小干扰rna

小干扰rna

中班家访记录表-兰亭集序原文

2023年3月16日发(作者：天电)

RNA干扰中小干扰RNA的设计原则

王志勇;吕延成

【摘要】RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA介导的一种高度保守的

序列特异性基因表达调控机制,主要通过小干扰RNA(siRNA)和微小RNA发挥作用.

由于其具有高效、高特异性、作用稳定等特点,已被广泛地应用于基础实验和疾病

治疗的研究中.在进行siRNA介导的RNAi实验时,如何设计高效、特异性抑制靶

mRNA的siRNA是实验成败的关键.

【期刊名称】《医学综述》

【年(卷),期】2010(016)005

【总页数】3页(P675-677)

【关键词】RNA干扰;小干扰RNA;设计原则

【作者】王志勇;吕延成

【作者单位】遵义医学院珠海校区免疫学教研室,广东,珠海,519041;遵义医学院珠

海校区免疫学教研室,广东,珠海,519041

【正文语种】中文

【中图分类】R34

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是近年发展起来的一项新技术,是将与内

源mRNA同源的小片段外源双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)导入细胞,

导致特定基因表达沉默,其中21～23nt的小干扰RNA(shortinterference

RNA,siRNA)是RNAi的重要效应分子。RNAi技术的应用关键在于siRNA的合理

设计和有效转运系统。

1RNAi与siRNA

早在20世纪90年代初,RNAi现象就于转基因植物的研究中被发现,只是一直无法

给出明确的解释。1998年,Fire等[1]在线虫体内通过实验证实其是由dsRNA引起

并首次提出了RNAi的概念。之后,随着研究的不断深入,认为在植物中发现的共抑

制和转录后基因沉默、真菌中的基因压制等与之相似,都是以内源性或外源性

dsRNA触发的、以小分子RNA——siRNA和微小RNA为效应因子的基因表达调

控机制。RNAi曾被认为是真核生物所特有,但最近有学者提出异议,Makarova等

[2]利用生物信息学的方法,通过比对NCBI数据库中古细菌和细菌的基因数据,预言

了在原核生物中也存在与之类似的RNAi机制。

siRNA是RNAi的主要效应分子之一,其产生依赖于核糖核酸内切酶Ⅲ家族中的

Dicer酶[3]。在Dicer酶的作用下,异常DNA或RNA转化而来的或人工导入的

dsRNA被切割成21～23nt大小,5′端为磷酸基团,3′端为羟基且凸出两个悬垂碱基

的初级siRNA,初级siRNA又可作为引物,以未被RNA诱导的沉默复合体(RNA-

inducedsilencingcomplex,RISC)剪切的信使RNA(messengerRNA,mRNA)为

底物,由RNA介导的RNA聚合酶指导合成次级siRNA,这种放大效果是RNAi高

效性的原因之一。siRNA形成后,可以从转录、转录后及翻译3个水平发挥其作用,

其中转录后水平是主要途径。siRNA与被ATP激活的RISC结合,随后双链解开,在

其反义链指导下识别、降解与其同源互补的mRNA而使目的基因沉默[4]。大量实

验证明,针对同一靶基因设计的不同siRNA作用效果差别很大,究其原因,在于

siRNA的沉默效率受靶mRNA序列和自身序列等诸多因素的影响。这就要求实验

者在设计siRNA时应借助生物信息学、计算机等多种辅助手段进行综合分析,优化

其序列结构,从而得到较高沉默效应的siRNA。

2靶mRNA的结构对siRNA作用效果的影响

目前RISC如何识别mRNA上的相应靶点尚未确定,但mRNA的局部序列对

siRNA的沉默效率有重要影响。首先,mRNA上部分序列结合的调控蛋白可通过影

响RISC与siRNA的结合而降低RNAi的效果。在筛选siRNA作用于靶基因的位

置时,一般应避开富有调控蛋白结合区域的5′非编码区和3′非编码区,从起始密码子

下游50～100nt开始搜索[5]。但也有实验证实:5′非编码区作为一个高度保守的

区域,针对其设计合成的siRNA也能具有较高的沉默效果[6,7]。其次,为防止靶序

列单个碱基变异而影响沉默效果,要避开其单核苷酸多形性区域。另外需要注意的

是,RNA的单链结构决定了它序列上的部分核苷酸可互补配对,所形成的空间结构可

以影响siRISC与靶mRNA的结合。

mRNA的靶点可及性对沉默效率的影响已被越来越多的实验所证实,而由于实验方

法和条件的限制,目前只能从理论上对mRNA的二级结构进行预测。在众多的预测

方法中,Luo等[8]提出的“氢键指数”法可以较方便且全面地反映靶mRNA的二

级结构。由于靶mRNA上的核苷酸会彼此形成氢键,而形成氢键数目少的靶

mRNA理论上更容易被siRNA所结合。所以,可以用“氢键指数”来量化mRNA

的二级结构,其计算公式为:

