原位杂交

原位杂交

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2023年3月18日发(作者：威海实验中学)

原位杂交

原位准备工作：

1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上

2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）

3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替

4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）

5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形

6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落

7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml

8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器

最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴

乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解

下次做需买的东西：

1、tRNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）

2、BSA（一次约需15克）

3、多聚甲醛（一次约需20克）

4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）

5、RNAse（实验室可能有）

6、最好领2个2L的三角瓶

7、乳胶手套

8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）

做之前请认真检查所需一切用品是否到位

I．组织固定和包埋

在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材

料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。

FAA固定液（400ml），室温保存：

无水乙醇200ml

冰醋酸20ml

37%甲醛40ml

水（DEPC）140ml

1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入），灭菌

第一天：组织固定（下午4、5点取材）

将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料

投入，冰上真空抽气。缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉

底即可，以达到快速彻底固定。换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。（用DEPC-H

2

O配

酒精）

第二天：脱水

Solutiontimenumberofchanges

50%ethanol60minutesone

60%ethanol60minutesone

*70%ethanol60minutesone

以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。

*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月

第三天：进一步脱水和浸蜡

以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

Solutiontimenumberof

changes

85%ethanol60minutesone

95%ethanol60minutesone

以下所有步骤在室温进行并不时轻摇

Solutiontimenumberof

changes

100%ethanol30minutestwo

100%ethanol60minutestwo

25%二甲苯,75%ethanol

30minutesone

50%二甲苯,50%ethanol

30minutesone

75%二甲苯,25%ethanol+番红

30minutesone

100%二甲苯

60minutestwo

100%二甲苯+1/4volumeParaplastPlus

(paraffin)chips

overnight

(不要摇动)

准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）

第四天：浸蜡

将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几

个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。

第五天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）sigmaP3683-1kg

第六天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）

第七天：浸蜡

换蜡两次（ParaplastPlus）

准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）

第八天：包埋

此步对得到理想的组织切片有很大影响，详细步骤和注意事项参见石蜡切片protocol。

最后包有材料的蜡块置4℃保存。

1、修块修得小一些，一张片子上可多放些切片，包埋时空得开一些，每个小苗单独分开。

2、切片前把镊子，解剖针都烧一下灭菌，烧好后放在一张干净的铝箔上。

3、切9微米，一张片子放三个样，先切好一个放在kimwipe纸上，三个都切好后一个个镜

检，选好区域（在镜检的玻片背面划三道线，方便寻找）

4、三条带都准备好后，将一张新玻片放在烤片机上，加1ml左右DEPC-H

2

O盖平，放入蜡

片，用kimwipe纸吸去水，使蜡带在一起，先大致吸去水后再竖直玻片将水吸尽。

II．切片

将新的载玻片置于预热至42℃（若动作较慢可40度，防止温度过高蜡带融化）的烤片

机上，加1500ulDEPC-H2O覆盖均匀。用镊子将切出的蜡带漂浮在DEPC-H2O上，1-2min

待蜡带展平后用Kimwipe尽量吸走多余的水。

在烤片过程中可快速镜检，寻找理想切片，可节约切片劳动量及载玻片。最后保持玻片

在42℃（41度）烤片机上过夜使切片粘牢。

III．探针合成

探针转录

由于T7聚合酶转录效率略高于T3聚合酶，构建探针时注意利用T7转录antisense链。

1.5ml菌液按常规碱法（质粒小抽试剂盒）提取质粒后溶于含有RNA酶的30ulddH2O中。

取适量质粒在200ul体系中酶切过夜使之线性化，注意选择5’突出末端的内切酶。跑胶检测，

确定是否完全酶切。酚氯仿抽提两次（可一次，上清可少吸些）除尽RNAse，最后溶于适

量DEPC-H2O。最好切胶回收线性条带，如果确定酶切比较完全（没切的与切过质粒一起电

泳，切过的线性质粒跑得慢）也可不回收直接作为转录模板。

（质粒浓、酶切完全、不建议胶回收、酶切后与酶切前电泳比较、加乙醇沉淀时应过夜）

转录体系：（kitfromRoche）

templateDNA2ug

transcriptionbuffer2ul

nucleotides

(UTPanddig-UTPmix)

