物镜或者超级荧光物镜，。一般物镜的规格有4³，10³，20³，40³，60³或63³，100³。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜数值孔径的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为提高荧光图像的亮度，荧光显微镜需使用数值孔径大的物镜。同一倍数下，荧光显微镜物镜的数值孔径（N.A.）要高于常规明场显微镜的物镜，从而可以得到更高分辨率的成像。专为荧光显微镜设计制作的聚光镜分明视野聚光镜和暗视野聚光镜两种，在一般荧光显微镜上多采用明视野聚光镜，它具有聚光力强、使用方便等特点，特别适用于低、中倍放大的标本观察。暗视野聚光镜在荧光显微镜中的应用也日益广泛。
在制备荧光切片或者活细胞培养时，要选择使用无自发荧光的玻片和培养皿。同时，在使用高倍油镜时，要使用无自发荧光的浸油，以免因这些物体的自发荧光而影响最后的成像效果。
另外，对于荧光图像的采集，一般选择带制冷的单色CCD作为最佳选择。对此，在后面的章节中会叙述。
（三）荧光显微镜的基本操作步骤
1.打开荧光显微镜的照明光源（若为汞灯光源，需先打开汞灯控制器开关，再按下高压激发按钮；若为长寿命荧光光源，则只需打开控制器开关即可）；
2.把荧光显微镜物镜转换器上的荧光对中镜转到光路，通过调节汞灯前方的集光镜直至荧光对中镜上显示清晰的汞灯像，接着调节汞灯灯室上的方向调节旋钮直至汞灯像处于荧光对中镜的中心（一般此步操作在安装汞灯时进行一次调节后就可以了，若照明光源为长寿命荧光光源则不需此步骤）；
3.将标记了荧光探针的样品置于载物台上；
4.选择所需倍数的物镜，转动将其对准光路；
5.选择所需的荧光滤光片，转动将其对准光路；
6.打开荧光光路的光闸；
7.通过调整粗、微调旋钮，调整焦距。
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（四）荧光显微镜的操作注意事项
1.因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含有紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。
2.为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15 min后才能关闭。
3.汞灯熄灭后,待其完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸汽尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电极，更重要的是汞蒸气的溢出，会导致工作室的污染。故关闭汞灯之后不能马上再次打开，必须等待至少30 min。
4.高压汞灯工作室会散出大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
5.汞灯使用寿命约200～300 h，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300 h需更换新灯泡，否则亮度不够将影响观察。
（五）荧光显微镜标本制作特点和观察要求
1.载玻片 载玻片厚度应在0.8～1.2 mm之间，玻片太厚吸收光多，激发光难以在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
2.盖玻片 盖玻片厚度应约0.17 mm，光洁。为加强激发光也可用干涉盖玻片，这种特制盖玻片的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁），它可以使荧光顺利通过而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本中的荧光。
3.标本 组织切片或其他标本不能太厚，一般以5～20 m为宜，切片太厚可使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察的标本上部不能被激发。切片折叠或杂质过多均可影响荧光的观察。
4.封片剂 封片剂必须无自发荧光、无色透明。加上抗淬灭剂后再用指甲油（实际操作中指甲油封片效果很好，可做到薄而均匀）将盖玻片四周封固，既保持盖玻片不滑动，又能防止抗淬灭剂的蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可使用含30％甘油的PBS，还可用甘油与0.5 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0～9.5）
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等量混合液作封片剂。
5.镜头的清洁 在油镜使用完毕后，需用擦镜纸沾上无水乙醇或醇醚混合液（3：7）轻轻擦拭。
6.及时观察 标本染色后应及时观察，因时间过长荧光会逐渐减弱。若标本放在聚乙烯塑料袋中置于4℃保存，可延缓荧光减弱时间。
三、倒置显微镜
（一）用途：
倒置显微镜是为观察研究培养皿内的细胞、组织而设计制造的，其造型特点是标本置于物镜上方，照明光线自上朝下走向，物镜朝上；从人机关系学的观点出发，这样的造型设置有利于显微镜操作者在显微镜上长时间工作。
（二）V型与U型倒置显微镜
（a）
图2-13 倒置显微镜外形
（b）
图2-13（a）为“V”型造型的倒置显微镜，来自物镜成像光线只经过一次反射即到达目镜，光学系统简洁，像质好，是一种普及型产品。
图2-13（b）为“U”型造型的倒置显微镜，来自物镜的成像光线在显微镜基座底部像“U”字母样被折拐两次，光线先往下，后再折拐朝上。这样设置的好处是可以把物镜转换器的空间腾出来，便于添加各类功能附件，使产品具有很好延展性，是一种研究型显微镜。
（三）倒置显微镜的光学与结构特点：
1. 物镜：倒置显微镜的物镜应对培养皿玻壳厚度1.2 mm校正好像差，其物
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镜工作距离应大于玻壳厚度——长工作距，高级物镜还带有盖玻片校正环，适应不同培养皿玻壳厚度的像差校正。
2. 长工作距聚光镜：便于在显微镜载物台上有足够空间来安置培养皿与显微操作器。
3. 光学系统必须有相差功能，因为培养皿内的细胞多是不染色的。
4. 倒置显微镜上可汇集当代所有的显微术与最先进的仪器结构，如：荧光、相差、光导纤维照明、激光共聚焦、全自动控制、全内反射、恒温、热台、显微操作器，是生命科学研究中重要的实验室设备。
