fish技术
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2023年3月16日发(作者：师德表现个人小结)FISH技术的探针要求必须具有较好的特异性、灵敏性和良好的组织渗透性。根据需要合成
的DNA或RNA寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化,能够用酶学或化学方法进
行非放射性标记。FISH技术不仅能提供静止的实验结果,还可以动态地观察流动水体中的
微生物种群变化,因此FISH技术被用于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化,以
帮助人们理解环境中微生物种群的组成和生长动力学。
FISH的首次应用是在1980年，Bauman[1]等用荧光染料直接标记探针RNA的3'端，检测
到了特异的DNA，1988年Giovnanoni[2]等将FISH技术引进到了细菌学，他第一次用放
射性同位素标记已知的rRNA寡核苷酸探针进行细菌的显微镜观察，随后该技术在系统发
育微生物学、微生物生态学、微生物的诊断和周围环境的研究中得到了迅速的发展。目前在
单一样品(如纯培养菌种)检测中的应用已十分普遍，准确度较高［3，4］，但在复杂样品
(如活性污泥)检测中的应用仍不成熟，易受到样品中所含杂质的影响，出现假阳性或假阴
性信号［5］。本文采用细菌通用探针EUB338，结合DAPI全细胞染色技术，探讨了针对活
性污泥样品的荧光原位杂交实验方法，并对自发荧光和真实信号的辨别要点进行了讨论。
[7]BaumanJGJ，WiegantJ，emicalhybridizationwith
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［8］GiovannoniSJ，DeLongEF，OlsenGJ，eneticgroup-specific
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［4］任艳红.降解五氯酚厌氧生物反应器微生物种群结构的分子特性研究［M］.浙江:浙
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［5］王明义，袁晓燕，宋雪珍，等.荧光原位杂交法在检测硫酸盐还原菌中的应用［J］.
中国现代医学杂志，2008，18(3):302-304.
荧光原位杂交技术结合分子生物学的精确性和显微镜的可视性,可进行微生物的空间分布
情况分析和特征性微生物的鉴定与定量分析。1989年,DeLong首次将荧光标记寡核苷酸探
针应用于检测单个微生物细胞[3],开创了应用于微生物生态学的先河。由于该法操作容易、
安全、检测迅速,目前已广泛应用于环境微生物生态学[4,5]和食品学[6]等领域,成为研究
微生物群落最具生命力的技术之一。
[1]ChoiB.K.,PasterB.J.,DewhirstF.E.,等.Diversityofcultivableanduncultivableoral
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[3]DeLongE.F.,WickhamG.S.,PaceN.R..Phylogeneticstains:ribosomalRNAbasedprobes
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SimonNathalie[25]等在2002年利用FISH技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间的相互作
用;ArayaRuben[26]等在2003年对溪流中和水中生物膜上的微生物群落进行了FISH研究。
McnamaraChristopherJ[27]等利用FISH技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和
不可培养的细菌群落进行了分析。应用FISH技术不仅能研究微生物群落结构的特征,还可以
跟踪微生物种群的动态变化。LiuJ[28]等在2002年利用FISH技术监测了河流中微生物群落
的动态变化,并利用此技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种以及一些新的微生物信
息。FISH技术也被用于监测环境中的微生物群落动态,如季节变化对高山湖水微生物群落的
影响、原生动物的摄食对浮游生物组成的影响等。此外,我们不仅可以更准确地了解不同环
境下微生物群落中各种功能菌群的组成比例,而且对不同功能菌群的相互作用有了更直观的
认识。研究表明,自然界中在空间上聚集在一起的不同微生物类群大都在代谢上互惠互利
[28]。总之,FISH技术在国内外环境微生物监测中已得到较为广泛的应用,技术水平日趋成熟。
[25]SimonNathalie,csofattachmentofpotentiallytoxicteriato
Alexandriumtamarense[J].AquaticMicrobialEcology,2002,28:249-258.
[26]ArayaRuben,TaniKatsuji,ialactivityandcommunitycomposition
instreamaterandbiofilmfromfriverdeterminedbyfluorescentinsituhybridizationandDGGE
analysis[J].FEMSMicrobiologyEcology,2003,43:111-119.
[27]McNamaraChristopherJ,LemkeMichaelJ,ableandnonculturable
fractionsofbacterialpopulationsinsedimentsofaSouthCarolinastream[J].
Hydrobiologia,2002,482:151-159.
[28]LiuJ,alchangesinthebacterioplanktonofarNortheastOhio(USA)
River[J].Hydrobiologia,2002,489:151-159.
