试剂盒说明书
团员学习心得-咏怀八十二首
2023年3月16日发(作者：艰苦奋斗歌)默克生命科学服务热线
默克生命科学服务热线：：4008208872
bioteam@
产品使用说明书
BCA蛋白定量试剂盒
试剂盒简介
以下货号试剂盒可参照此说明书操作：建议同时参考本说明书英文原文（说明书编号TB380）。
BCAProteinAssayKit：500/2500rxn货号71285-3
BCA蛋白定量方法是基于双缩脲反应，即在碱性溶液中蛋白将Cu
2+
还原成Cu
1+
，而根据检测到的单价Cu离
子的浓度可以检测体系中对应蛋白的量。Bicinchoninicacid是一种显色剂，可以螯合被还原的铜离子，产生
一种在562nm有强吸收的紫色复合物。Novagen的BCA试剂盒可以用于测定浓度在20-2,000µg/ml范围内的
蛋白的浓度，根据样品量分为标准型和微型两种形式进行测定。试剂盒提供的组分足够用于500次标准型反
应（50µl蛋白样品加上1ml反应试剂）或2,500次微型测定（25µl蛋白样品加上200µl反应试剂，可以在96孔
板中进行高通量定量）。试剂盒中提供的BSA（牛血清白蛋白，2mg/ml）为用户制作标准浓度曲线提供了便
利。Novagen的BCA试剂盒准确度高，兼容性好，能与各种化学试剂和表面活性剂兼容，可以方便地配合默
克Novagen的BugBuster
®
，PopCulture
®
，CytoBuster™，Reportasol™和InsectPopCulture抽提蛋白的细胞
裂解试剂一起使用。有些化学成分，例如螯合剂，强酸、强碱、还原剂等，可能会干扰BCA法采用的还原及
螯合定量过程，详细情况请看说明书后附列表。
试剂盒提供的组分
500mlBCA反应液（0.1MNaOH缓冲的bicinchoninicacid，碳酸钠，酒石酸钠，碳酸氢钠，pH11.25）
15ml4%硫酸铜
3×1mlBSA标准品（2mg/ml）
储存
室温存放。
相关配套产品
可以与默克Novagen各种蛋白抽提、纯化试剂盒配套使用。
BCA蛋白定量分析
制备BSA浓度标准曲线
下表是制备各稀释梯度的BSA标准液的方法。每个标准液都需要使用一个新的试管。为了尽量保证定量的准
确性，建议采用与蛋白样品一样的缓冲液来稀释、配制BSA标准液。如果缓冲液中有干扰BCA法的成分，建
议用去离子水替代样品的缓冲液，用以配制BSA浓度梯度标准液做标准曲线。
制备浓度梯度BSA标准液
试管编号BSA的体积稀释液的体积BSA的终浓度
1
从2mg/ml溶液中取250ul
250ul1000ug/ml
2
从管1中取250ul
250ul500ug/ml
3
从管2中取250ul
250ul250ug/ml
4
从管3中取300ul
300ul125ug/ml
5
从管4中取100ul
400ul25ug/ml
60400ul0ug/ml
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加强型检测的BSA浓度梯度标准液的制备
试管编号BSA的体积稀释液的体积BSA的终浓度
1
从2mg/ml溶液中取100ul
700ul250ug/ml
2
从管1中取400ul
400ul125ug/ml
3
从管2中取300ul
450ul50ug/ml
4
从管3中取200ul
200ul25ug/ml
5
从管4中取100ul
400ul5ug/ml
60400ul0ug/ml
BCA蛋白定量的工作液的制备
下表给出了BCA工作液的制备建议。工作液是以50份的BCA反应液与1份4%硫酸铜混合而成。
注意：标准型测定的BCA工作液的体积是每反应1ml；这对于小吸光杯（0.7ml）足够了，如果采用较大的
吸光杯，则需要3ml以上的BCA工作液。
BCA工作液的制备
每个样品×20
标准型定量
BCA溶液
1ml20ml
4%硫酸铜
20ul400ul
微型定量
BCA溶液
200ul4ml
4%硫酸铜
4ul80ul
定量的操作流程
以下提供了2种定量操作：标准型定量需要的蛋白样品较多（50ul），这种情况下BCA工作液与蛋白样品的
体积比是20:1，干扰定量的物质的影响会较小；微型定量需要的蛋白样品量较少（25ul），非常适合96孔板
式的高通量操作。此种情况下BCA工作液与蛋白样品的体积比是8:1，干扰定量的物质的影响相对会较大。
标准定量操作
1.吸取50ul标样或样品到标记好的试管中。
2.加入1mlBCA工作液。轻柔涡旋混匀。
注意：如果吸光杯测量时要求的溶液体积较大，反应体系体积可能需要增加到3.15ml（即3mlBCA工作液加
150µl标样或样品）。
3.
