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2023年3月18日发(作者：油尖区)华东理工大学学报(自然科学版)
JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology(NaturalScienceEdition)
Vol.37No.4
2011-08
收稿日期:2011-02-28
基金项目:上海市重点学科建设项目资助(B505)
作者简介:张云康(1986-),男,江苏丹阳人,硕士,研究方向为工业微生物。E-mail:zykkon@
通讯联系人:赵健,E-mail:zhaojian@
文章编号:1006-3080(2011)04-0458-06
重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ñ在大肠
杆菌中的表达、纯化及其性质
张云康1,高兴1,汪德健1,王富军2,赵健1
(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;
2.上海中医药大学,上海201203)
摘要:肝素酶Ñ(HeparinaseÑ,HepÑ)是一种多糖裂解酶,可特异性裂解硫酸肝素分子中糖
苷键以制备低分子质量肝素(LMWH)。由于重组肝素酶Ñ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体,
将肝素酶Ñ基因的N端融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,在大肠杆菌中进行低温表达。结果
显示,约90%的GST-HepÑ融合蛋白以可溶性形式表达,表达的目标蛋白粗酶经过一步亲和纯
化,比活为124.7U/mg,纯化倍数达到366.7倍,酶活回收率为31.0%;结果表明Ca2+对重组GST-
HepÑ有很强的激活作用,GPC-HPLC结果显示重组GST-HepÑ与天然肝素酶Ñ裂解图谱相同。
关键词:肝素黄杆菌;谷胱甘肽-S-转移酶;肝素酶Ñ;融合表达;亲和纯化
中图分类号:Q814.1文献标志码:A
Expression,PurificationandCharacterizationofRecombinant
GST-haparinaseÑfromFlavobacteriumheparinum
inEscherichiacoli
ZHANGYun-kang1,GAOXing1,WANGDe-jian1,WANGFu-jun2,ZHAOJian1
(eyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceand
Technology,Shanghai200237,China;aiUniversityofChineseTraditionalMedicine,
Shanghai201203,China)
Abstract:HeparinaseÑisanenzymethatspecificallycleavescertainsequencesofheparansulfate.
Previousreportsshowedthatthisenzymewashighlypronetoaggregationininclusionbodieswhenitwas
paper,theN-terminusofheparinaseÑgenewasfusedaglutathione-
S-transferase(GST)tag,ultsshowedwhen
inducedat15e,approximately90%
enzymehasaspecificactivityof124.7U/mgproteinbyone-stepaffinitychromatography,therecovery
was31.0%,-HepIwaswellactivatedbyCa2+.Results
ofGPC-HPLC(Gelpermeationchromatographyhigh-performanceliquidchromatography)analysisof
oligosaccharidesofheparindegradedbyGST-HepÑwassimilartothoseofnativeHepÑ.
