pcr退火温度
定向越野游戏规则-低压开关
2023年2月20日发(作者：数学书六年级上册答案)PCR和RT-PCR
第三章增加RT-PCR特异性
起始cDNA合成
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影
响了所合成cDNA的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产
生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结
构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得
最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物
的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA
合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)
起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA3'端所发现的poly(A)尾
杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相
比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需
要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用
0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScriptRT-PCR
System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基
因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚
核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同
所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计
（见第五章）。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP
可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行
RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止
引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。
提高逆转录保温温度
为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。
热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP
退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，
GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以
在50℃或更高进行反应，（表2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图
10）。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移
到逆转录保温温度，并加入预热的2×反应混合液（cDNA合成热启动）。这有助
于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度
转换。
图10.逆转录温度对RT-PCR特异性的影响
使用ThermoScript™和设计用来同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP，由1μg
HelaRNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热的反应混合液中，使用Platinum
TaqDNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。
减少基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的
RNA分离方法，如TrizolReagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。
为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNase
Ⅰ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mMEDTA中65℃保温10
分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖
于镁离子的RNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分
开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比
来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录
的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录
时所得到的PCR产物来源于基因组。
第四章RT-PCR应用
5'和3'RACE
RACE（cDNA末端快速扩增，RapidAmpliphicationofcDNAEnds）是一种获
得转录本5'或3'未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性
的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3'
RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5'RACE）（图11）。RACE已经
被用于扩增和克隆稀有mRNA。RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备
探针或连接在一起得到全长cDNA。其中一个连接5'和3'RACE产物的方法是
使用由5'及3'RACE得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的cDNA。使
用RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真
的扩增，从而得到全长cDNA克隆。
5'RACE步骤概要
第一链引物，GSP1，同mRNA退火
使用SuperScriptⅡ将mRNA转录成cDNA
使用RNase混合物降解RNA
使用GlassMAX®SpinCartridge纯化cDNA
使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾
使用简并的锚定引物和巢式GSP2PCR扩增带有dC尾的cDNA
使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。
图11.5'RACE步骤概要
5'RACE比RT-PCR更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因
特异性的。5'RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续
条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用
锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物
扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产
物作为模板可以增加5'RACE的特异性（见第五章，巢式PCR）。增加逆转录
保温温度和PCR退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。
5'RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA3'末端抑制cDNA加尾（tailing）
的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板
产生连续条带。因为SuperScriptⅡ产生更多的全长cDNA，所以可以提高5'末
端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3'末端和发卡结构会
通过减少用于加尾的3'羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在
94℃并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入
DMSO辅助加尾（图12）。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20％的
DMSO。
图12.5'RACE
在45℃使用SuperScriptⅡ从5μgHela总RNA合成cDNA。10μl纯化的cDNA
在10％DMSO中加尾。使用人tuberousscleosis的引物和ELONGASE®
EnzymeMix（初步PCR2.8kb；泳道1）对1μl加尾反应产物直接扩增40个循
环。在2.8kb条带周边移取10μl的凝胶。使用1μl限定大小的PCR产物进行巢