四、相差显微镜：
其另一个名称是“相衬显微镜”。相差显微镜是光学显微镜发展史上的一项创新技术。19世纪30年代荷兰物理学家Zernike首先设计，并于1942年制造了第1台相差显微镜。由于此项发明，Zernike于1953年获诺贝尔奖。
（一）基本原理
人的眼睛只能鉴别可见光波长（颜色）和振幅（强度）的变化，不能鉴别相位的变化。但是大多数活的生物样品高度透明，光波通过后振幅基本不变，却存在相位的变化，只是人的眼睛感觉不到。Zernike设计的相差显微镜，能将人眼看不见的样品本身的相位差（或光程差）转变为人眼能看见的振幅（光强度）变化。
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通过相差显微镜示意图2-14中可以看出，相差显微镜与一般显微镜结构上不同之处在于：相差显微镜的聚光镜具有环状光阑，物镜的后焦面处装有相位板。
相差显微镜的基本原理是：光线通过标本后，产生直射光线和衍射光线，直射光线和衍射光线干涉后将在像平面上成像。对于已染色的标本而言，由于标本各点吸收光不同，直射光线和衍射光线在像平面上干涉后，成为一个眼睛可以感知的亮度（振幅）有变化的像；如果光线通过的是活细胞，亮度或振幅的变化没有或很小，但直射光线超前于衍射光线1/4波长，二者干涉后人眼感觉不到。为了人眼能感知，相差显微镜进行了巧妙的光学设计：在物镜后焦面处设有环形的相位板，在聚光镜上设有环状光阑，并且设计环状光阑的像恰好在物镜后焦面上。由于相位板材料的光学特性和厚度可人为控制，可使通过它的直射光线超前或滞后衍射光线1/4波长。如果使用令直射光线超前1/4波长的相位板，直射光就较衍射光共超前1/2波长，直射光和衍射光干涉后，光波振幅减弱，造成像暗背景亮，称为正相差；反之，如果使用令直射光线滞后1/4波长的相差板，直射光将与衍射光同相位，直射光将与衍射光干涉后，光波振幅增强，造成像亮背景暗，称为负相差。因此，相差显微镜实现了从相位差（或光程差）向振幅差（光强度差）的转变。
（二）配置
相差显微镜是由图2-15的配件加至普通光学显微镜上而成.。
2
1
3
4
5
图2-15 相差聚光镜配置图
图2-15中，序号1是相差聚光镜，装置有环形光阑的环形光阑板4可以插
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入该聚光镜的槽口中，序号5是相差物镜，装有相位板，外壳上有“Ph”标记，不同倍率相差物镜有各自对应环形光阑配套，序号3为绿滤光片，用于提高图像衬度。序号2为对中望远镜，用于调校相衬装置。
（三）操作
1. 使用相差物镜与相差聚光镜对被检标本正常对焦观察。
2. 相差聚光镜上的孔径光阑开大，根据物镜倍率将对应的环形光阑插进该聚光镜槽口，推入光路。
3. 此时环形光阑的环孔成像于物镜相位板上，两者应共轴，相位板的环应完全覆盖环形光阑的影像。
用图2-15中序号2对中望远镜取代显微镜上的目镜，可以通过对中望远镜观察到如图2-16的共轭图。
环形光阑的中心位置通过本配置里提供的专用螺丝来调整，聚光镜的升降可以调整环形光阑在相位板上的影像尺寸。
图2-16 环形光阑与相位板共轭图
图2-6中（C）图表示环形光阑调整到位。
本步骤在相差观察的调整中，至关重要。
4. 拔下对中望远镜，换上普通目镜，就可通过目镜看到相差显微图像。
5. 相差装置均是针对绿光波长设计制造的，为了得到精确的光线光程差，建议把绿滤光片加到照明光路中，以达到理论上的最佳光线干涉效果。
6. 由于直射光线完全被相位板阻挡，直射光线强度被压抑，所以相差观察时，显微镜的照明光源的功率应增强，以提高相差图像亮度。
（四）相差图像特点及相差装置进展：
1. 由于相差图像的对比度提高，使原先在显微镜明视野中不易发现的细胞、组织得以观察，相差显微镜可用于观察活细胞、未染色的组织切片或缺少反差的染色标本。
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2. 由于光线干涉作用，相差图像细节周边会呈现光晕，所以虽然相差图像能提高图像对比度，分辨率却有所降低。
3. 相差显微镜并非对所有的标本图像都有提高对比度的效果，只有当标本组织产生的光程差满足光线干涉条件时，才会起到效果。
4. 调制相差显微镜与微分干涉相差显微镜是相差技术的进展，不但提高了图像对比度，消除了光晕，而且有三维图像立体感。其中微分干涉相差显微镜的图像还可呈现鲜艳色彩，将图像的黑白对比度检测改变到色彩对比度检测，大大提高了检测灵敏度。
传统相差图像
调制相差图像
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微分干涉相差图像
第三节 特殊光学显微镜技术
一、暗视野显微镜：
在普通光学显微镜上配置暗视野聚光镜就成为暗视野显微镜。
（一）暗视野显微镜的基本原理：
从图2-17暗视野显微镜示意图中可以看出，暗视野聚光镜遮拦掉了中间大部分照明光线，使照明光线形成了一个空心光锥，以倾斜的光线照射到标本上，因此标本的像是由标本上的质点散射光斑而形成的，标本上的无质点区由于不产生散射光线，因而造成黑暗的视野背景。
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图2-17 暗视野显微镜示意图
（二）暗视野显微镜的组成
暗视野聚光镜有油浸与干系两种，油浸暗视野聚光镜适用于20³～100³物镜，干系暗视野聚光镜适用于4³～ 40³物镜。
图2-18 暗视野聚光镜
使用油浸暗视野聚光镜时，需要在聚光镜与载玻片之间滴油。油浸暗视野聚光镜由于有极大的照明孔径角，其暗视野效果优于干系暗视野聚光镜。
（三）图像特点：
1. 暗视野显微镜营造了一个高反差背景，使标本中的质点在黑背景中得以显示，就好比天上的星星，必须在黑夜中才能看到，白天是看不到的。
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2. 由于暗视野聚光器的入射光斜射会聚在标本上，除散射光外，不直接进入物镜，所以由散射光激发光激发标本内荧光物质而发射的荧光在黑暗的视野背景下就可以呈现鲜明的荧光图像，不仅增加了荧光强度和物像清晰度与灵敏度，而且给人以舒适感。此外，暗视野聚光镜可以观察明视野难以分辨的细微荧光颗粒，在很大程度上增加了荧光显微镜的分辨率。
3. 小于物镜分辨率的质点，由于光线的绕射作用，每个小质点的像成为一个绕射斑，绕射斑的直径取决于照射光的波长，与质点本身的实际尺寸无关。在黑暗背景中可以发现这些绕射斑的存在与移动。因此，暗视野显微观察又称超显微观察。
暗场图像
（四）安装与调试