Keywords:Flavobacteriumheparinum;glutathione-S-transferase(GST);heparinaseI;fusion
expression;affinitychromatography
458
肝素是一类高度硫酸化的复杂的酸性多糖,由
糖醛酸和D-葡萄糖胺通过1-4糖苷键相连而成,由
于硫酸基团位置的可变性,使得肝素在组成上具有
高度的多样性[1-5]。肝素具有抗凝血特性[6],但存在
一定的副作用,与肝素大分子相比,LMWH由于其
分子量低和多分散性,因此具有更好的生物可利用
性和更高的安全性[7]。目前LMWH大多通过化学
裂解法制备,化学裂解是比较成熟的方法,其成本
低,已在工业中广泛应用,但是其强氧化剂与肝素硫
酸基团的反应改变了肝素的结构,并且降低了
LMWH的药物活性。Linhardt等[8]报道了生物酶
催化降解肝素制备LMWH的方法,与化学方法相
比,酶法制备具有条件温和,产物与其底物糖胺聚糖
更加相近,生物活性高等特点[9]。Ernst等[10]将来
源于肝素黄杆菌Flavobacteriumheparinum的
haparinaseÑ成功地用于降解肝素制备LMWH[11],
但是野生菌产量低,纯化工艺复杂,难以进行商业上
应用。
HaparinaseÑ(EC4.2.2.7)是肝素黄杆菌产自
肝素黄杆菌的3种肝素酶之一,除了可用于制备
LMWH外,还具有多种重要的医药用途,包括体外
循环中肝素的消除,肝素精确结构的确定等[12]。
Ernst和Sasisekharan[10,13]首次克隆了HepÑ基因,
但活性很低,大都形成无活性的包涵体。本文将肝
素酶Ñ与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)进行融合表达,
并采用诱导后低温培养的方式实现了肝素酶Ñ的可
溶性表达;通过一步亲和纯化将其纯化至电泳纯,并
对纯化后肝素酶Ñ的酶学性质进行了研究。
1实验部分
1.1材料与方法
1.1.1菌株和质粒肝素黄杆菌(Flavobacterium
heparinum)(ATCC13125)由本实验室保存;pM-
Dl8-Tvector购自TaKaRa公司;pGEX-4T-2表达
载体为本实验室保存;EscherichiacoliDH5A和
EscherichiacoliBL21(DE3)为本实验室保存。
1.1.2工具酶和化学试剂蛋白酶K、溶菌酶、琼
脂糖购自上海生工生物工程技术服务有限公司;
RNA酶A、TaqDNApolymerase、T4DNALigase
及各种限制性核酸内切酶购自TaKaRa公司;蛋白
胨、酵母抽提物、胰蛋白胨购自OXOID公司;氨苄
青霉素钠(Amp)购自Amresco公司;细菌基因组抽
提Kit、质粒抽提Kit、凝胶回收Kit由Generay公司
生产;标准DNAMarker由TaKaRa公司生产;引
物定购于上海生工生物工程技术服务有限公司;其
他试剂均为国产分析纯。
1.2重组表达载体的构建
根据Genebank数据库中查到的黄杆菌肝素酶
Ñ基因全序列(不含信号肽序列)设计引物,以Fla-
vobacteriumheparinum基因组DNA为模版,PCR
扩增得到HepÑ基因,引物分别为:5c端引物为5c
CCATGGGATCCCAGCAAAAAAAATCC3c
(BamHÑ),3c端引物为5cGCGGCCGCTCTG-
GCAGTTTCGCTGTA3c(NotÑ),BamHÑ和
NotÑ酶切回收目的片段,连接表达载体pGEX-4t-
2,构建质粒pGEX-HepÑ,见图1。转化后经菌落
PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆,将正
确的质粒送上海美季生物技术有限公司进行测序,
将测序结果与GenBank数据库进行比对分析。
图1pGEX-HepÑ重组质粒的构建
Fig.1ConstructionofrecombinantplasmidofpGEX-HepÑ
1.3目的基因在大肠杆菌中的表达
分别在15,28,37e下对大肠杆菌诱导表达,取
诱导表达的菌液处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE),以标准蛋白质相对分子质量对照目
的蛋白的相对分子质量。用Bandscan软件扫描分
析,检测目的蛋白的表达量。
1.4目的蛋白GST-HepÑ的纯化
取5mLGST琼脂糖凝胶FF装柱,将20mL
粗酶液与GST琼脂糖凝胶混合,4e结合1~2h,
结合后的混合液上柱,流速0.5mL/min。用20mL
平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH7.5,U=
10%甘油,10mmol/LCaCl2,2mmol/LDTT)洗
