近场光学显微镜
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2023年3月19日发(作者：测试类小游戏大全)光学显微镜的发展历史、现状与趋势
杨拓拓
(苏州大学现代光学技术研究所，江苏苏州215000)
1基本原理
1.1显微镜成像原理及视角放大率
显微镜由物镜和目镜组成。物体AB在物镜前焦面稍前处，经物镜成放大、倒立的实像
A'B'，它位于目镜前焦面或稍后处，经目镜成放大的虚像，该像位于无穷远或明视距离处。
图1-1显微镜系统光路图
牛顿放大率公式：
ffxx''
'x
是像点到像方焦点的距离，
x
是物点到物方焦点的距离。
根据牛顿放大率公式可得物镜的垂轴放大率为
'
1
'
1
'
1
1
--
ff
x
目镜的视觉放大率为：
'
2
2
250
f
组合系统的放大率为
'
2
'
1
21
250
ff
显微镜系统的像方焦距
/'
2
'
1
'fff'
250
f
显微镜系统成倒像轴向放大率
'
2
'
1
'
2
'
1
/ffxx
'
1
f
若物点A沿光轴移动很小的距离，则通过显微镜系统的像点
'
2
A
将移动很大的距离，且移动
方向相同。
显微系统的角放大率
'
2
'
1
'
2
'
1
/xxff
即入射于物镜为大孔径光束，而由目镜射出为小孔径光束。
1.2显微镜的孔径光阑
单组低倍显微物镜，镜框是孔径光阑。
复杂物镜一般以最后一组透镜的镜框作为孔径光阑。
对于测量显微镜，孔阑在物镜的象方焦面上，构成物方远心光路。
1.3显微镜的视场光阑和视场
在显微物镜的象平面上设置了视场光阑来限制视场。由于显微物镜的视场很小，而且要
求象面上有均匀的照度，故不设渐晕光阑。
显微镜是小视场大孔径成像，为获得大孔径并保证轴上点成像质量，显微镜线视场不超
过物镜的1/20,线视场要求：
1
'
1
2020
2
f
y
1.4显微镜的分辨率和有效放大率
1.4.1光学仪器分辨率
瑞利判据：两个相邻的“点”光源所成的像是两个衍射斑，若两个等光强的非相干点像
之间的间隔等于艾里圆的半径，即一个像斑的中心恰好落在另一个像斑的第一暗环处，则这
两个点就是可分辨的点。当物面在无穷远时，以两点对光学系统的张角可表示两分辨点的距
离，其值为：
D/22.1
1.4.2显微镜的分辨率
分辨率是指在物体表面能够分解的最小间隔，两个发光点的分辨率为：
NAU
61.0
sinn2
22.1
数值孔径（NA）越大，分辨率越高。
1.5显微镜的照明系统
1.5.1临界照明
聚光镜应有与显微物镜相同或稍大的NA，聚光镜前放置的可变光阑为聚光镜的孔阑改
变孔阑大小，可改变进入物镜光束的孔径角，使之与物镜的NA相适应。
图2-1临界照明光路图
特点：光源经过聚光镜所成之像与物平面重合，相当于物平面上置光源。
缺点：光源表面亮度不均匀或明显表现出灯丝的结构，影响显微镜的观察效果。
1.5.2科勒照明
光源经聚光镜前组成像在照明系统的视场光阑上，聚光镜前组经过聚光镜后组成像于标
本处，同时也把照明系统市场光阑成像在无限远处使之与远心物镜的入射光瞳重合。
图2-2科勒照明光路图
特点：把光源像成在物镜入瞳面上。
优点：可消除临界照明物平面上光照度不均匀的特点。
1.6显微镜的工作距离
工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数
值孔径成反比。一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。
图2-3显微镜工作距离示意图
2发明发现
公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像，
这为镜头设计奠定了基础。1625年,斯泰卢蒂(FraneeseosteUuti)用,倍和10倍的放大镜(即
单式显微镜)详细描绘出了蜜蜂各部分的图形,由意大利拾荆学院(AcademyofLynxEye)出版
图,这是有关显微镜研究的第一部著作。
第一架显微镜是荷兰眼镜工匠詹森父子在1590年前后制成的，但是并没有发
现显微镜的真正价值。由于初期的复式显微镜有严重的缺陷,荷兰的列文虎克
(AntonyvanLeeuwenhoek,1632一1723)将其毕生精力放在发展单式显微镜上,并将它用于生
物观察。这个传奇式人物终于成了显微镜学家和微生物学的开拓者。
3发展阶段
英国科学家胡克自制显微镜，观察细小物体，1665年出版的《显微图谱》引入“细胞”
概念；1835年，英国科学家提出“爱里斑”的概念。由于光的衍射，即使一
个无限小的发光点在通过透镜成像时都会形成一个弥散的图案，即爱里斑；1873年，阿贝
和亥姆霍兹各自独立发现正弦条件；1873年，阿贝从他的成像理论推导出关于显微镜分辨
距离的公式，首先引用“数值孔径”；1878年，阿贝设计制成油浸显微镜，显微镜的分辨
本领已达到其理论极限（0.2μm）。
20世纪的前半个世纪里,光学显微镜有如下两个方面的发展，第一,为了观察生物标本
的不同结构,提供多方面信息而设计成(或改良)一些特种显微镜；第二,仅为工作上的方便而
