免疫印迹法
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2023年3月16日发(作者：ISshp)1/5
实验三：免疫印迹
1原理
免疫印迹又称Western印迹(Westernblotting)，与DNA的Southern印迹技术相
对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，
然后用探针检测特异性组分。不同的是，Westernblotting所检测的是抗原类蛋白质
成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生
特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优
点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中
检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的
水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Westernblotting广泛用于蛋白质研究、
基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和固相
基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2湿法：
将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜
课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜
两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体
孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二
抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化
的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2试剂与仪器
2.1试剂（所有试剂均供两组用）
2.1.1转移缓冲液
Tris3.025g
甘氨酸14.413g
甲醇20mL
加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL
2.1.2Tris缓冲盐溶液(TBS)
Tris2.42g
NaCl27.750g
2/5
加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL
2.1.3TTBS
TBS800mL
Tween-20400μl
2.1.4封闭液及抗体稀释液
脱脂奶粉0.3g
TBS100mL
2.1.5底物溶液
二氨基联苯胺（DAB）5.0mg
TBS18mL
H
2
O
2
20μl临用前配
2.1.6丽春红总蛋白质染色液
丽春红1g
4%乙酸100mL
2.1.75%小牛血清生理盐水
小牛血清7.5mL
0.85%生理盐水定容至150mL
2.1.8酶标抗IgG（1：1500）
酶标抗IgG0.1mL
5%小牛血清生理盐水定容至150mL
2.2仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊
子，刀片，微量移液枪，普通滤纸
3试验步骤
3.1SDS-PAGE电泳分离
所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。不同之处如下：
3.1.1样品制备：取人血清0.1ml，加稀释5倍的上样缓冲液0.5ml，振摇后
10000rp/5min离心，取80μl上清液加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热
3min。瞬间离心，取上清液上样。
3.1.2加样：拔出梳子，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。上样量从左到右为5、
20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5μl（从中间分开，两侧对称）。
3.1.3电泳：稳流10mA电泳，当溴酚蓝指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停
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止电泳。取出胶，将点有样品的胶条从中间切成两条，一条用常规方法染色和脱
色，另一条用于转移和酶联。
3.2转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移）
3.2.1切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。
3.2.2剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
3.2.3打开转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵；b.一张用转移缓冲液
饱和的滤纸；c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡；
d.硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；e.一
张用转移缓冲液饱和的滤纸；f.一张浸湿后的海绵。
3.2.4小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。
3.2.5插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开关调
至稳压60v，电泳2h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
3.3膜的酶联免疫染色
3.3.1用丽春红溶液检验转移是否成功，若显色清楚，用蒸馏水冲洗，TBS洗膜
1min。
3.3.2将膜放入培养皿中。加封闭液后在37℃摇床上摇动60min。
3.3.3取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min，将膜放入另一个培养皿中。
3.3.4在培养皿中加入用150ml5％小牛血清生理盐水配制的1：1500的酶标IgG，
在冰箱中
振荡过夜。
3.3.5取出膜，用TTBS洗3次，每次3min，最后用TBS溶液洗1次，以去除
Tween-20。
3.3.6将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，取出膜，将胶制成干板。
4实验结果
4.1SDS-PAGE电泳分离结果（图1右）
上样量为10μl的泳道分离效果较5μl的泳道好，共出现4个较清晰的条带。
4.2显色后的免疫印迹膜（图1左）
在免疫印迹膜上共检测出一条带C
1
，应该为球蛋白，对应于右图中的C。
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图1：SDS-PAGE电泳分离结果（右图）和显色后的免疫印迹膜（左图），图上所标的数字分
别为每一个泳道的上样量（单位/μl）
5讨论
5.1本实验所用的样品是人血清，人血清的成分非常复杂，BioPharmInternational
（2003）报道：MelecularandCellularProteomics2002年12月号发表的一篇论文
称，人血清中已确证的蛋白种类几乎翻了一番，即达到490种。这是Pacific
NorthwestNationalLaboratory（PNNL）的科学家利用液相层析法和质谱分析法代
替传统凝胶电泳法鉴定的成果。这些人血清蛋白包括了先前在血清中未鉴定出来
的低丰度蛋白，以及尚未明功能的蛋白。由于方法的限制，我们所用的传统电泳
方法根本不可能完全分离。
5.2血清中的蛋白主要是由白蛋白与球蛋白所构成。健康人的白蛋白与球蛋白的
比例为白蛋白约67％，球蛋白约33%。所以图1右中条带较深的蛋白质（C）应
该为球蛋白，图1左中被检测的条带（C
1
）恰好是这条较深的条带，说明被检测
的蛋白就是免疫球蛋白G（IgG）。这样图1左的免疫反应结果也得到合理的解释，
但是决定性的结论应从两种蛋白在SDS-PAGE电泳中的迁移率进行分析，但是尚
未得到此方面的资料。
5.3本实验所用的免疫印迹方法称酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent
assay,ELISA），其方法简单，方便迅速，特异性强。ELISA是由抗原（抗体）先
结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成
的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载
C
C
1
人血清蛋白
105/μl
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体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反
应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。并且抗原
与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反
应。
5.4IgG即免疫球蛋白G，与IgM和IgA属三种同种型天然自身抗体。酶标记抗
体IgG是将酶与抗IgG抗体经适当方法连接而成。由于辣根过氧化物酶(Horseradish
Peroxidase,HRP)活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP的
催化反应需要底物过氧化氢(H
2
O
2
)和供氢体(DH
2
)。本实验所用的供氢体DAB(3.3
－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶
染色。由于HRP的底物H
2
O
2
本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H
2
O
2
不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H
2
O
2
已消耗殆尽）。
这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
5.5BSA和奶粉中常污染有IgG，但是使用Tween-20作封闭剂可以有效减少这些
因素带来的干扰。
5.6转移之后，蛋白质在硝酸纤维素膜两面分布不完全相同，因此显色反应同时
注意两面的信号。