459第4期张云康,等:重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ñ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质
涤,流速1mL/min,用10mL洗脱缓冲液(50
mmol/LTris-HCl,pH8.0,U=10%甘油,10
mmol/LCaCl2,1mmol/LDTT,10mmol/LGSH)
进行洗脱,流速1mL/min,分管收集,对收集管中
的溶液进行酶活测定,并进行SDS-PAGE及蛋白浓
度测定。
1.5GST-HepÑ活性测定
参照文献[9]进行GST-HepI的活性测定。
1.6GST-HepÑ性质分析
最适催化温度:将测活缓冲液分别在20,25,
30,35,40,45,50e水浴中保温20min,加入适量酶
液,用UV232法测定不同反应温度下的酶活性。
最适催化pH:调整酶活测定体系的pH值,使
其分别为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0和12.0,于
30e水浴中保温20min,加入适量酶液,用UV232
法测定不同pH下的酶活性。
Ca2+对酶的活性的影响:在酶活测定体系中加
入不同浓度的CaCl2,终浓度分别为0,0.5,1.0,
2.0,5.0,10.0mmol/L,于30e水浴中保温20
min,加入适量酶液,用UV232法测定不同CaCl2
浓度下的酶活性,确定不同浓度Ca2+的激活作用。
以空白CaCl2测得的酶活作为100%,计算其他
CaCl2浓度下的相对酶活。把酶液等分,分别加入
不同浓度的CaCl2(0、1、10、50、100mmol/L),于4
e冰箱中保存,每隔1d测定酶活,与初始酶活相比
较,确定酶活的残存率。
1.7GST-HepÑ裂解产物的GPC-HPLC分析
将纯化后的GST-HepÑ由深圳海普瑞医药有
限公司进行GPC-HPLC分析。在底物缓冲液(50
mmol/LTris-HCl,pH7.0,2mg/mL肝素,10
mmol/LCaCl2)中分别加入重组GST-HepÑ或天
然HepÑ(1U/mL),于30e水浴中反应12h。将
反应后的混合物煮沸5min,12000r/min离心15
min。形成的寡糖产物用连有紫外检测器和示差检
测器的凝胶渗透高效液相色谱仪(GPC-HPLC)进
行分析[14]。
2结果
2.1重组表达载体的构建与鉴定
PCR获得大小约1200bp的DNA片段回收
PCR产物,将目的基因连接到pGEX-4t-2质粒载
体,经酶切和DNA测序鉴定(图2),重组质粒中目
的基因片段与GenBank数据库(GI:290863)中的
HepI基因相同,重组质粒pGEX-HepÑ构建成功。
M)1kbPlusladder;1)Restrictionenzymedigestedplasmid
图2pGEX-HepÑ质粒双酶切图谱
Fig.2DoubledigestionofpGEX-HepÑbyBamHÑ
andNotÑ
2.2目的基因表达结果
含重组质粒pGEX-HepÑ的Escherichiacoli
BL21(DE3)在不同的温度下用诱导剂诱导12h后,
将菌体总蛋白裂解变性进行12%SDS-PAGE,SDS-
PAGE鉴定结果见图3所示,其表达条带相对分子
质量与理论值69@103相符。由图3可知,可溶性
蛋白的表达量随诱导后培养温度的降低而增加。在
15e以异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导
时,大约w=90%以上的融合蛋白以可溶性形式表
达。在后续的实验中HepÑ采用低温15e作为诱
导后的培养温度。
M)Proteinmolecularmarker;Lane1)Un-inducedtotal
cellprotein;Lane2)Supernatantincubatedat37eafter
induction;Lane3)Inclusionbodyincubatedat37eafter
induction;Lane4)supernatantincubatedat28eafter
induction;Lane5)Inclusionbodyincubatedat28eafter
induction;Lane6)Supernatantincubatedat15eafterin-
duction;Lane7)Inclusionbodyincubatedat15eafterin-
duction
图3诱导后培养温度对可溶性GST-HepÑ融合蛋
白表达的影响
Fig.3Effectsofincubationtemperaturesafter
inductiononsolubleGST-HepÑfusion
proteinexpression.