其中,i表示对应靶基因区间的核苷酸序数,PH-bond-formation是i个核苷酸与同

一条mRNA中其他核苷酸形成键的可能性,其公式为PH-bondformation=1-第i

个核苷酸为单链形成的结构数/mRNA所有可能的二级结构数,NHB是第i个核苷

酸可以形成的氢键数,如果是G或C,其等于3,如果是A或T,其等于2。

3对siRNA自身序列的要求

3.1siRNA序列的长度一般来说,siRNA长度为21～23nt,也有学者报道在RNAi

途径中,27nt的siRNA作为效应分子,其效果优于21～23nt的siRNA,不仅所需

浓度仅为21ntsiRNA的1%,沉默效率也成倍增长,但其机制现在尚不明确,可能因

为它们直接与siRNAs相结合后进入到RISC发挥沉默作用[9]。

3.2siRNA序列中碱基偏好性的选择siRNA作用机制的复杂性决定了其双链各个

位置上的碱基必然具有一定的偏好性。Reynolds等[10]在总结了针对萤火虫荧光

素酶和人类亲环蛋白B设计的180条siRNA的沉默效率的基础上,于2004年提

出设计高效siRNA的8条理性原则:①GC含量在30%～52%；②正义链15～19

位最少有3个A或U；③避免出现重复倒置序列；④正义链19位为A；⑤正义

链3位为A；⑥正义链10位为U；⑦正义链19位非G或C；⑧正义链13位非

G,以上原则与siRNA的作用机制密切相关。较低的C/G含量有利于siRNA双链

的解开,但太低的C/G含量则又影响反义链与靶mRNA分子的结合,所以C/G含量

应均衡在30%～52%。正义链3′端富含A或U,即3′端低稳定性对于阻止其结合

进入RISC具有积极意义,而与之互补的反义链5′端稳定性低,则有利于其定向解旋

并与RISC结合而发挥沉默作用。因为siRISC在切割降解靶mRNA分子时,其部

位大约相当于反义链5′端的10～11位,而siRISC最容易切割的是U的3′端(其次

是C,最后是A/G),所以当正义链10位为U时,RISC对靶mRNA分子的切割效果

最好。

3.3siRNA序列结构的要求siRNA序列中应避免单一连续碱基的出现,因为连续3

个以上的G或C可能会形成四联体而影响siRISC的形成和功能[11]；siRNA链内

不能存在重复或回文序列,否则正义和反义链都有可能形成发夹结构而影响siRNA

双链的形成。有实验表明富含UG基序的siRNA能够诱导机体产生强烈的免疫反

应,因此,在设计siRNA时,应避免出现较多的UG序列[12-14]。而采用RNA聚合

酶Ⅲ的启动子进行实验时,连续4个以上A或T会被误认为是转录终止信号而停止

转录[15]；选择的启动子不同,其转录产物的第1个碱基也不同,如U6启动子一般

要求两条链的转录产物的第1个碱基为G[16]。经Dicer作用生成的siRNA,其双

链3′末端悬垂2个碱基,且可以被其他碱基替换,但3′末端突出碱基不能为G,因为

RNA酶会降解以G为末尾的RNA单链。

3.4siRISC作用过程中的热动力学参数siRISC作用的机制包括siRNA与RISC的

结合、siRISC的组装形成、siRISC与目的mRNA的结合、靶点识别和靶mRNA

的降解、产物的释放及RISC的循环再利用。其中最关键的是siRISC的组装形成

和靶点识别及靶mRNA的降解。有关的热动力学参数主要包括:①siRNA反义链5′

端与3′端的能量差。RISC负责结合siRNA并使之双链解旋,而RISC从哪条链的5′

端定向解旋并与之结合取决于该链两端热动力学稳定性的差异。故在进行siRNA

设计时,应使反义链5′端在能量上比其3′端高,即稳定性比3′端差,使反义链5′端在

能量上比其3′端低,这样更有利于功能性siRISC的形成[17]。②目标mRNA的可

及性参数。氢键指数用于量化mRNA的二级结构来预测目标mRNA的可及性。

还有siRNA反义链与目标mRNA的结合能,该值越大,表明二者结合的越稳定、

siRISC的活性也就越高。③siRNA反义链第9～14位的内部能量稳定性的均值。

靶mRNA的切割点位于siRNA反义链5′端上游10～11位,其周围碱基的能量应

该保持在一个较高的水平,以便于RISC复合体对靶mRNA分子进行降解。

3.5siRNA介导的脱靶效应和碱基错配除了长dsRNA进入体内激活的蛋白激酶R

等途径外,siRNA与靶mRNA部分互补时可以引起RNAi的脱靶效应,按照RNAi

的机制,siRNA与目标mRNA不完全互补时,可以微小RNA式的作用方式通过抑制

翻译引起脱靶效应。脱靶的程度与互补碱基所处位置有关,当siRNA反义链的种子