2ul

RNASIN(RNAseinhibitor)1ul

RNApolymerase2ul

DEPC-H2Otototal13微升

TotalVolume20ul

37℃保温2小时

转录完后取1ul跑胶检测RNA条带大小和亮度，2小时后一般总共合成RNA2ug左右。

跑胶检测时胶和电泳液均换成新的，电泳时间不宜太长，防止RNA降解。

加80ulDEPC-H2O、1ul100mg/mltRNA和5UnitsDNAse，37℃再保温10min。

加100ul4MNH4OAc（用NaOAc）和400ul无水乙醇，-20℃20mins，最高转速10min，

70%洗一次最高转速10min（能看到较多沉淀），超净台吹干（吹干后几乎看不见），注意不

要烘干。

碱解探针

探针一般水解成75-150bp片段按下列公式计算水解时间：

T(time)=(Li-Lf)/KLiLf

Li：原始探针的长度；Lf：最后杂交探针的长度；K=0.11Kb/min

一般500bp的探针水解时间为73min左右。

回收后的RNA溶于100ulDEPC-H2O，加100ul2X碳酸缓冲液（80mMNaHCO3,120mM

Na2CO3）。60℃保温到所计算的时间，10ul10%的醋酸停止反应。加1/10体积的3MNaOAc

（PH5.2）和两倍体积的无水乙醇，-20℃20min。RNA最后溶于50%去离子甲酰胺中

（DEPC-H

2

O）（也可用干的RNA直接制备杂交液），浓度为1ul/slide。最后杂交时探针浓

度为0.5ng/ul/kb，杂交体系为100ul，如原始探针为500bp，那么每张slide需探针0.5ngx100ul

x0.5Kb=25ng。如果最后回收的探针总共1ug，那么最后溶于40ul50%去离子甲酰胺中。

视检测基因表达丰度和初次实验的信号强弱可调整探针浓度上下浮动5倍。（第一次实验推

荐使用标准浓度）

原位杂交前一天：配下面的缓冲液、湿盒用3%双氧水浸泡过夜

准备工作：37℃预热300ml蛋白酶缓冲液（100mMTris(pH8)and50mMEDTA）

1000mMTrispH840ml

500mMEDTA40ml

H2O(DEPC)320ml

IV．原位杂交

第一天

A．切片预处理

1．脱蜡、复水。所有步骤无特别标明均在室温进行。

Solutiontimenumberofchanges

100%二甲苯

10minutestwo

100%ethanol1-2minutestwo

95%ethanol1-2minutesone

90%ethanol1-2minutesone

80%ethanol1-2minutesone

60%ethanol1-2minutesone

30%ethanol1-2minutesone

water1-2minutesone

2XSSC15-20minutesOne

此时配多聚甲醛

400ml装在不锈钢饭盒内

2．蛋白酶处理。酶解RNA上的蛋白质，暴露需杂交的目的RNA。在预热的400ml蛋白酶

缓冲液，[37℃预热一晚]（100mMTris(pH8)and50mMEDTA）中加入80ul蛋白酶K储

备液（5mg/ml）（蛋白酶K直接用DEPC水溶）[用时加蛋白酶K]，终浓度为1ug/ml。混匀

后放入装有切片的切片架，37℃保温30min。

3．组织再固定。防止蛋白酶进一步作用，造成组织松散。

Solutiontimenumberofchanges

2mg/ml甘氨酸in

1XPBS

2minutesone

1XPBS2minutestwo

4%多聚甲醛pH7

(新配*)

10minutesone

1XPBS5minutestwo

*4%多聚甲醛配制方法：用稀NaOH[10M，8-9滴]调1XPBSPH值至11，微波炉

加热至60-70℃，在加多聚甲醛粉末，搅拌溶解，冰上冷却至4℃，稀H2SO4[或浓盐酸]

调PH值至7。（注意：多聚甲醛粉末有剧毒，整个过程在通风橱中进行，称量时不要开启

通风设备！

4．乙酸酐处理。这步使带正电荷的氨基乙酰化，防止非特异性吸附带负电荷的探针。

取6.7ml三乙醇胺（0.1M）（粘稠，吸取时注意），加入到450ml水中，调pH至8.0（约加

2ml浓盐酸），搅拌均匀后在容器中放入一空切片架作支撑，加入2.25ml乙酸酐[sigma]后迅

速放入装有切片的切片架，搅拌10min。

5．洗涤和脱水。

solutiontimenumberofchanges

1XPBS5minutestwo

30%ethanol30secondsone

60%ethanol30secondsone

80%ethanol30secondsone

90%ethanol30secondsone

95%ethanol30secondsone

100%ethanol30secondstwo

[30%——95%可用前一步的，不必换新的，100%要换新的]