2.3GST-HepÑ的纯化结果
粗酶液按1.4的方法进行纯化,将诱导前、诱导
460华东理工大学学报(自然科学版)第37卷
后的菌体、粗酶液、流出液、洗涤液和洗脱液进行
SDS-PAGE分析,电泳结果如图4所示。
Lane1)Cellsun-inducedwithIPTG;Lane2)Cellsinducedwith
IPTG;M:Proteinstandards;Lane3)Solublefractionofcrude
cellslysate;Lane4)Flow-through;Lanes5)Washwithbinding
buffer;Lanes6)Eluateswith10mmol/LGSHfromglutathione
sepharosefastflowchromatography
图4可溶性重组GST-HepÑ融合蛋白的表达和纯化
Fig.4Expressionandpurificationofsolublerecombinant
GST-HepÑfusionproteinbyGSTaffinitychroma-
tography
由图4可知,可溶性GST-HepÑ融合蛋白经过
一步亲和纯化即可达电泳纯,纯度高达95%。纯化
后的蛋白相对分子质量约为69kDa,与预期相对分
子质量一致。GST-HepÑ融合蛋白的纯化过程如
表1所示。
表1GST-HepÑ融合蛋白纯化表
Table1PurificationsummaryofGST-HepÑfusionprotein
Step
m(Total
protein)/
mg
Total
activity/
U
Specific
activity/
(U#mg-1)
Activity
recovery/
(%)
Purification
fold
Crude
extract
349.6120.30.341001.00
Glutathione
sepharose
FF
0.337.4124.731.0366.7
2.4温度和pH对GST-HepÑ活性的影响
取纯化后GST-HepÑ,分别在不同温度(20~
50e)和不同pH(6.0~12.0)下,按标准测活方法
测定HepÑ活性,结果见图5。
由图5(a)可知,在20~30e之间酶活较高,30
e时酶活达到最大值,温度超过30e酶活开始下
降。图5(b)显示GST-HepÑ的最适pH为7.0,体
系偏碱时,不利于酶反应。MaXiaolai等[14]曾报
道,肝素黄杆菌肝素酶Ñ在35e以上极易失活,pH
7~11之间酶基本稳定,从本研究的结果来看,融合
图5温度和pH对GST-HepÑ融合蛋白活性的影响
Fig.5EffectsoftemperaturesandpHonactivityof
GST-HepÑfusionprotein
有GST标签的HepÑ保持了肝素黄杆菌肝素酶Ñ
对于温度和pH的敏感性。
2.5Ca2+对酶活性的影响
取纯化后的GST-HepÑ,在不同CaCl2浓度下
按标准测活方法测定GST-HepÑ活性,见图6。
图6CaCl
2
对GST-HepÑ融合蛋白活性的影响
Fig.6EffectsofCaCl
2
onactivityofGST-HepÑ
fusionprotein
由图6可知,CaCl2对酶有很强的激活作用,在
0~5mmol/L的范围内,酶活随CaCl2浓度增加快
速升高。向酶液中添加5mmol/L的CaCl2,可使酶
活提高约150%,而当CaCl2浓度高于5mmol/L
时,CaCl2对酶的激活作用基本保持不变,Ca对
GST-HepÑ活性的激活作用与先前曾报道的肝素
黄杆菌HepI[15]的性质相似。
2.6GST-HepÑ裂解产物的GPC-HPLC分析
将GST-HepÑ裂解肝素形成的寡糖产物用凝
胶渗透高效液相色谱仪(GPC-HPLC)进行分析,结
果如图7所示。
461第4期张云康,等:重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ñ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质
TheoligosaccharideproductswereanalyzedbyUV(a)andRIdetec-
tors(b~d).(b))Theprofileofheparinasacontrol;(c))The
productprofileofheparindegradationbyGST-HepÑ;(d))The
productprofileofheparindegradationbynativeHepÑfromFla-
vobacteriumheparinum.
图7HepI裂解肝素产物的GPC-HPLC分析
Fig.7GPC-HPLCanalysisofoligosaccharidesofheparin
degradedbyHepÑ.