区与靶mRNA,尤其是3′非编码区完全互补时,发生脱靶效应最为明显,所以在进行

siRNA设计时,应尽量减少siRNA反义链的种子区与靶mRNA3′非编码区的互补

程度,以提高siRNA的特异性[18,19]。siRNA发挥作用时可能会有碱基的错配,发

生错配的位置和数量不同,对沉默效率的影响也不同。在siRISC中起重要作用的反

义链的种子区若发生错配,会极大地影响沉默的效率。两端碱基错配中5′端错配的

影响较3′端小,＞2个碱基的错配也会严重降低沉默效率。

3.6各种化学修饰对siRNA沉默效率的影响对siRNA序列进行化学修饰是十分必

要的。在Dicer作用下生成的2′-OH基团增加了siRNA的水解性,加上活体内核

酸酶的降解作用,因而其稳定性较差,化学修饰可以提高siRNA在生物体内的稳定性,

延长它的半衰期,更为重要的是通过化学修饰可以显著降低脱靶效应等非特异性反

应。常用的化学修饰包括末端修饰、化学基团修饰和核苷酸修饰等。在进行化学修

饰时,需要注意与siRNA沉默效率有关的一些问题。首先,正义链和反义链的3′端

以及正义链的5′端进行封端反应或化学基团修饰对siRNA的沉默效率影响不大,并

且对正义链5′端的修饰还可以阻止正义链进入RISC从而促进siRISC的形成,但反

义链的5′端必须保留一个自由的羟基或磷酸基团。第二,正义链和反义链的第2个

碱基都可引入一个小的疏水基团进行修饰(如2′-O-甲基化)。正义链的2′-O-甲基

化可以通过防止5′端磷酸化而阻止其进入RISC。反义链的2′位置对于靶基因的沉

默影响不大,但对于脱靶基因的剔除却是必需的。当只有反义链的种子区与靶

mRNA完全互补时,其5′端提供相应位点供RISC中的AGO2蛋白识别,并以此通

过与AGO2蛋白相互作用引起脱靶基因的沉默。2′-O-甲基化可以抑制AGO2蛋

白的结构重排进而降低脱靶反应的发生,正义链的2′位置甚至可以引入大的疏水基

团,但反义链却是不允许的。第三,可以在siRNA的两条链上引入硫代磷酸基团而增

加其结构稳定性,但需要注意的是在动物体内大量引入可发生毒性反应。最后,对

siRNA进行功能基团的修饰在结构上不能发生在螺旋表面的大沟上,因为会抑制

RNAi的发生。

4siRNA特异性的检验

为保证研究组siRNA只特异性地沉默靶mRNA,而与其他基因之间不发生交叉反

应或发生反应的可能性最小,需要将所设计的siRNA用同源性软件进行筛选。一般

使用美国NCBI的EST或Unigene数据库进行BLAST同源性对比,排除那些与非

目的基因具有多个同源碱基的siRNA,以防止出现siRNA的非靶基因抑制效应。但

也有学者通过实验发现,通过同源性软件进行相似性检索对于确保siRNA的特异性

并无实质性作用[20],这就对于siRNA现有的特异性检验方法提出了质疑。

5结语

随着RNAi技术的迅速兴起,在基因功能分析、药物靶点筛选、疾病治疗等方面为

人们提供了更多的新思路,而如何设计具有最大靶向特异性的siRNA是RNAi实验

成败的关键。目前尚无siRNA设计的金标准,所以只能从各方面综合地进行分析,借

助多种辅助手段加以完善。相信随着对siRNA机制研究的不断深入,这一难题终将

得到解决。

参考文献

[1]FireA,XuS,MontgometryMK,andspecificgenetic

interferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditis

elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[2]MakarovaKS,GrishinNV,ShabalinaSA,iveRNA-interference-

basedimmunesysteminprokaryotes:computationalanalysisofthe

predictedenzymaticmachinery,functionalanalogieswitheukaryotic

RNAi,andhypotheticalmechanismsofaction[J].BiologyDirect,2006,8(1):7.

[3]nse-RNAregulationandRNAinterference[J].Biochim

BiophysActa,2002,1575(1/3):15-25.

[4]nterteringRNAsasatoolforcancergene

therapy[J].CancerGeneTherapy,2005,12(3):217-222.

