异丙基

异丙基

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2023年3月16日发(作者：李兰花)

IPTG诱导蛋白表达全面介绍

IPTG全面介绍：优点·使用·配制·特点

摘要:异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细

菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG常用于需要诱导β-

半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal或Bluo-Gal结合使用，用

于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac操纵子在大肠杆菌

中的表达。IPTG与lacI阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防止

β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的抑制。

中文名：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)

英文名称：Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

用途：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被

细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。IPTG常用于需要诱导

β-半乳糖苷酶活性的克隆实验。它常与X-Gal或Bluo-Gal结合使用，

用于重组细菌菌落的蓝白筛选，这些菌落可以诱导lac操纵子在大肠杆

菌中的表达。IPTG与lacI阻遏蛋白结合并改变其构象而发挥作用，防

止β-半乳糖苷酶编码基因lacZ的抑制。

使用方法：首先把IPTG配制成23.83mg/ml(100mM)的水溶液，

并进行过滤除菌后保存。然后在100ml的琼脂培养基中，加入100μl

的上述溶液、200μl的X-Gal(20mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)

和100μl的Amp(100mg/ml)，制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培

养基。当dna片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因

载体)，然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、

Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重

组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。

配制方法：在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至

10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

优点：

1.能诱导酶的合成，但又不被分解的分子，称为安慰诱导物。由

于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问

题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。

不被菌体代谢，为乳糖类似物，一旦进入细胞就会产生持

续长久的诱导效果，所以IPTG的诱导效率高，往往只需要很少量

(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢，在胞内专一

诱导外源蛋白的表达。不受细胞代谢的影响，诱导效果持续稳定。乳

糖有双效作用，既能做为诱导剂异乳糖的前体物质，又可以做碳源，

在诱导过程中，很不稳定，IPTG因其优异的稳定性决定了它适合做实

验研究用。

能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。

4.半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖

苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为β–半乳糖

苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。

注意事项：培养噬菌体时，Topagar中的添加量为：25μl/3

ml(24mg/ml)。含有

IPTG的培养基4℃避光保存，须在1~2周内使用。

保存：2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个

月。远离热源及氧化剂。

IPTG诱导蛋白表达的原理.材料.实验方法

摘要:的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编

码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个

启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列

结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个

分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP

结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调

控

的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳

糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子

序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,

使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个

分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和

CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同

一调控区调节,实现基因产物的协调表达.在没有乳糖存在时,lac操纵子

(元)处于阻遏状态.此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋

白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动.当有乳

糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导.在这个操纵子(元)体系中,真正的诱

导剂并非乳糖本身.乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖.

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白

与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强

的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用.

材料：

1、诱导表达材料：

(1)LB(Luria—Bertani))培养基：

酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10g

NaCl10g琼脂(Agar)1-2%

蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0

适用范围：大肠杆菌

(2)IPTG贮备液：

2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0.22μm滤膜过滤除菌,分装成1

mL/份,-20℃保存.

(3)l×凝胶电泳加样缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH6.8)

50mmol/LDTT

2%SDS(电泳级)

0.1%溴酚蓝

10%甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料：

1)酶溶法

(1)裂解缓冲液：

50mmol/LTris-CI(pH8.0)

1mmol/LEDTA

100mmol/LNaCI

(2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF).

(3)10mg/mL溶菌酶.

(4)脱氧胆酸.

(5)1mg/mLDNaseI.

2)超声破碎法

(1)TE缓冲液.

(2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：

100mmol/LTris-HCI(pH8.0)

100mmol/LDTT

4%SDS

0.2%溴酚蓝

20%甘油

实验方案：

1、外源基因的诱导表达：

(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因.

(2)按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌.

(3)筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA作限制性内切核酸

酶图谱,DNA序列测定,

确定无误后进行下一步.

(4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子,则在30-32℃培养

数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至42℃继续培养

3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等,则37℃培养细菌数小时达

到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L.继续培养3-5h.

(5)取上述培养液1mL,1000g离心,1min,沉淀,加100μL聚丙

烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测.

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：

细菌的裂解

常用方法有：①高温珠磨法;②高压匀浆;③超声破碎法;④酶溶

法;⑤化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法①、②已在工业生

产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶

法和超声破碎法的实验步骤.

酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3-葡聚糖酶;β-1,6-葡聚糖酶;

蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶

对酵母作用显著.主要步骤为：

4℃,5000rpm离心,1

5min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL).弃上清,约每克湿菌

加3mL裂解缓冲液,悬浮沉淀.

试验进行到了IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE胶的环节，

首先，我获得了我的目的基因，与pET28a连接后，成功构建载

体。我进行了菌液PCR验证，质粒PCR验证，质粒双酶切验证，之后

是送去测序。所有的结果足够表明我已经构建载体成功了。

之后就是转化BL21表达菌株中。转到BL21表达菌株时间大概是

15年1月份左右，直到过年后回来开始摇菌，诱导，跑胶，问题就是

这时候出现的。

以下是我做试验的整个流程，望大神给些建议。

1、诱导与提取目的蛋白

①菌种活化。重组载体pET-28a-SAMDC和空质粒pET-28a的单

菌落，分别接种于25mLLB液体培养基（KanR）的试管中，37℃，

180r/min，过夜振荡培养。

②菌种扩培。取活化好的菌种按1%的量接种于100mL的LB液

体培养基（KanR），摇匀，37℃，200r/min，振荡培养3h。

③融合蛋白的诱导表达。向菌液中分别加入终浓度的IPTG（0.1、

0.5、1.0mmol/L）作诱导剂，37℃，180r/min，振荡培养4h（3、

4、5、6h）。

④目的蛋白的提取。

A.经诱导后取1mL菌液，4℃12000g，10min收集菌体;吸出菌

液，用0.5mL预冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩涡振荡使沉淀的

菌体复悬，4℃12000g，离心10min；再次吸出上清液，小心地吸净

管壁上的液滴，尽可能地使沉淀不带有残留的液体；加入100uL

ddH2O，漩涡振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来立即加入等体积的

1%×SDS磷酸缓冲液，继续振荡20s；超声波处理。超声处理为7min，

超3s，停10s，功率为75w。超声波处理后，样品4℃12000g，

10min，将上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分别加入等

体积的2×SDS凝胶上样缓冲液；快速离心，

将菌悬液收集在离心管底部，沸水浴中放置5min；分别取15uL

样品进行SDS-PAGE电泳检测。

图片即为SDS胶跑完后的状态。我的蛋白预测应该是在40kDa左

右，可是在40kDa左右处根本没有我的目的蛋白。反而在30kDa处

出现奇怪的条带...

做了几次都是这样的状态。同实验室的也有人在做这一步，她的

蛋白预测大小为38kDa，但是跑出来的胶跟我的一模一样。

还有一个同学她是前两次做成功了可以明显看到目的蛋白表达，

在60kDa左右，但是从大概4月份开始条带就没有了，我们一直找不

到原因，难道这个也是可以传染的？

去问实验室的小老师，老师说可能是我们IPTG诱导的时间有问题，

但是按照他说的方法重新试了也不行。难道是因为驯化时间太久所以

BL21这个菌太淘气了所以把我们的载体吐出去了？但是这种可能性也

不算大啊，我们也没有反复冻融，更何况我们重新验证了，BL21菌株

中确实有我们的质粒。现在真的是想不出来到底问题出在哪里。唯一

能想到的就是IPTG失效了，下次准备把所有的试剂都重新配一遍，再

重新来一次。还有别的什么原因会出现这样的情况么？如果胶做的不

对会使条带消失么？？求跪求谢

谢大家了。