脱水后将玻片平铺于塑料盒中，盒内底层放无水乙醇，严格保持切片脱水状态。塑料盒用

parafilm密封后，置4℃3-4小时（可用胶带密封，若此时探针没做好可延长时间）。

脱水后置于一个新的不锈钢盒中，盒底铺几层吸水纸，倒些无水乙醇，下面放一个烘过的玻

片栏，再用保险袋包好

可准备NTE0.2ssc

B．杂交[一张片子20微升B+80微升A]

将所有切片分为sense和antisense两组。按不同片子的数量配制两组杂交液

杂交液A

100ul10Xinsitusalts

400uldeionizedformamide去离子甲酰胺

200ul50%dextransulfate

20ul50XDenhardt’s

10ul100mg/mltRNA

70ulDEPC-treatedwater振荡，甩一下

同时配3管A

totalvolume:800microliters

混匀，不要产生气泡，55℃预热，离心机上甩一下。

先配B

杂交液B

探针Xul1微升一张

DEPC水（100-X）ul

去离子甲酰胺100ul振荡一下，再甩一下——80℃2min[冰上]

totalvolume:200microliters

取适量探针，80℃加热2min，置冰上，离心机甩一下，继续置冰上。将探针溶液加入

预热过的杂交液中，小心混匀，不要产生气泡。每张片子加100ul混合液，小心盖上parafilm

或者盖玻片。不要产生气泡，气泡会严重影响杂交信号。

玻片平铺于湿盒中，盒底加入适量2XSSC，50%甲酰胺（国产，非去离子甲酰胺）。湿盒[湿

盒下铺吸水纸，倒入溶液]密封，恒温箱中52℃杂交过夜。

4*ssc+甲酰胺1：1混合

准备工作：预热0.2xSSC至55℃（约1L）

预热NTE至37℃（约2.0L）

NTE

NaCl58.44

TrispH82.422

EDTA0.74448

其中400ml单独分装

已杂交好，可用ddH2O配试剂

第二天

BlockingReagent（300ml）

称1%粉末加入300微升

100mMTrispH7.5,150mMNaCl

（1800ml）1%BSA、0.3%TritonX-100

（1500ml）

100mMTrispH7.5,150mMNaCl(1800ml)

100mMTrispH7.521.798

150mMNaCl15.7788

100mMTris(pH9.5),100mMNaCl,50mMMgCl2(1000ml)

100mMTrispH9.512.11

100mMNaCl5.844

50mMMgCl210.165

A．洗涤揭膜，放在架子上，再放在不锈钢饭盒内

solutiontimetemp

numberof

changes

0.2XSSC

此时可配BlockReagent，

配完后置于55℃

60

minutes

55°Ctwo

NTE

5minutes37°Ctwo

RNAse(20

micrograms/mlinNTE)

30

minutes

37°one

400ulRNAse储

备液[粉末溶于

ddH2O100℃煮

10min]

（20mg/ml）于

400mlNTE中，

混匀

NTE

5minutes37°Ctwo

0.2XSSC60

minutes

55°one

*1XPBS

5minutes

room

temperature

one

每步溶液均需预热，洗涤时每步尽量保持轻摇。

*至此可将片子放入4°C，以暂停实验。

B．封闭和加抗体

1．加适量的1%（w/v）BlockingReagentin100mMTris,pH7.5,150mMNaCl(新配)，

小摇床上轻摇室温45min。（在长盘子里倒入BlockReagent，一张张放入玻片，脱色摇床小

摇）

2．换1%BSAin100mMTris(pH7.5),150mMNaCl,0.3%TritonX-100[多配些]继续轻

摇45min。

3．在BSA/Tris/Triton溶液（同第2步）中按1:1250稀释地高辛抗体。每片玻片加150ul，

盖上parafilm，小心不要产生气泡。玻片平铺于含BSA/Tris/Triton溶液的湿盒中，密封，室

温2小时。[1微升抗体加入到1毫升溶液，玻片先放在湿盒中]