1. 将暗视野聚光镜安装至普通生物显微镜，取代原明视野聚光镜，操作者按正常程序对标本聚焦观察。
2. 若要获得好的暗视野图像效果，必须保证暗视野聚光镜与物镜严格同轴，可以通过暗视野聚光镜上的两调节螺钉达到此目的，两调节螺钉可以水平方向移动暗视野聚光镜，同时操作者通过显微镜目镜观察标本的显微图像，监视调整效果，目镜视野里的质点被照明区会随着暗视野聚光镜的水平调整而移动，直至视野中心区的质点发亮。
3. 暗视野聚光镜相对于标本的距离也有严格要求，可以通过显微镜的聚光镜升降支架来仔细调节，暗视野聚光镜上下调节时，操作者同样应在显微镜目镜视野里监视图像的亮暗变化，直至获得最佳图像。
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4. 需要强照明光源，以增加散射光斑强度。
5. 好的暗视野显微图像应该是背景黑、质点亮，视野中所有质点亮度均匀。
6. 有的物镜上常有光阑，光阑收小时，对创造黑背景有利，但会牺牲分辨率。
（五）应用：
由于暗视野显微镜增大了图像反差，所以适合观察单细胞，硅藻、细菌、细胞中的线状结构如鞭毛和纤维等，常用于微生物学和胶体化学研究。
二、近场光学显微镜
传统光学显微镜是显微镜家族中最年长的成员，它曾经是观测微小结构的唯一手段。传统的光学显微镜以光学透镜为主体，利用透镜将物体放大或成像。一般而言，单个透镜能将物体放大几十倍，在使用透镜组合时几乎可放大到近千倍。但是，光的衍射效应限制了光学显微镜进一步提高分辨率的可能性。
1982年，瑞士苏黎世IBM的g和等发明了扫描隧道显微镜（STM），极大提高了显微镜观测的灵敏度，这是显微镜发展史上的重要里程碑。以后陆续出现了新型扫描探针显微镜（SPM）。SPM不用光学透镜成像，而用探针的针尖在样品表面上方扫描获得样品表面的信息。不同类型的SPM主要在针尖的特性、针尖与样品之间的相互作用不同。以原子力显微镜（AFM）为代表的扫描力显微镜通过控制、检测针尖与样品间的相互作用力分析样品表面的性质。1984年瑞士苏黎世IBM的等人利用微孔径作为微探针，制成第一台近场光学显微镜(near-field optical microscopy，SNOM)，此后，各种各样的近场光学显微镜逐渐应用于各类表面超精细结构的观测。
（一）近场光学显微镜的基本原理
1. 近场与远场
当一个光源发射的光子或电子投射到目标物体后，经过反射，被某种探测器所俘获或接收（如观察者的眼睛或照相机）。由于反射粒子的轨迹和数量与物体的性质有关，粒子束就携带了关于物体特性的信息。在外部电磁场作用下，物体内部的电子电流或电荷密度的分布改变会引起电磁场的变化，使其能够从物体表
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面传播到外部空间。根据延续性原理，由极其靠近物体的空间场分布可以还原出物体表面的电荷和电流的分布。由于电荷或电流分布仅在极小的距离上变化（一般小于波长的距离），我们假设“极其靠近物体的空间场”也只在这样小的距离上变化。由于能够探测的最小距离总是要大于半个波长，所以目前所有的观察、分析即常规探测仪器如显微镜、望远镜以及其他仪器所能探测都是近场以外的区域，远离物体所做出的，它从近场一直延伸到无穷远。近场是从物体表面到几个纳米的距离，它包含两个分量：一个分量能够传播，另一个分量局限于表面而急剧衰减，称为倏逝波（evanescent wave），后者不仅与物体的表面，更与物体的材料紧密相关。
2. 近场探测原理
由于近场探测过程本身是一种干扰，探测器不能像通常一样放在远离物体的位置，而需要放在距离物体小于半波长的位置上。同时，探测器要在场传播之前将它俘获，所以探测器必须位于距离物体很近的位置（纳米水平），同时可以移动并不触碰样品。由于样品和探测器的距离极其小，目前还没有一种成像系统可用于如此小的距离，所以只能使用点状探测器。它能局域地接收光并将光转换成电流，或再发射到自由空间，通过合适的光导器件将信号传输到光电管或光电倍增管。为了产生图像结构，探测器必须像扫描电镜一样沿着物体表面扫描。
近场显微镜学的基本原理可以归纳为：一个能够产生倏逝波的高频物体；产生的倏逝场在小于一个波长的范围内呈现强烈的局域振荡；借助小的有限物体将倏逝场转成新的倏逝场和传播场；新的传播场能被远处的探测器所探测；⑤倏逝场——传播场的转换呈线性关系，即被探测的场正比于倏逝场中确定的矢量关系，如实再现倏逝场局部的剧烈振荡特性；⑥为产生二维图像，需用小的有限物体（如锥形光纤的针尖）在样品表面上方扫描。所以，近场显微镜是一系列转换的结果：基于物体本身的结构从入射光束到倏逝波的转换；由纳米收集器使倏逝场到传播场的转换。
（二）近场光学显微镜的基本结构
典型的近场光学显微镜由探针、信号传输和信号接收、信号反馈、扫描控制
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以及信号处理成像等单元组成。
图2-19所示SNOM系统的总体结构：A光学探针、B样品台、C探针扫描控制、D光输入系统和E信号采集处理系统五大部分。
在SNOM中的一个关键技术是光纤探针的制备，另一个就是针尖——样品（Tip-Sample）间控制（T-S间距）。T-S间距控制主要有三种方法：（1）等高模式（图2-20-a），针尖在固定水平上扫描，光信号强度的起伏反映表面形貌的起伏，适用于表面比较平整的样品。（2）等光强模式（图2-20-b），针尖按照设定的光强值随表面光强的变化起伏而波动，反馈信号表面光强的变化。由于近场范围内光强与距离的关系并不简单，所以反馈信号的起伏并不严格反映表面的形貌。（3）剪切力模式（图2-20-c），针尖与样品之间存在一些长程力（如黏滞力等），并存在共振频率f。当探针按等光强模式扫描时，沿水平方向以某种频率做微小振荡，针尖在这一方向的振动将受到阻碍并易被观测到，因此针尖可以按照固定的T-S间距上下起伏。
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图2-20 间距控制的三种方法（模式）
目前SNOM主要有两类，一类是孔径型扫描近场光学显微镜（Aperture-SNOM），它采用亚波长的小孔（或者针尖）作为微光源或微探测器，激发光与被探测的信号光是平行的；另一类是光子扫描隧道显微镜（photon
scanning tunneling microscopy, PSTM），激发光斜射入样品，通过全反射在样品表面形成倏逝场，置于倏逝场的光探针是一个散射中心，它将非辐射场通过转换成传输波而被探测。
由于SNOM中的光学探针的不同，决定了SNOM不同的配置方式。主要有以下几种：