设计成的一些特种显微镜。
3.1暗场显微镜
暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进
入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是
亮的。利用这种显微镜能见到小至4nm~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
图3-1暗视野照明方式
韦纳姆()于1853年制成了简单的暗场聚光器,西登托普夫和齐格蒙第于
1903年采用了从单向侧面照明的暗场观察方法。暗场显微镜的进一步发展是沿着改进照明
器的方向前进的。1907年,西登托普夫制成一次反射抛物面型聚光器.他于1908年又为蔡司
厂设计出心形面聚光器,同年蔡司厂还制成同心球面聚光镜,这些都是暗场显微镜中优良的
聚光镜。
3.2紫外显微镜
使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特
的效果。生物细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫
外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜研究单个细胞的组成与变化情况。
1904年科勒制成紫外显微镜，它的分辨本领虽有所提高，但不能达到0.1um.而且技术
复杂，价格昂贵。1941年布伦伯格第一次描述了“紫外彩色转移显微术”，可用紫外显微
镜制成无色透明标本的彩色图像。
3.3偏光显微镜
偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成
两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。它的特点是光源前有偏
振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器
垂直的起偏器）。
图3-2偏光显微镜结构
1669年，丹麦的巴托林(linus)发现冰洲石的双折射现象。1667年，惠更斯用
光的波动理论来解释此现象。1810年，马吕斯发现反射光的偏振现象。1821年，费涅耳
(l)用光是横波的理论来阐明“偏振光的干涉。1828年，英国人尼科耳用方解石
制成尼科耳棱镜，成为最重要的偏光元件之一。1834年，薛瓦利埃制成的消色差显微镜中
已附有偏光元件。1865年，英人柯林斯根据哈利博士的设计制成哈利型显微镜，其中附有
尼科耳棱镜，可作为偏光显微镜使用。1928年，兰德发明了偏振片后，现今绝大多数的偏
光显微镜中已用偏振片代替尼科耳棱镜了。
3.4荧光显微镜
荧光显微镜(fluorescencemicroscopy)是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物
质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内
的分布。
3.4.1透射式荧光显微镜
主要部件：汞灯光源、激发滤色镜、暗场聚光镜、吸收滤色镜
图3-3透射式荧光显微镜实物图
图3-3透射式荧光显微镜原理图
3.4.2落射式荧光显微镜
主要部件：汞灯光源、激发滤色镜、分色镜、吸收滤色镜
图3-5落射式荧光显微镜实物图
图3-6落射式荧光显微镜原理图
1578年，西班牙的内科医生和植物学家莫纳德斯(es)第一次记录了荧光现象。
1852年,斯托克斯(,1819一1903)在考察奎宁和叶绿素的荧光时,发现荧光的波
长大于激发光的波长(斯托克斯定则)。荧光(fluoroscence)这一术语也是他提出的。1908
年，试制成功第一台荧光显微镜。1914年，有人用喳琳作染料处理纤毛虫以增加其荧光,开
辟了荧光染色的道路。由此开辟了荧光显微术的广阔道路(如荧光免疫技术)。1938年,用含
紫外光特别丰富的超高压汞灯为光源,为组织学、细胞学和微生物学等领域中的荧光染色方
法奠定了基础。
3.5相衬显微镜
相衬显微镜是利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅
差。用于观察活细胞和未染色的标本，光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人
眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅不发生变化，人眼看不到。相衬
显微镜可以将光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。
图3-7相衬显微镜照明原理
如上图所示，相衬显微镜比普通光学显微镜多了2个部件：在聚光器上增加一个环形光
阑；在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过