C．洗涤

1．BSA/Tris/Triton溶液室温，平铺，轻摇洗4次，每次15min。

2．100mMTris(pH9.5),100mMNaCl,50mMMgCl2洗一次，10min。室温，放架在上。

3．最后在新的Tris9.5/NaCl/MgCl2过一次。10min

D．显色

用Tris9.5/NaCl/MgCl2溶液按1:50稀释NBT/BCIP[Rochekit]。混匀不要产生气泡，每张

片子加200ul，小心盖上parafilm，平铺于湿盒内[叠吸水纸加ddH2O]，密封，避光室温[放

抽屉里盖两层黑布]显色1-3天。一般36个小时后有颜色，视情况适当延长显色时间。由于

后续脱水固定过程中要损失一定的颜色，故在不影响观察信号特异性前提下，宜显色时间长

点。

切片固定

1．在显色过程中至少在20个小时后应不时镜检，观测显色程度，防止信号背景过高。用

kimwipe吸干显色液，最后在TE中终止反应。

2．脱水。注意下列溶液都有脱色作用，动作要快，一般3sec左右，不要超过5sec。

（为保险起见，防止脱水过程出现问题，推荐待吸去显色液后迅速挑几张重要的片子拍照保

存。）

solutionnumberofchanges

30%ethanolone

50%ethanolone

70%ethanolone

85%ethanolone

95%ethanolone

100%ethanoltwo

100%Histocleartwo

3．Kimwipe擦干后，中性树胶封片。

TE(400ml)

100mMTrispH84.844

50mMEDTA7.4448

储备液

用DEPC-H

2

O配

可将NaCl；Tris；EDTA（用Na盐）配成母液吸取所需的量，这样可以节省要

烘的量筒数

10XPBSpH7.0:分子量100ml量

1.3MNaCl58.447.5972

70mMNa2HPO412H2O358.142.50698

30mMNaH2PO42H2O156.010.46803

5XNTE:

2.5MNaCl58.4414.61

50mMTrispH8121.10.6055

5mMEDTA372.240.18612

20XSSC:

3MNaCl58.4417.532

300mMNaCitrate2H2O294.18.823

1MTrispH8

Tris121.112.11

500mMEDTA

EDTA372.2418.612

100mMTrispH7.5/150mMNaCl

100mMTris121.11.211

150mMNaC58.440.8766

TE

100mMTris121.11.211

50mMEDTA372.241.8612

10XPBS/GlycinepH7-storeat4°C:

1.3MNaCl58.447.5972

70mMNa2HPO412H2O358.142.50698

30mMNaH2PO42H2O156.010.46803

20mg/mlGlycine2

10Xinsitusalts-storeatroomtemp:

3MNaCl58.4417.532

100mMTrispH8（配成10X母液吸取所需的量）121.1

1.211

100mMNa3PO4pH6.8380.123.8012

50mMEDTA372.241.8612

十八．原位杂交

第一部分：固定、包埋及切片

材料：

药品：

无水乙醇（分析纯，国产）

冰醋酸（分析纯，国产）

甲醛（37%水溶液，国产）

二甲苯（分析纯，国产）

番红（国产）

DEPC（）

POLYLYSIN（SIGMA）

PARAPLASTPLUS（SIGMA，P-3683）

器材：

青霉素小瓶若干(180°C烘8小时)

量筒（3个）(180°C烘8小时)