（1）照射模式（图2-21-a），用介电镀膜探针作为微小光源，适用于透明样品，特别是生物荧光样品的探测。
（2）接受模式（图2-21-b），此结构与照射模式在结构上是对称的，探针作为微接收器，一般采用光纤微探针。
（3）反射模式（图2-21-c），镀膜光纤探针既是光源又是接收器，适用于不透明的样品。
（4）光子隧道模式（图2-21-d），入射光在样品内表面形成全反射，而在样品表面近场形成消逝场，光纤探针可将消逝场转化为传播场。在以上四种配置方式中，探针的质量决定了SNOM系统图像的分辨力和信噪比，因此光纤探针的制作是SNOM中的关键所在。一般用于SNOM中的探针要求小而“亮”。探针尖端孔径越小，SNOM的分辨力就越高；但是另一方面，信号光又必须足够强，才能有足够的信噪比。
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图2-21 SNOM的4种配置
（三）近场光学显微镜的应用
SN0M 由于具有独特的超衍射极限光学空间分辨能力，已经广泛地应用于许多研究领域，比如：单分子检测、发光高分子膜材料、液晶的微观光学性质、Langmuir-B1odgett膜的相界性质分析、染色体成像、蛋白质定位、探索细胞膜微结构、活体细胞成像、单个金属粒子电磁场分布、金属中等离子激元的传播、近场纳米刻录介质和3D可擦写媒体、近场平板印刷术、光学捕获和光学镊子、近场激光解吸附飞行时间质谱等。随着双探针等新技术的诞生，SN0M作为一种超衍射极限的光学工具正在和即将应用于更多的领域。
三、原子力显微镜
1985年Binnig与斯坦福大学的C. F. Quate和IBM苏黎士实验室的Christoph
Gerber合作推出了原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，简称AFM），这是一种不需要导电试样的扫描探针型显微镜。这种显微镜通过其粗细只有一个原子大小的探针在非常近的距离上探索物体表面的情况，便可以分辨出其他显微镜无法分辨的极小尺度上的表面细节与特征。这种显微镜能以极高的分辨率探测原子和分子的形状，确定物体的电、磁与机械特性，甚至能确定温度变化的情况。使用这种显微镜时无需使待测样品发生变化，也无需使待测样品受破坏性的高能辐射作用。
（一）原子力显微镜的基本原理
原子力显微镜是将探针装在弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变
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形。这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。
（二）原子力显微镜的组成
在原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）的系统中，可分成三个部分：力检测部分、位置检测部分、反馈系统 （见图2-22）。
图2-22 原子力显微镜（AFM）系统结构
1. 力检测部分
在原子力显微镜（AFM）的系统中，是使用微小悬臂（cantilever）检测原子与原子之间的范德华力。微小悬臂通常由一个100~500m长和大约500nm~5m厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖，用来检测样品——针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格，例如：长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状，而这些规格的选择是依照样品的特性，以及操作模式的不同，而选择不同类型的探针。
2. 位置检测部分
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在原子力显微镜（AFM）的系统中，当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得悬臂摆动，所以当激光照射在微悬臂的末端时，其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变，这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号，以供SPM控制器作信号处理。
聚焦到微悬臂上面的激光反射到激光位置检测器，通过对落在检测器四个象限的光强进行计算，可以得到由于表面形貌引起的微悬臂形变量大小，从而得到样品表面的不同信息（见图2-23）。
图2-23 激光位置监测器
3. 反馈系统
在原子力显微镜（AFM）的系统中，将信号经由激光检测器取入之后，在反馈系统中会将此信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖之间一定的作用力。
AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。压电陶瓷是一种性能奇特的材料，当在压电陶瓷对称的两个端面加上电压时，压电陶瓷会按特定的方向伸长或缩短。而伸长或缩短的尺寸与所加的电压的大小成线性关系。也就是说，可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X、Y、Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状，通过控制X、Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的；通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。
AFM便是结合以上三个部分来将样品的表面特性呈现出来的：在AFM的系统中，使用微小悬臂来感测针尖与样品之间的相互作用，该作用力会使微悬臂摆动，再利用激光将光照射在悬臂的末端，当摆动形成时，会使反射光的位置改变而造成偏移量，此时激光检测器会记录此偏移量，也会把此时的信号给反馈系统，以利于系统做适当的调整，最后再将样品的表面特性以影像的方式呈现出来。
（三）原子力显微镜的工作模式
AFM的工作模式是以针尖与样品之间作用力的形式来分类的。主要有以下三
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种操作模式：接触模式(contact mode)，非接触模式( non - contact mode)和敲击模式( tapping mode) 。
1. 接触模式
