基因图谱
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2023年3月17日发(作者：大学英语作文)如何阅读基因载体图谱
基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的
生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。一、载体分类
及载体组成元件载体分类1、按属性分类：病毒载体和非病
毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物
质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细
胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养
中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和
疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并
能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）
对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。非
病毒载体一般是指质粒DNA。2、按进入受体细胞的类型分
类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复
制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有
效表达）。3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：
具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携
带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增
DNA片段（外源基因）的载体。表达载体：克隆载体中
加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）
有关的元件即成为表达载体。载体组成元件1、复制起始位
点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其
他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。2、抗生素抗性基
因：可以便于加以检测，如Amp+，Kan+（1）Ampr：水解
β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr：可以阻止四环素
进入细胞。（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失
去毒性。（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418
（卡那霉素衍生物）失活。（5）hygr：使潮霉素β失活。3、
多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制
酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有
外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外
源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源
DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越
不稳定，转化效率越低。4、P/E：启动子/增强子5、Terms：
终止信号6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用示
例阅读载体：pENTER载体1）humanORF+pENTER载体2）
CMV启动子，T7启动子3）ORF的C端融合了Flag和
Histag4)多克隆位点，常用AsisI和MluI(人源基因上不常
见的)4）SV40poly（A）加尾信号5）SV40启动子启动的
puro标记6）2个腺病毒ITR序列和2个与腺病毒Ad5同
源的序列，可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体，直接
用于腺病毒的生产。慢病毒载体1）EF1a启动目的基因（可
添加小标签FLAG或HIS等小标签）2）CMV启动GFP，
非融合抗性筛选标记Puro（便于做细胞株的稳筛）3）WPRE
（来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件），放置在目的基
因的上游，能加强转基因的表达4)cPPT（来自HIV-1整合
酶基因），增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴
度5）第三代慢病毒载体，载体中还包含HIV-1基因组中的
顺式调节元件(ψ包装信号和LTR长末端重复序列，其中
3’LTR增强子功能缺失，5’LTR中U3区替代为CMV，更
加安全的病毒载体)腺相关病毒载体AAV表达载体包括了
中两个ITR+CMV（可替换其他组织特异性启动子，见改造
载体部分）+globinintron内含子序列+目的基因+polyA
序列二、选择和准备载体选择载体主要依据构建的目的，同
时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。如果构建的
目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
选用哪种载体，还是要结合目的基因及载体特点以实验目的
为准绳。载体选择主要考虑下述3点：1、构建DNA重组体
的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载
体。2、载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力—据克隆片
段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体
包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。①腺
病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度
为7.5kb外源基因的腺病毒。②慢病毒的包装容量约为6kb
（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以
上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1
个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进
行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、
转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一
定难度。③AAV的总包装容量是4.7kb（包含载体中两个ITR
约0.3kb+具体启动子+内含子约0.6kb+具体荧光标签+
polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb左右。由于
AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，
因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。（2）确定
表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为
原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如
带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不
同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配
置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一
般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核
纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表
达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放
到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，
常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经
过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达
量的蛋白。3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体
不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架
错位。①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损
坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；②一般使用松
弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，
而严谨型质粒<10个；③必需具备一个以上的酶切位点，
有选择的余地；④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性
基因。选择载体还需注意：无标签载体，起始/终止密码子
都要添加！标签在N端的载体，终止密码子要添加！标签在
C端的载体，起始密码子要添加！（详细解读如下）①对于无
起始密码子和终止密码子的基因，插入无标签的载体要加入
起始密码子和终止密码子。②载体N端有标签，上游引物要
对读码框；下游引物要加终止密码子(为了保证基因的表达,
少翻译载体序列)。链接：对读码框是为了防止移码，是不
是移码要看载体图谱，看酶切位点。从ATG开始，要保证三
个碱基编码的氨基酸不能影响插入目的基因的正常编码，若
影响了插入目的基因的正常编码就要在设计引物的时候在
酶切位点前或者后插入一个或者两个碱基，总之是不能影响
插入目的基因的正常编码蛋白。有的酶切位点含有起始密码
子，如果标签在C端像NcoI就有一个ATG，这时候需要加
碱基在酶切位点后面。③载体C端有标签，上游引物要加起
始密码子，且考虑是否加Kozak序列（真核表达系统）；下
游引物要对读码框，并且要去掉基因本身的终止密码子（保
证C端标签表达）。链接：Kozak序列是位于真核生物mRNA
5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC
（常见的序列是GCCACC），位于起始密码子（ATG）之前。
它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的
mRNA翻译起始。在真核生物中，该序列相对比较保守。对
应于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密码
子AUG上游一段对mRNA的翻译起作用的序列）。添加
Kozak序列的好处：核糖体需要Kozak序列进行稳定结合有
助于提高真核基因的转录和翻译的效率。三、改造载体1、
改造启动子：一般在过表达载体中CMV属于广谱型的强启
动子，具体可根据实验需求，选用不同启动子，尤其是对于
AAV载体构建时选用组织特异性启动子。启动子名称启动
子大小组织特异性ALB2.4kb肝脏特异性CAG944bp广泛表
达的强启动子CamKIIa1.2kb大脑皮层和海马神经元特异性
启动子CMV0.6kb广泛表达的强启动子EF1A1.2kb广泛表达
的启动子(尤其在体内稳定表达)GFAP1.0kb星形胶质细胞特
异性启动子aMHC0.4kb心肌α肌球蛋白重链启动子