新牛皮纸

HEATBLOCKER两台

POLYLYSINTREATEDSLIDES（SIGMA）

手摇切片机（国产）

一次性切片刀片（日本）

试剂：

DEPCH2O：加0.1%的DEPC到水中,37°C24小时,高压灭菌

FAA固定液：

无水乙醇50ml

冰醋酸5ml

37%甲醛10ml

水（DEPC）35ml

步骤：

1．将所需材料适量（不超过固定液的1/20）取到已盛有FAA固定液的青

霉素小瓶中。抽气（建议用注射器）放气后可观察到样品沉到瓶底。

室温放置14-16小时后开始脱水。（CSHL认为不能超过16小时，所

以通常晚上固定，第二天早上开始脱水。）

2．0%乙醇，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，100%乙

醇，室温下逐级脱水每级30分钟。

3．?二甲苯3/4乙醇，1/2二甲苯1/2乙醇，3/4二甲苯1/4乙醇（饱和番

红），二甲苯，二甲苯，室温下透明每级30分钟。二甲苯可多换两

次，但总时间不宜过长。

4．将3-5片蜡片小心投入含1/2体积的二甲苯和样品的小瓶，并将小瓶

放置于已调到37°C的HEATBLOCKER上，大约15分钟后蜡溶解，

轻轻摇动小瓶，使溶解的石蜡均匀分布，再加入3-5片蜡片。几次后

小瓶渐满，保持37°C过夜。

5．将含二甲苯的石蜡换成纯蜡，并将温度升至60°C（因为二甲苯很难

换

干净，建议换一个小瓶）

6．此后，每天换蜡两次，每次间隔大于10小时，换蜡2-3天后可以开始

包埋。

7．将溶好的蜡到入带手套折好的小船中，用烧热的镊子将材料夹到小船

内，并摆好位置。待表面的石蜡稍凝，将小船迅速浸于已备好的冷水

中，放置至少2小时。包埋好的蜡块可用干净容器装好置于4°C存

放。

8．切片同一般石蜡切片，先大致修块，再精细修块，精细修块时注意防

止RNASE污染。切片刀片如不是新的需用氯仿清洗。其它所用工具

做相应处理。切片厚度8-10微米

9．展片时使用DEPC水。吸干时使用无尘拭纸。在本实验室条件下37°

C

展30分钟即可。42°C烘箱过夜。

第二部分：标探针

药品：

BoehringerMannheimRNALablingKit（#1175025）

试剂：

200mMEDTA(DEPC，灭菌)

4MLiCl(DEPC，灭菌)

200mMNa2CO3(pH=11.4)(DEPC，灭菌)

200mMNaHCO3(pH=8.2)(DEPC，灭菌)

1MNaAc(pH=4.7)(DEPC，灭菌)

步骤：

1．酶切并纯化探针模板。沉淀后溶于DEPC水，电泳定量。

2．按以下体系反应，标探针。

水（DEPC）12微升

10XTranscriptionBuffer（vial8）2微升

NTPLablingMix（vial7）2微升

模板DNA1微升（1微

克）

RnaseInhibitor（vial10）1微升

（20U）

RNAPolymorase2微升

37°C大于等于2小时。

3．加入2μlRnasefreeDnase37°C30min.

4．加入2μl200mMEDTA，加入2.5μl4MLiCl275μlEtOH，——

20°C过夜

5．离心，70%乙醇洗两次。超净台吹干。

6．溶于100μlDEPC水，68°C5分钟。

注：当模板小于500bp时，可进行以下调整，减少模板到500ng.

增加RNaseInhibitor到40U，延长反应时间到4-6小时。

7．水解探针

按以下公式计算水解时间

水解时间（分钟）=(Lo-Lf)/(K)(Lo)(Lf)

Lo=模板长度(Kb)

Lf=最终长度(Kb)通常为0.1Kb

K=反应常数=0.11/Kbmin

按以下顺序加入反应体系:

i.50μl探针

ii.30μl200mMNaHCO3

iii.20μl200mMNa2CO3

iv.60°C放置所需时间后加入

v.10μl1MNaAc(pH=4.7)停止反应

vi.加入10μlLiCl2,300μlEtOH,-20°C过夜.

vii.离心,70%EtOH洗2次,超净台吹干,溶于50μlDEPC水.-

20°C备用.

第三部分：杂交

药品：

无水乙醇（分析纯，国产）

二甲苯（分析纯，国产）

三乙醇胺（分析纯，国产）

二水合柠檬酸钠（分析纯，国产）

氯化钠（分析纯，国产）

浓盐酸（国产）

甲酰胺（分析纯，国产）

EDTANa.2H2O（分析纯，国产）

Tris（进口分装）

醋酸酐（Anhydrit，SIGMA）

蛋白酶K（ProteinaseK，SIGMA）

tRNA（SIGMA）

BlockingReagent（BoehringerMannheim）

DextranSulfate（SIGMA）

Formamide（SIGMA）

器材：

染缸一套约30个（180°C烘8小时）

湿盒一个（洁净）

三角瓶，量筒若干（180°C烘8小时）

试剂：

1MTris-HClpH7.5：100ml

80mlDEPCH2O

12.11gTris

HCl6.5ml调pH7.5,定容,灭菌

500mMEDTApH7.5:100ml

80mlDEPCH2O

18.61gEDTANa.2H2O

2gNaOH调pH7.5,定容,灭菌

KBuffer:200ml

20ml1MpH7.5TrisCl

20ml500mMEDTApH7.5

160mlDEPCH2O

100mM三乙醇胺溶液pH8.0：200ml

2.68ml三乙醇胺原液

0.8ml浓盐酸

100mlDEPCH2O

醋酸酐溶液:

用氯仿处理过的转子剧烈搅动DEPC水

加入0.25%的醋酸酐,继续搅动5秒钟后马上使用.