从概念上来理解，接触模式是AFM最直接的成像模式。 正如名字所描述的那样，AFM 在整个扫描成像过程之中，探针针尖始终与样品表面保持密切的接触，而相互作用力是排斥力。扫描时，悬臂施加在针尖上的力有可能破坏样品的表面结构，因此力的大小范围在10
- 10～10
- 6
N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力，便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。
2. 非接触模式
非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方5～10 nm 的距离处振荡。这时，样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制，通常为10
- 12
N ，样品不会被破坏，而且针尖也不会被污染，特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于，要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一个微小的毛细桥，将针尖与表面吸在一起，从而增加尖端对表面的压力。
3. 敲击模式
敲击模式介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡，针尖仅仅是周期性地短暂地接触/ 敲击样品表面。
这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时，AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描，装置随即将有关数据输入系统，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等，用于物体表面分析。同时，AFM 还可以完成力的测量工作，测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。
4.三种模式的比较
接触模式：
优点：扫描速度快，是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM，垂直方向上有明显变化的质硬样品，有时更适于用接触模式扫描成像。
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缺点：因为样品表面吸附液层的毛细作用使针尖与样品之间的粘着力很大，横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低，而且针尖刮擦样品会损坏软质样品（如生物样品，聚合体等）。
非接触模式：
优点：没有力作用于样品表面。
缺点：由于针尖与样品分离，横向分辨率低；为了避免接触吸附层而导致针尖胶粘，其扫描速度低于轻敲模式和接触模式AFM。通常仅用于非常怕水的样品，吸附液层必须薄，如果太厚，针尖会陷入液层，引起反馈不稳，刮擦样品。由于上述缺点，轻敲模式的使用受到限制。
轻敲模式：
优点：很好地消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力，图像分辨率高，适于观测软、易碎或胶粘性样品，不会损伤其表面。
缺点：比接触模式AFM 的扫描速度慢。
（四）原子力显微镜的应用
1.原子力显微镜对生物细胞表面形态观测
AFM能够在自然环境中直接观测生物样品的表面结构，避免了复杂的制备过程，以及电子束辐射所带来的样品损伤。AFM对生物医学样品制备要求包括：表面平整，高度起伏≤10～20m；表面有一定的硬度；基底面平滑，如用新鲜解离的云母片等；对于较大的颗粒、细胞，可用盖玻片、塑料片等；样品在基底表面要求相对均匀、分散等。
游离细胞样品制备过程大致步骤如下：首先提取细胞，2.5%戊二醛固定；同时制备新鲜解离的云母片，用双面胶固定于基底表面；然后将固定细胞滴加于云母表面，用氮气吹干并展平；最后用接触式或轻敲式进行细胞的表面形态观测。
活的培养细胞样品制备过程大致步骤如下：事先将培养皿或盖玻片用多聚赖氨酸进行处理，然后将细胞培养于培养皿或盖玻片上，检查前将培养皿或盖玻片制成小于1³1cm的小片；将指甲油滴加于AFM液体池底部，小片的无细胞面沾到指甲油上，而小片的有细胞面上滴加培养液；待指甲油干后，液体池中充入培养液，置于AFM的扫描器上，即可进行细胞表面形态的成像观测。AFM对活细胞的成
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像效果还很不理想，这主要是因为细胞膜表面比较柔软，与基底的固定较弱，探针的压力会使探针和细胞表面的接触面积显著增加，从而损伤细胞或造成细胞的漂移。0'Reily等利用AFM对一定数量的血红细胞表面形态及三维结构进行了观测和图像分析，从而得出细胞的厚度、宽度、表面积以及体积等量化数。对于活细胞，也可以在AFM的液体池中进行动态的观察。通过液体池的进液孔可随时注入不同的化合物溶液，改变活细胞的液体环境(如离子浓度、pH值、温度、湿度等)进行动态的观测。Jena等利用AFM对感染病毒后的细胞表面形态的改变、造骨细胞在加入底物后细胞形态和细胞弹性的变化、GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究。黄益民等利用AFM对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构研究，直接观察到了自由基的损伤，以及加女贞子保护后，对红细胞膜分子形貌学的影响。如果要对一些生物医学组织样品进行AFM表面形态成像观测，样品制备过程大致如下:选取组织表面较为平整的部位，剪成0.5 ³0.5 cm小块，观测面朝上，展平后贴在盖玻片上；滴加固定液于样品表面上，静置30min左右；用三蒸水冲洗去固定液中的溶质所形成的结晶；将盖玻片置于AFM的扫描器上，进行成像观测。一般来说，组织样品进行AFM的表面形态成像效果还比较满意。然而，AFM观察细胞表面形态结构分辨率还不够理想。这主要是由于细胞膜表面太软，探针的压力(无论是接触式，还是轻敲式)会使探针和样品表面的接触面积增大，从而使分辨率降低。AFM观察细胞表面形态结构的分辨率一般只能维持在nm到μm之间。如果样品制备不好，仪器状况调整不佳，操作人员技术不够熟练，那么AFM的分辨率还要低一些。
2.原子力显微镜对生物大分子的结构及其它性质的观测研究
