DNA克隆
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2023年2月27日发(作者：柴油机工作原理)(完整版)基因克隆步骤完整版
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1总RNA提取
(1)
液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用
(2)
将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温搁置
5min；翻开离心计预冷
(3)加200μL氯仿，振荡15sec，室温搁置3min，分层；
(4)4
o
C，12,000g，离心15min；
(5)取上清，加500μL异丙醇，混匀，室温搁置10min；
(6)4
o
C，12,000g，离心10min；
(7)弃上清，加1mL75%乙醇，飘荡清洗积淀，振荡充足；再用100%乙醇
冲洗
(8)4
o
C，7,500g，离心5min；
(9)弃上清，离心，用枪汲取剩余液体，放在超净台里干燥后，加50μLDEPC
水，－80
o
C保留。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶办理。提取的总RNA
需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的汲取
值，OD280值为蛋白的汲取值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量
在同意的范围内，可正常使用；别的还有OD230值为多糖和酚类的汲取值，比较洁
净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA浓度
（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。
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2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa企业的PrimeScriptRTreagent
withgDNAEraser(PerfectRealTime)说明书进行。其系统为：
TotalRNA
1μg
5×gDNAEraserBuffer2μL
gDNAEraser
1μL
RNaseFreedH2O
补齐至10μL
条件为：42
o
C，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。其系统为：
5×PrimeScriptBuffer（2forRealTime）4μL
PrimeScriptRTenzymemixⅠ1μL
RTPrimerMix
1μL
上一步的反响液
10μL
RNaseFreedH2O
补齐至20μL
操作条件为：
(1)37
o
C搁置15min；(2)85
o
C，5sec；(3)4
o
C保留。
3PCR
按TaKaRa企业的PremixTaqVersion2.0操作，，PCR反响系统以下：
PremixTaq
25μL
模板5μL
引物1(10μM)
1
μL
引物2(10μM)
1
μL
ddH2O
18μL
PCR反响条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C
延长30s，循环36次；72°C延长10min。
PCR反响完成，取5μL反响产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用
10μL反响产物）。
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4基因克隆及测序
4.1PCR产物切胶回收
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下察看并切下预期大小的
DNA片段。使用TIANGEN企业的UniversalDNAPurificationKit割胶回收试剂盒
进行纯化，步骤以下：
(1)均衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入采集管中）加入500μL均衡
液BL，13,400×g离心1min，倒掉采集管中的废液，吸附柱CB2从头套回采集
管中；
(2)按100mgagarose胶加入100μL溶液PC，置于50
o
C中10min左右，
半途混匀几次，至胶完整消融；
(3)将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入采集管中），室温下13,400
×g离心1min，倒掉采集管中的废液，吸附柱CB2从头套回采集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离
心1min，倒掉采集管中的废液，吸附柱CB2从头套回采集管中；
(5)重复上一步骤；
(6)将吸附柱CB2放入采集管中，室温下13,400×g离心2min，尽量除掉漂
洗液，将吸附柱置于室温搁置数分钟，完全晾干；
(7)将柱子套入一新的灭菌1.5mL离心管中，向吸附膜中间地点悬空滴加
50μL洗脱缓冲液，室温搁置2分钟，13,400×g室温离心2min，采集到的洗脱
液即为回收的DNA纯化液；
(8)取5μL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液
中DNA含量。
4.2目的片段与载体连结
(1)胶回收产物与T载体连结系统，参照Takara企业pMD18-T载体的试剂盒
说明书。在灭菌的0.5mL离心管中配制以下溶液（10μL）：
回收DNA4μL
LigationSolution
5μL
pMD18-TVector
1μL
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(2)16
o
C反响30分钟，所得产物保留于－4
o
C冰箱备用。
4.3连结产物转变5α
(1)将5μL连结产物加入到100μ5α感觉态细胞中，轻轻旋转离
心管混匀内容物，冰上静置30min；
(2)42
o
C水浴热激转变90sec，立刻放回冰上，搁置3min；
(3)每管加入500μLLB培育基（室温搁置），37
o
C160-180rpm振荡培育
45-60min，使菌体复苏并表达抗性基因；
(4)在含有Amp（100μg/mL）的选择性平板上加入60-100μL菌液，用无
菌涂布棒轻轻涂布平均后，用Parafilm膜封好；
(5)将培育皿正放，37
o
C约50min，待液体所有汲取后，倒置平板持续培育
10-16h。
4.4转变子的挑选及判定
(1)用无菌枪头挑取LB平板上3-5个单菌落，分别接种到3.5mLLB液体培育
基中（含100μg/mLAmp），37
o
C，165rpm振荡培育10-12h；
(2)用5μL菌液做模板，进行PCR判定（50μL系统），操作步骤同3。阳
性菌液由Invitrogen生物企业测序判定，余下的菌液4
o
C保留备用；
(3)测序结果在Genbank数据库中进行比对剖析。