[5]ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,esof21-nucleotide

RNAsmediateRNAinterferenceinculturedMammalian

ells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[6]DoenchJG,PetersenCP,canfunction

asmiRNAs[J].GenesDev,2003,17(4):438-442.

[7]EckmannCR,KraemerB,WickensM,-3,abicaudal-Chomolog

s[J].Dev

Cell,2002,3(5):697-710.

[8]LuoKQ,e-silencingefficiencyofsiRNAisstrongly

dependentonthelocalstructureofmRNAatthetargeted

region[J].BiochemBiophResCommun,2004,318(1):303-310.

[9]KimDH,BehlkeMA,RoseSD,ticdsRNADicer

substratesenhanceRNAipotencyandefficacy[J].Nat

Biotechnol,2005,23(2):222-226.

[10]ReynoldsA,LeakeD,BoeseQ,alsiRNAdesignforRNA

interference[J].NatBiotechnol,2004,22(3):326-330.

[11]ShiraneD,SugaoK,NamikiS,ticproductionofRNAi

librariesfromcDNAs[J].NatGenetics,2004,36(2):190-196.

[12]SledzCA,HolkoM,VeerMJ,tionoftheinterferonsystemby

short-interferingRNAs[J].NatCellBiol,2003,5(9):834-839.

[13]HornungV,GuenthnerM,BourquinC,ce-specificpotent

inductionOfIFN-αbyshortinterferingRNAinplasmacytoiddendriticcells

throughTLR7[J].NatMed,2005,11(3):263-270.

[14]JiangW,SunR,WeiH,-likereceptor3ligandattenuatesLPS-

inducedliverinjurybydown-regulationoftoll-likereceptor4expression

onmacrophages[J].ProcNatAcadSciUSA,2005,102(47):17077-17082.

[15]KasaharaH,lencingusingadenoviralRNAiVectorin

vascu1arsmoothmusclecellsandCardiomyocytes[J].MethodsMol

Med,2005,112(3):155-172.

[16]ScherrM,MorganMA,lencingmediatedbysmall

interferingRNAsinmammaliancells[J].CurrMedChem,2003,10(3):245-256.

[17]SchwarzDS,HutvagnerG,DuT,tryintheassemblyofthe

RNAienzymecomplex[J].Cell,2003,115(2):199-208.

[18]JacksonAL,BurchardJ,SchelterJ,read

siRNA′offtarget′transcriptsilencingmediatedbyseedregionsequence

complementarity[J].RNA,2006,12(7):1179-1187.

[19]-mediatedgenesilencinginnon-human

primates[J].Nature,2006,441(7089):111-114.

[20]BirminghamA,AndersonEM,ReynoldsA,etal.3′UTRseedmatches,but

notoverallidentity,areassociatedwithRNAioff-targets[J].Nat

Methods,2006,3(3):199-204.