AFM目前已广泛应用于蛋白质、核酸、DNA、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物在空气或溶液中的形态观测研究。张英鸽等用AFM对乙酰胆碱酯酶分子进行显微成像。林璋、白春礼等用AFM进行亚精胺诱导DNA凝聚有序性的研究。Rief等用AFM研究了不同大小的力对单个葡聚糖分子的影响，其中可逆的构象变化已经得到分子动力学计算的证实。胡钧等进行了人工操纵病毒的原子力显微镜研究，首次实现了复杂的体系— 一种线性噬菌体病毒的人工拉直与定向，并利用原子力显微镜对拉直前后的病毒进行了观察与测量。用AFM对生物大分子进行形态结构观察时，样品制备也很重要。蛋白质样品制备过程有两种方法，一
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种是蛋白质吸附固定法:首先将云母裁成l³1 cm的小片，用双面胶固定于AFM基底上，制备新鲜裂解的云母表面;将一定浓度的蛋白溶液滴加于云母表面，用氮气将其展平，吹干，蛋白便可吸附于云母表面;将液体池置于AFM的扫描器上，即可进行细胞表面形态的成像观测。该方法简便易行，可满足一般成像的要求。缺点是蛋白质固定不一定牢固，可能会出现脱落或拖动现象。另一种是蛋白质共价固定法:利用蛋白质分子上的氨基与疏基丙酸形成肽键连接的原理，进行蛋白质的固定。该方法固定比较牢固。缺点是方法复杂，费时费力。固定好的样品置于AFM的扫描器上，即可进行生物大分子表面形态结构的成像观测。如果是DNA类的样品，其制备过程大致如下:首先将根据实验目的，稀释原液;然后取适量稀释液滴加于新鲜裂解云母表面，氮气展平，吹干。固定好的样品置于AFM的扫描器上，即可进行生物大分子表面形态结构的成像观测。目前,AFM已广泛应用于对生理生化反应中蛋白质、核酸等生物大分子的形态或功能的动态研究。在此基础上还可以进行分子水平的热力学和动力学的研究。研究生物大分子的生理生化过程，是目前AFM在生命科学中应用最多的领域之一。配备了环境气氛箱的AFM可以在样品箱内进行气氛控制，样品调整以及样品观察。这样可以对生物大分子在各种不同的气氛(包括大气、低真空、各种气体置换、不同湿度和温度等条件)下的形态结构等进行研究。在这个领域里研究较多的主要有:蛋白的聚合、纤维组装的过程、胶原的超微结构和组装、蛋白三维晶体增长的研究、生物膜的结构和生物物理特性的变化,DNA的装配过程以及生物大分子之间的交互作用等。
3.原子力显微镜对生物分子之间力谱曲线的观测
用AFM对生物大分子进行形态结构观察的同时，还可对大分子的其它性质进行研究，如配体-受体之间作用力，抗原-抗体之间的作用力等。对生物分子表面的各种相互作用力进行测量是原子力显微镜的一个十分重要的功能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的，因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥，接近或者离开，化学键的形成或者断裂，生物分子立体构象的维持或者改变等等。在分子间作用力的支配下,还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象，以及离子通道的开放或关闭，受体与配体的结合或去结合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子间作用力的研究，在某种意义上说，就是对生命体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生
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命原理提供一个新的研究手段和工具，将两种分子分别固定于AFM的基底和探针尖端上。然后使带有一种分子的探针尖端在垂直方向上不断地接近和离开基底上的另一种分子。这时，两种分子间的相互作用力，就是二者间的相对距离的函数。这种力与距离间的函数关系曲线，称之为力谱曲线。对于作用力的测定，AFM对生物医学样品的制备，同样也有一定的要求或必须具备一定的特点。即需要将研究的两种分子分别固定于基底和探针尖端表面，而且还要求固定相对牢固。因此，样品制备的难度比其他的要大的多。以链霉素抗生物素对尖端进行功能化处理为例，其过程大致如下：将AFM悬臂浸入乙酮5 min，然后紫外线照射15 min；在37℃的湿润孵化器中，悬臂浸人一滴50KL生物素-BSA(牛血清白蛋)，孵育过夜;用PBS磷酸缓冲液洗三次，除去非结合蛋白;室温下悬臂浸入一滴501AL链霉素抗生物素中，孵育10 min，在碱性环境中，使BSA吸附于悬臂；悬臂使用前，用PBS再冲洗三次即可。总之，将特定的配体或者受体固定于悬臂探针表面，将与之对应的受体或者配体固定于基底表面，在悬臂探针表面与基底表面相接近或者分离的过程中，悬臂受到偏折，从而测得两个功能化表面之间的作用力，即配体-受体之间的作用力。通过对AFM探针进行功能化修饰，使针尖的表面带有特殊的官能团，用以识别存在于同一表面内的不同官能团，进行表面组分成像。它可以实现纳米范围内化学反应特性的研究。AFM还可以实现同时对生物分子表面结构、作用力等的动态实时观测。如生物大分子的弹力、细胞壁的膨胀压力以及各种微粒之间的各种相互作用力等。近年来，在AFM基础上各种扫描力显微术发展很快，主要有静电力、摩擦力、磁力、剪切力等显微术。力对样品的表面性质很敏感，根据检测力的变化可以获得样品表面丰富的信息。
近年来国内外研究表明，AFM在生医学研究中的应用具有很大潜力，它是在纳米分辨率下研究生命科学的一个有力工具。如果我们将细胞学、免疫学、生物化学、分子生物学、生物物理学等与原子力显微技术有机地结合起来，将AFM与其他仪器设备(如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、生物质谱、核磁共振、X射线晶体衍射等)有机地结合起来，相互补充、取长补短，一定会获得很好的研究结果。可以预见，在不久的将来，AFM作为一项独立的研究方法将日臻成熟，应用范围也将日渐扩大，并将对生命科学的发展做出重
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大的贡献。
第四节
激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高新科技显微镜产品，是目前应用于组织胚胎学的重要仪器之一，如图2-24所示。激光扫描共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统荧光显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以图2-24 激光扫描共聚焦显微镜