20XSSC:500ml

400mlDEPCH2O

87.65gNaCl

44.1gNa3Cit.2H2O

10NNaOHajustpHto7.0定容,灭菌

湿盒溶液:

0.3MNaCl

50%甲酰胺

杂交液:

100μl杂交液=77.2μlA+22.8μlB

A7.72ml分装备用:

5000μlFormamide

1000μl50%DextranSulfate

0.1gBlockingReagent

600μl5NNaCl

100μl1MTrisClpH7.5

20μl500mMEDTApH7.5

1000μlDEPCH2O

B22.8μl(现用现配)

1.5μl10mg/mltRNA

21.3μlProbe&DEPCH2O

80°C5分钟,迅速置于冰上.

步骤:

1．脱蜡,100%二甲苯两次,每次20分钟.

2．复水,1/2二甲苯1/2乙醇,100%乙醇,100%乙醇,95%乙醇,85%乙

醇,70%乙醇,50%乙醇,30%乙醇,水两次,每级2分钟.

3．37°C预热KBufer后,加入蛋白酶K至1-5μg/ml,37°C30分钟,DEPC

水洗3次.

4乙酰化,用三乙醇胺处理5分钟后迅速移至现配的醋酸酐溶液中.

5．2XSSC,两次每次5分钟,

6．10%乙醇,30%乙醇,50%乙醇,70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,100%乙

醇,100%乙醇,逐级脱水.

7．超净台吹干至少1小时.(可暂时存放在4°C)

8．配杂交液.每片加100μl,用PARAFILM膜封上.在湿室(垫有

0.3MNaCl-50%甲酰胺的饱和吸水纸)置于42°C烘箱杂交.

第四部分：洗片

试剂:

20xSSC

10xRNaseBuffer:(100ml)

29.22gNaCl

0.37gEDTANa2.2H2O

1.21gTris

ajustpHto7.5withHCl

RNaseSolution:

2.5μl10mg/mlRNase+1mlRNaseBuffer

步骤:

1．4xSSC室温下洗4次,每次5分钟.

2．在37°C预热的RNaseBuffer中加入RNase使之终浓度达到25μ

g/ml,放入切片37°C处理30分钟.

3．37°C下RNaseBuffer洗3次,每次15分钟.

4．2xSSC室温下,轻柔的洗两次,每次30分钟.

第五部分：检测

药品:

Na2HPO4.12H2O（分析纯，国产）

NaH2PO4.2H2O（分析纯，国产）

NaCl（分析纯，国产）

KCl（分析纯，国产）

MgCl（分析纯，国产）

Tris（进口分装）

Tween20（进口分装）

BSA（进口分装）

BoehringerMannheimDIGNucleicAcidDetectionKit(#1175041)

试剂：

10xPBT：（200mlpH7.5）

2mlTween20

5.8gNa2HPO4.12H2O

0.6gNaH2PO4.2H2O

15.2gNaCl

0.04gKCl

AntibodySolution:

135μl1xPBT

15μl10mg/mlBSA

0.5μlAnti-DIG-AP

TNM50:(TNM50A+TNM50B)

TNM50A:

1MTrispH9.5

5MNaCl

TNM50B:

1MMgCl

DetectionBuffer:

2%NBT/BCIPstocksolutioninTNM50

步骤:

1．1xPBT室温5分钟.

2．0.5%BlockingReagent(1xPBT)室温下,湿盒中30-60分钟.

3．1xPBT10分钟.

4．在室温下湿盒中与抗体结合30-120分钟.

5．1xPBT洗4次，每次10分钟.

6．1xTNM50，5分钟.

7．避光,显色.一般24小时到1周.

8．脱水

9．封片