近几年来,分子生物学技术和现代分析技术快速地向环境工程领域渗透,为废水处理系统
中的微生物生态结构和功能解析提供了强大的技术支持1。目前,应用于污水处理系统中微生
物生态群落解析的主要技术:16s和23SrDNA分子克隆技术、荧光原位杂交技术、变性梯度
凝胶电泳技术、温度梯度凝胶电泳技术、微生物呼吸醒分析技术以及微电极探测技术等。
这些技术在环境中的应用大大促进了微生物生态分析技术的发展,
并将推动对环境工程的机理和调控研究。
[1]WildererP,BungartzHJ,LemmerH,WagnerM,KellerJ,scientificmethodsand
theirpotentialinwastewaterscienceandtechnology[J].WaterRes,2002,36(12):370-393
FISH技术不仅提供静止的实验结果,还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化,可以
检测季节更替对高山湖泊中微生物群落的影响。LiuJ,LeffLG在2002年利用此技术监测了
河流中微生物群落的动态变化[5]。利用FISH技术得到了一些在人工条件下很难培养的菌种
以及一些新的菌种信息。GirgusPR,DelongEF在2002年用厌氧富集的方法从深海沉积物
中培养到一些古菌,随后使用FISH技术对这些古菌进行了鉴定[6]。McnamaraChristopherJ,
LemkeMichaelJ,LffLauraG利用FSH技术对美国卡罗莱纳州南部溪流沉积物中可培养和
不可培养的细菌群落进行了分析[7]。所有这些研究对于人们理解环境
中微生物种群的组成和动力学都有极大的重要性.
[5]LiuJ,LeffLG,TemporalchangesinthebacterioplanktonofaNortheastOhio(USA)River,
Hydrobiologia,2002,489:151～159.
[6]GirguisPR,DelongEF,Anaerobicenichmentofmethane-oxidizingarchaealbacterial
ctsoftheGeneralMeetingoftheAmerican
SocietyforMicrobiology,2002,102:327.
[7]McamaraChristopherJ,LemkeMichaelJ,ableandnon-culturable
fractionsofbacterialpopulationsinsedimentsofaSouthCarolinastream,Hydrobiologia,2002,
482:151～159.
上世纪80年代末至90年代以来,分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分
析,且发展迅速,研究的焦点集中在具有保守序列的16SrRNA上。研究方法包括分子杂交
法、PCR法、SSCP法、DGGE法、TGGE法、RFLP法、ERIC-PCR法和克隆基因文库分析法
等,具有很高的灵敏性,与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的
优越性,推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是,这些基于PCR的方法可能会在扩增
反应中引入误差,降低所得信息的精确度。荧光原位杂交(FISH)作为一种不依赖PCR的分子
分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充,它结合了分子生物学的精确性和显微镜的
可视性信息,可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体,同时对微生
物群落进行评价。目前,FISH技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物物学中,已成
为微生物群落研究的重要技术手段,对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确
鉴定也变得越来越重要,为污染治理和防治提供了新的思路和方法。
1荧光原位杂交技术的发展
1969年,Pardue等[2]和John[3]两个研究小组开发了原位杂交技术,用放射性同位素标记
的DNA或28SrRNA与爪蟾卵细胞制备物进行杂交,进行显微放射自显影检测。这一技术
可以在保持细胞形态完整的条件下,检测出细胞核酸序列,自此,原位杂交技术在染色体进
化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。1988年,
Giovannoni等[4]首次将FISH技术引入细菌学研究中,使用放射性标记rRNA寡核苷酸探
针检测微生物。随着荧光标记的发展,非同位素染料逐渐代替了放射性标记。1989年,
Delong[5]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。与放射性探针相比,荧光探
针更安全,具有较好的分辨力,不需要额外的检测步骤。此外,可用不同激发和散射波长的
荧光染料标记探针,在一步反应中同时检测几个靶序列。在短短的十几年中,由于FISH技
术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生
物学研究的有力工具。
2PardueML,larhybridizationofradioactiveDNAtotheDNAofcytological
peparations[J].ProcNatlAcadSciUSA,1969,64:600～604
3JohnH,BirnstilelM,:DNAhybridsatthecytogeneticallevel[J].Nature,
1969,223:582～587
4GiovannoniSJ,DeLongEF,OlsenGJ,eneticgroup-specificoligodeoxynucleotide
probesforidentificationofsinglemicrobialcells[J].JBacteriol,1988,170:720～726