及通过针孔的选择和PMT（光电倍增管）的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，可实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点，在生物学研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的荧光显微镜所望尘莫及的。
1955年，Marvin Minsky基于在不染色的活体脑组织中观察神经网络的目的，建立了第一台共聚焦显微镜，并于1957年提出了共聚焦显微镜技术的基本原理，获得了美国专利。1971年美国人Davidovits和Egger发明了以激光为光源的共聚焦显微镜系统。1978年Shepepard等提出了载物台扫描装置。1980年Koestert等发明了镜扫描系统。从1983年到1986年，Aslund和Carlsson等发明了双镜
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扫描系统和共轭聚焦成像系统。1984年第一台LSCM实用商品问世。进入20世纪90年代后，LSCM系统中逐步引入了混合激光和紫外激光技术、计算机控制技术和光子计数技术，使成像的质量和灵敏度都提高了很多，对组织胚胎学研究的快速发展起到了很重要的推动作用。
一、激光扫描共聚焦显微镜的基本原理
普通荧光显微镜使用场光源，因光散射，在所观察的视野内，样品上的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射光也可通过物镜面成像，使图像的信噪比降低，图像的清晰度和分辨率较差。
激光共聚焦显微镜成像原理如图2-25所示，采用激光束做光源，激光束经照明针孔，经分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描。激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管探测收集后，将信号输送到计算机显示。在这一光路中，只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在检测针孔平面是离焦的，不能通过针孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
图2-25 共聚焦成像原理
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在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普通荧光显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有
激光共聚焦图像 普通显微镜图像
图2-26 激光共聚焦与普通光学显微镜成像比较
重要的影响。共聚焦显微镜在放大倍率上和普通光学显微镜相比没有明显优势，但是其对样品细节的成像非常细致清晰。图2-26为普通光学显微镜与共聚焦显微镜对同一样品分别进行图像采集的结果，显然共聚焦技术的应用使得图像更加清晰。
二、激光扫描共聚焦显微镜的主要特点
与传统荧光显微镜相比，激光扫描共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点，在对生物样品的观察中，激光扫描共聚焦显微镜有如下优越性：
1.共聚焦光学系统中，与焦点重合点以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在观察立体样品时，形成如同用焦点面对样品进行切片后形成的图像。对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。同时可进行三维测量：使用表面形状测定机能，可以轻松地做出样品表面三维图像。不仅如此，还可以进行多种解析如：表面粗糙度测定、面积、体积、表面积、圆形度、半径、绝对最大长度、周长、重心、断层图像、FFT变换、线幅测定等等。
2.可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图像、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。通常的荧光显微镜，由于偏离焦点部分的反射光会发生干扰，它与焦点成像部分发生重叠，从而造成图像对比度的降低。而相对于此，共聚焦
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光学系统中，焦点以外的杂散光以及物镜内部的杂散光几乎完全被去除掉，因而可以获得对比度非常高的图像。另外，由于光线2次通过物镜使得点像更加锐化，也提高了显微镜的分辨能力。
3.多维图像的获得：多通道扫描、时间序列扫描、旋转扫描、区域扫描、光谱扫描，同时方便进行图像处理。
4.对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。
5.光学放大功能：在分辨率允许的前提下，可对样品的某个区域进行无限光学放大，从而可以进行超过物镜放大倍率的成像。
三、激光扫描共聚焦显微镜的主要应用
1.定量荧光测量
激光共聚焦可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
2.定量共聚焦图像分析
借助于激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
3.三维重组分析生物结构
激光共聚焦显微镜可进行三维图像重组，将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。
4.动态荧光测定
Ca2+ 、pH 及其它细胞内离子测定，利用激光共聚焦显微镜能迅速对样品的
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点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
5.荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数
荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过激光共聚焦显微镜可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。
6.胞间通讯研究