标准检测
标准检测：：在37°C孵育30min或室温放置2–16h。加强型检测
加强型检测
加强型检测：：在60°C孵育15min。
4.将试管冷却至室温。
注意：虽然在冷却至室温的过程中显示反应仍在继续，如果10min内进行读数蛋白浓度也不会产生误差。
5.在一个干净的吸光杯中加入1ml水，在波长562nm调零。
6.将待测液加入干净的吸光杯。
7.10min内测定并记录所有反应液的吸光值（A
562
）。
8.校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光值。
9.结合已知的BSA标样的量和校正过的吸光值画出标准曲线。
10.参照标准曲线，根据各蛋白试样的校正吸光值，在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。
11.根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。
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微型定量操作
微型定量操作
1.吸取25ul标样或样品分别加入到96孔板的各孔中。
2.每孔加入200ul的BCA工作液。摇晃混匀30s，盖住各样品孔。
3.
标准检测
标准检测：：在37°C孵育30min或室温放置2–16h。加强型检测
加强型检测
加强型检测：：在60°C孵育15min。
4.冷却至室温。
5.在562nm吸光值。
注意：如果光度计没有配备562nm滤波片，波长在540–590nm范围的都可以使用。
6.校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光值。
7.比照已知BSA量制作的标准曲线读取蛋白浓度。
注意：如果机器附带提供标准曲线软件可以帮助获得最精确的结果。
8.参照标准曲线，根据各蛋白试样的校正吸光值，在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。
9.根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。
常见问题及改善建议
现象可能的原因改善建议
所有反应中都没有颜色产生样品中含有铜螯合剂
可对样品做透析、除盐或稀释处理
增加BCA工作液的铜离子浓度（例如可用
BCA溶液与4%CuSO
4
按50:2配制）
缓冲液中含有硫醇可对样品做透析或稀释处理
缓冲液中含有还原剂可对样品做透析或稀释处理
所有反应（包括空白对照）
都呈现深紫色
缓冲液中含有生物胺（例
如儿茶酚胺类物质）
可对样品做透析或稀释处理
波长设定不对
在562nm测吸光值；可以在540-590nm范
围测，但是灵敏度会降低
空白对照正常，但标准样和
试样吸光值都远远低于预期
样品处于较强的酸性或碱
性缓冲液中
可对样品做透析、除盐或稀释处理
样品中含有脂类或脂蛋白
样品中加入终浓度为2%的SDS以减少脂
质的影响吸光值高于预期
蛋白浓度过高稀释样品
试剂兼容性
不兼容试剂或物质
以下试剂或物质浓度很低时也会干扰BCA法进行定量，应该在样品中尽量避免出现。如果不能避免这些干
扰成分，应选用Non-InterferingProteinAssay™Kit（货号488250）以准确定量。这个表并不全面，还有
一些试剂和物质可能干扰定量未被列出。
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可兼容试剂
下表中列出了与BCA蛋白定量方法兼容的试剂或物质种类及其不干扰定
量的最大浓度数值。这个表并不全面，还有一些试剂和物质会或不会干
扰定量未被列出。