的光超前或滞后1/4λ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。
1935—1936年间，荷兰物理学家塞尔尼克发现相衬法原理，并制成一种特殊装置（环
状光阑和相板），这些装置可使相位差转变为光强差，使相位物体产生可见的影像。1936
年，蔡司厂生产出第一台相衬显微镜。塞尔尼克因此获得了1953年诺贝尔物理学奖。1947
年，Osterberk设计成功变偏光相衬显微镜也叫变色相衬显微镜。
3.6干涉相衬显微镜
干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。
偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston
棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两
束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由
于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个
Wollaston棱镜(滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。
最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器)，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的
两束光，使二者发生干涉。
图3-8干涉相衬显微镜光路图
1893年，荷兰人西尔克斯提出干涉显微镜。1911年，萨亚尼克描述了第一个双光束干
涉显微镜。1931年，列别杰夫于在雅曼干涉折射计的基础上改制成雅曼—列别杰夫型干涉
显微镜。1952年，诺玛斯基发明了诺马斯基装置，使用这一装置的仪器叫做微分干涉相衬
显微镜，成像比相衬显微镜清晰，且没有光轮出现。
3.7激光扫描共聚焦显微镜
20世纪后半个世纪，将激光技术引入显微镜，激光扫描共聚焦显微镜以单色激光作为
光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理。共聚焦显微镜利用激光扫描束经照
明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭
的焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就
得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。
共焦显微镜与传统显微镜的区别：
1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像。
2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片。
3.增加侧向分辨率。
4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响。
图3-9激光扫描共聚焦显微镜光路图
3.8近场扫面光学显微镜
依据探针原理发展起来的一种扫描探针显微技术（SPM）技术。分辨率突破光学衍射极
限，达到10~200nm。其光学探针尖端的孔径远小于光的波长。当把这样的亚波长光孔放置
在近场区域时，可以探测到丰富的亚微米光学信息。采用孔径远小于光波长的探针代替光学
镜头，将小于波长的超分辨极限的精细结构和起伏的信息从近场区的电磁场（隐失场）获取。
图3-10近场扫面光学显微镜光路图
1928年，提出“近场探测原理”。
1972年，等人在微波波段（λ=3cm）实现了λ/60（0.5mm）的分辨率。
1981年，IBM的g发明了STM。
1982年，实现了SNOM分辨率为25nm。
90年代后，Bell实验室的解决了镀Al膜的光纤超探针制备和针尖—样品间距控
制这两个难题。
3.9倒置显微镜
倒置显微镜(InvertedMicroscope)的组成和普通显微镜一样，物镜与照明系统颠倒，前者
在载物台之下，后者在载物台之上。
1867年，史密斯()制成倒置显微镜用于细胞培养、组织培养和微生物研究。
3.10体视显微镜
法国的奥伯豪泽尔(user)于1840年前后制成了解剖显微镜.许多厂商就加以仿
制和改进。采用两个物镜和两个目镜的体视显微镜是蔡厂在美国动物学家格里诺
(ugh)的激励下于1896年制成的,现在许多书上称之为格里诺显微镜
(greenoughmicroscope),它实质上就是今天的小型体视显微镜。
3.11袖珍显微镜
1665年,GinseppeCampani做成了一个木制的小显微镜,可视为袖珍显微镜的先驱.1776
年西森(Jeremiahsisson)根据Demai-nbray的设计制成了袖珍显微镜。
4重大事件
16世纪末荷兰眼镜商Janssen父子发明原始光学显微镜，两个凸镜放在一个筒中，可以