动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。激光共聚焦显微镜可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+ , pH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
7.细胞膜流动性测定
激光共聚焦显微镜设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
8.笼锁—解笼锁测定
许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用激光共聚焦显微镜可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
9.粘附细胞分选
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激光共聚焦显微镜是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。
10.细胞激光显微外科及光陷阱技术
借助激光共聚焦显微镜可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过激光共聚焦光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
11.荧光共振能量转移（FRET）
通过FRET实验可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息,可进行：1）蛋白分子的共定位；2）蛋白分子聚合体；3）转录机制； 4）分子运动；
5）蛋白折叠。
12.生物芯片
生物芯片又被称为DNA微阵列，是以玻片、硅为载体，在单位面积上高密度的排列大量的生物材料，从而达到一次实验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都为生物芯片。所有微阵列上的生物材料发射的荧光须经过扫描装置来分析荧光强度和分布，用激光共聚焦显微镜能获取高质量的图像和数据。
四、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构
激光扫描共聚焦显微镜是由激光器、显微镜、扫描器、探测器以及控制扫描和显示输出的计算机几大部分组成。激光作为光源，通过扫描器内的二向色镜，进入显微镜的物镜。在激发样品后，发射光再次进入扫描器，最后信号被PMT（光电倍增管）检测。信号输出至计算机，显示应该图像。同时计算机也可以通过软件控制扫描器和显微镜，实现图像自动化采集。
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1.激光器
普通光学显微镜使用的一般是混合光，光谱范围宽，成像时样品上的每个光点均会因为色差影响以及由于入射光引起的散射和衍射最终影响成像质量。
激光由于其特殊的激发原理和结构，在激光共聚焦显微镜上有着单色性好、亮度高等很多的优势。
普通光源通常包括了多种颜色，从波长看，就是由多种不同波长的光混合而成。单色光就是指只含有一个波长的光，激光就是如此。激光的单色性好，不仅可以减少色差，而且在仪器设计上也可以简化发射光的单色系统，激发光与发射光易于分离，减少干扰。
激光还是相当好的平行光束，发散角度很小。这样就可以是能量在空间高度集中，同时由于激光发散小，所以聚焦以后能很好的形成小尺寸的光斑，这样就能准确的保证样品中特定点区域的荧光被激发。
激光还有一个显著的特征就是亮度高，强度大。激光的亮度比普通光源高出1000多倍，所以可以保证低功率下激发荧光。
同时，激光有着很好的相干性和偏振性。由于受激辐射的光子在频率和振动方向上相同，相位差恒定，偏振状态也一致。所以在相干性和偏振性上普通光源是无法与激光比拟的。
2.扫描探测器
主要由分光镜、滤光镜、扫描镜、针孔和探测器组成。
分光镜：按照波长的不同来改变光线的传播方向，使激发光能到达样品，而发射光能通过分光镜进入后续检测系统。
滤光镜：能够选择一定波长的发射光进行检测。
扫描镜：通常由X和Y方向的两块镜片组成，通过两块镜片的角度改变，可使激光光斑在样品上逐点移动，完成扫描程序。目前扫描镜有两种方式，第一为常规的检流计式的扫描器，扫描速度较慢，但是扫描分辨率高；第二为新型的共振式扫描器，扫描速度快，但是分辨率较低。
针孔：针孔技术是共聚焦显微镜的主要决定方面。从理论上讲，为了最大程度的消除杂散光，针孔的孔径应该越小越好。但是同时也要保证足够的荧光信号能通过针孔，故在实际应用时应该保证图像亮度的情况下使得针孔尽量小。
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探测器：目前共聚焦显微镜所使用的探测器均为光电倍增管（photo
multiplier tube, PMT），其灵敏度极高，响应速度极快。通过调整其电压（或称增益），可以在一定程度提高图像亮度。
3.荧光显微镜
激光共聚焦显微镜中所用的荧光显微镜与常规的荧光显微镜大体相同。同时也有一些特殊的地方，比如，必须配备与共聚焦连接的接口，配备Z轴步进马达以完成三维立体成像，配备光路转换系统方便切换荧光显微镜观察和共聚焦观察方式，并且所用的物镜最佳为复消色差物镜，一般为最高等级的全自动荧光显微镜。
4.计算机系统
计算机控制整个激光共聚焦系统和显微镜电动系统，一切机械操作均可通过安装于计算机上的软件系统远程操控。
五、激光扫描共聚焦显微镜的主要操作步骤
激光扫描共聚焦显微镜的载物台可以放置载玻片、培养皿、多孔板等多种器皿。但如果要在激光扫描共聚焦显微镜下得到最佳的成像效果，载玻片以及培养皿和多孔板底部应该为玻璃的，且要厚薄均匀。
根据具体实验要求选择好制样器皿做好样品后，按照以下步骤进行操作观察：
1.开启全自动荧光显微镜的电源及其光源；
2.开启激光光源；
3.开启激光共聚焦显微镜的控制单元；
4.将样品置于载物台上，并在常规荧光观察模式下找到所要观察的目标；
5.将光路切换至共聚焦观察方式；
6.开启计算机工作站，并打开共聚焦控制软件；
7.选择荧光探针相应的激光谱线；
8.选择实验相应的扫描方式
目前常规共聚焦显微镜的扫描方式包括：① XY或XZ二维图像扫描；② XYZ三维立体图像扫描；③ 时间序列扫描；④ 多波长扫描；⑤ 多点扫描等。具有光谱功能的共聚焦显微镜还可进行全光谱扫描。对于一些具有超高速扫描功能的
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