通过对比图7(c)和图7(d)可以看出,重组
GST-HepÑ裂解底物肝素形成的产物(图7(c))和
天然HepÑ[15]裂解底物产生的产物(图7(d))相同,
在反应约22min后,大分子的肝素被裂解成小分子
的二糖,其相对分子质量由原来的18359变为866,
这表明,与天然的肝素酶相比,重组GST-HepÑ对
HepÑ的酶催化活性和对底物的降解能力几乎没有
影响。
3讨论
野生肝素黄杆菌的HeparinaseI产量低,优化
工艺复杂,而先前克隆表达的HepI则活性低,且包
涵体含量相对较高。陈银等[16]将来源于肝素黄杆
菌的HepI与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合,提高了
融合蛋白的可溶性表达,而罗勇德等[17]将GST-tag
融合在来源于多行拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomi-
cron)的HeparinaseI的N端进行表达,使HepI的
活性和表达量都有了很大的提高。本实验成功构建
了pGEX-HepÑ重组质粒,在Escherichiacoli
BL21(DE3)中实现了HepÑ的可溶性表达,并且与
MBP-tag相比,GST-tag降低了蛋白质空间位阻效
应对肝素酶性质的影响。马小来等[18]用羟基磷灰
石吸附-解吸附、DEAE柱、CM柱层析的三步纯化
法纯化野生型的HepÑ得到的纯化酶的比活为
70.18U/mL,回收率为13.4%,而实验中重组
GST-HepÑ粗酶液经过一步亲和纯化,纯化倍数为
366.7倍,比活达124.7U/mg,酶活回收率为
31.0%,纯化工艺具有明显的优势,GPC-HPLC结
果显示重组肝素酶与天然肝素酶降解肝素图谱完全
相同,说明重组HepÑ中的GST标签没有影响
HepÑ的催化性质。
本实验建立了一种高效制备具有生物活性的肝
素酶Ñ融合蛋白的生产技术,解决了肝素酶Ñ的高
效可溶性表达问题。通过一步亲和纯化即可得到高
纯度的肝素酶Ñ,为肝素酶Ñ的商业化生产和在制
备低分子量肝素中的应用研究奠定了基础。
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WaterbornePolyurethane-PolyacrylicEsterHybridDispersion
ModifiedbyHexamethyleneDiisocyanateTrimer
YEDai-yong*,CHENGuang-xiang,LINMao,BAIYe
(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthChinaUniversityof
Technology,Guangzhou510640,China)
Abstract:Aself-emulsifyingwaterbornepolyurethanedispersionwassynthesizedwithboth
hexamethylenediisocyanate(HDI)trimerandtoluenediisocyanate(TDI),polyetherdiolsN220,1,4-
butanediol(BDO),2-hydroxymethy-lpropionicacid(DMPA)andepoxyresinE-20asmainrawmaterials
persionwasfurthermodifiedbymethylmethacrylate(MMA)toform
akindofnuclear-shellhybriddispersion,inwhichthehydrophobicnuclearwasthepolymethyl
methacrylateandthehydrophilicshellwastheself-emulsifyingwaterbornepolyurethanedispersion
ecularstructureofWPUdispersionwascharacterizedbyFourier
TransformInfraredSpectroscopy(FT-IR).ThesurfacemorphologyofitsfilmwastestedbyAtomicForce
Microscope(AFM).Theglasstransitiontemperature(Tg)ofpolymerwasmeasuredbyDifferential
ScanningCalorimerter(DSC).Itsminimumfilmformingtemperaturewasmeasuredtobeaslowas0e.
WiththeincreasingchargeofHDItrimer,boththeappearanceandyellowresistanceofPUemulsionwere
hanismpropertiesandwaterresistanceoffilmwereimprovedwhentheamountofE-20
prehensiveperformanceofthemodifiedwaterbornepolyurethane
dispersionwasbetterwhentheamountofHDItrimer,E-20andMMAwere7.5%,5%and20%,respec-
tively.
463第4期张云康,等:重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ñ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质