荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验

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2023年3月4日发(作者：老鸭汤的做法)

双荧光素酶报告实验细胞转染详细步骤及说明

1.待测细胞在10cm培养皿中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用2ml

PBS洗涤

细胞两次；

2.加入2mlTrypsin-EDTAsolution,混匀后，37ºC放置1-5分钟；

3.小心吸去胰酶溶液，加入2ml完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；

4.血球计数板计数，将细胞稀释至1×106细胞/ml。按5×105细胞/孔的浓度

接种12孔板，混匀后于37ºC5%CO2培养24小时；

5.每1OD260microRNA用125μlDEPC-H2O溶解，终浓度约为20μM；

6.在1.5mlEP管中加入100μl无血清培养基，加入10μlmicroRNA，再加入

对应的双荧光报告载体1μg，混匀；取另一1.5mlEP管，加入100μl无血清

DMEM，加入4μllipofectamine2000，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，

室温放置20分钟；

7.实验分组：

验证分组为：C+WT；C+MUT；+WT；D.

miRNA+MUT；C+miRNAPC；+miRNAPC，各组设3

复孔；

8.吸去12孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入12孔板中，混匀后，在培

养箱中温育5小时；

9.吸弃转染液，加入500μl完全培养基。37ºC5%CO2继续培养24、48小

时，分别收样；

10.所得细胞用于双荧光素酶系统检测。