放大物体。荷兰人AnthonyVonLeeuwenhoek和英国人RobertHooke在成像原理和实践中不断
改进，实现光学显微镜雏形。
1665年胡克提出细胞概念。
1835年，英国科学家提出“爱里斑”的概念。
1873年，德国著名科学家ErnstAbbe提出了著名的阿贝光学衍射极限理论。
1993年，EricBetzing发展了扫描近场光学显微镜，突破光学衍射极限
2006年是超高分辨率荧光显微镜技术发展的重要一年，Betzing和Lippincott-Schwarz以
及合作发明了基于荧光蛋白单分子定位原理的PALM技术；同时，哈佛大学庄小威
研究组发表了基于荧光染料单分子定位的STOPM技术；随后，SamuelHess研究组也独立发
明了FPALM技术。
5本世纪研究成果与趋势
5.1超高分辨率显微镜
超高分辨率荧光显微技术通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍
射极限，把光学分辨率提高了几十倍。超高分辨率荧光显微技术大体可分为两类，一类通过
调制照明光斑缩小系统的点扩散函数来实现超分辨成像，主要贡献者包括诺贝尔奖得主
StefanHell以及MatsGustafsson;另一类则是基于单分子定位的超分辨技术，主要贡献者包括
诺贝尔奖得主EricBetzig、r以及哈佛大学庄小威教授和SamuelHess。
5.1.1基于点扩散函数调制的超分辨率技术
5.1.1.1受激发射损耗（STED）显微技术
基于受激发射损耗（STED）显微技术，通过两个脉冲激光，使样品发射荧光的体积限制
在非常小的范围内。通过减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高
分辨率，成像突破衍射极限，分辨率先达100nm,再进一步达到30nm分辨率。
2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz[14]首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种
(PA-GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹。同年德国科学家EricBetzig认识到，结合
这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限。
2000年，Hell用一束激光激发荧光分子发光，再用另一束环状激光消除激发光周围的
荧光，实现了超高分辨率成像，将光学显微镜分辨率提高10倍。
2008年超高分辨率荧光显微镜问世，史蒂芬·赫尔（Stefanw．Hell）、埃里克·本茨
格（EricBetzig）和威廉·默尔纳（r）因在超分辨率荧光显微技术方面的
贡献共享了2014年的诺贝尔化学奖。
5.1.1.2饱和结构照明显微技术
利用饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM)分辨率可以
小于50nm。其原理是利用两束强光干涉，使绝大多数荧光分子达到饱和，仅有干涉图像阴
影里的体积非常小的荧光未饱和，当增加光强度，这些体积变得非常小，比任何PSF的宽度
还小。
2000年，美国科学家MatsGustafsson发明了基于照明原理的超高分辨技术。2005年，
Gustafsson发明了饱和SIM，与RESOLFT原理相似，利用荧光饱和实现更高的分辨率。2009
年霍华德-休斯研究院的研究人员将PALM/STORM技术和光的干涉原理结合起来(类似于4
π和SSIM成像的原理)，将三维的分辨率提高到20nm以内。
5.1.2基于单分子定位的超分辨技术
原理：单个荧光分子的爱里斑虽然有几百纳米宽，但其光强的分布却像山峰一样，通过
拟合找到峰尖，精确度高达几纳米，远超衍射极限。通过单分子定位原理可将荧光成像的分
辨率提高十几倍。
1976年，feld使用基于全内反射式的近场照明方式实现了对单个蛋白抗体分子
的荧光观察。1989年，r在超低温下首次实现了单个分子的吸收光谱测量。1990
年，在低温下实现了对单个荧光分子的荧光测量。同年，等人则利用共聚
焦显微镜和脉冲等方法在室温下实现了对溶液中单个荧光分子的检测。2003年Yildiz等人使
用全内反射单分子荧光显微镜追踪Cy3荧光标记的单个肌球马达蛋白分子沿着肌动蛋白微
丝的行走，精度达几纳米。
5.2发展趋势
多模态融合成为一个必然趋势，对于超分辨技术，有三种融合技术，已经出现一些研究
成果。
1、与双光子荧光显微镜结合
2、与电子显微镜结合，即光电融合显微技术。该技术结合了电镜的高分辨率和光学显
微镜的分子特异性，成为目前国际上显微成像技术的研究热点和重要发展方向。
中科院生物物理所徐涛研究员在基金委重大仪器专项的支持下，2011年已展开光电融
合显微技术的研发并取得了世界领先的成果
3、与片层光结合，片层光照明方式大大降低背景荧光信号，具有更高的时间分辨率。
北京大学陈良怡和孙育杰研究组合作，于近期发明了目前世界上性能最卓越的双光子层状光
显微镜并已展开应用。