式PCR（巢式PCR2.7kb；泳道2）。凝胶使用SYBR®GreenⅠ染色。巢式
PCR后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用Southern印迹检测产物。
这需要了解序列内部信息以制备探针。
仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法
为了获得全长的cDNA5'及3'末端序列，许多研究人员使用称之为cDNA末端快
速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断
裂的cDNA产物。GeneRacerTM试剂盒确保只得到含有全长cDNA末端的完整
序列，使您得到更高效的结果并节省时间。
GeneRacer™的优点
确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅
读框至关重要。GeneRacer™是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA
末端序列的效率。使用GeneRacerTM试剂盒，可以得到
•完整序列
克隆基因片段的全长5'和3'末端以构建完整的cDNA序列
•灵敏
得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5'和3'末端
•长度
可以由转录本得到长度至少为9kb的cDNA
仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR。
全长5'末端选择
传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长
mRNA。研究人员必须鉴定每一个PCR产物以获得带有全长5′末端序列的产
物。GeneRacer™只针对全长的5′加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量
PCR产物上的时间。图13示意GeneRacerTM的工作原理。RNA样品经CIP
和TAP处理，保证GeneRacer™寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用
SuperScriptⅡ逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。
GeneRacer™寡聚RNA序列做为GeneRacerTM5′引物结合位点，这样，只有
具有全长5′末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer™步骤及高保真度
Platinum®TaqDNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。
图13GeneRacer™步骤
图14稀有转录本和长转录本的扩增结果
3.5mgHela总RNA经GeneRacer™步骤处理，利用GeneRacer™的OligodT
引物和SuperScriptⅡ™得到cDNA，然后使用GeneRacerTM5′引物和基因特
异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50mlPCR扩
增产物中的15ml在1.2％E-Gel®琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下观察。
泳道1:HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞
泳道2:SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb
泳道3:Cleavageandpolyadenylationspecificityfactor，4.5kb
泳道4:TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb
泳道5:IGFⅡR（类胰岛素生长因子Ⅱ受体），9kb，5′末端GC含量90%
敏感性和扩增长度
为了说明GeneRacer™试剂盒获取全长5′末端的能力，我们扩增了带有已知转
录起始位点的基因的5′末端。使用总RNA，遵循GeneRacer™步骤，我们扩增
了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷贝/细胞的稀有mRNA。
长度超过GenBank序列
除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5′末端，GeneRacer™还可以获得未
知转录起始位点基因的5′末端。将GeneRacer™所得到的序列同GenBank列出
的mRNA序列相比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中
的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表4可以明显看出，使用GeneRacer™
得到的5′cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。
GeneGenBankNumber(mRNA)Size(kb)GeneRacer™SequenceBeyond
GenBank
HeterogeneousnuclearribonuclearproteincomplexKprotein(hnRNPK)
S746782.3+62
SubunitforcoatomercomplexX704763.1+38
Musclephosphofructokinase(PFKM)M260662.8+16
ADP-ribosylationfactor4(ARF4)M36341.11.5+116
Isoleucil-tRNAsynthetaseU049534.5+49
Putativetumorsuppressor(LUCA15)U23946.12.6+81
Thyroidhormonereceptorcoactivatingprotein(SMAP)NM_006696.13.1+52
CleavageandpolyadenylationspecificityfactorU37012.14.5+57
Humaninsulin-likegrowthfactor2receptorNM0008769.0+44
表4说明
列出的基因使用GeneRacer™步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回
收并克隆至pCR®4-TOPO®载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了
12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5′末端超出的
序列。使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基
的超出碱基的数目。
获得全长的cDNA序列
GeneRacer™试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5′和3′序列。每个
GeneRacer™试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScriptⅡ™逆转录
酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer™寡聚RNA，GeneRacer™OligodT引物，
GeneRacer™PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶
纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPOCloning®试剂盒以进行下游测序。使用
GeneRacerTM试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA5′和3′末端序列，而不
必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列。
mRNA表达定量
mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分析方法
的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及
序列信息较少。但是RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波
动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，但定量PCR的主要困难是PCR的指
数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异。两个常用
的mRNA丰度定量方法是竞争性定量PCR和实时PCR。
在竞争性PCR中，逆转录之前加入一个外源的RNA转录本（内部标准RNA）
作为样品间差异的对照。内部标准RNA被逆转录并同目的模板一起扩增，作为
cDNA转化和扩增效率差异的对照。通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部
标准RNA一起扩增进行定量。通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获
得的信号可以确定目的模板的丰度。
内部标准RNA同目的模板有同样的引物识别位点。有几种现行的方法可以得到
内部标准。最简单的方法是使用PCR在非特异性的spacerDNA上建立引物识
别位点。产物可以克隆至带有T7或SP6RNA聚合酶启动子的载体上，或者将
RNA启动子序列加到正向引物，从而可以通过PCR构建序列。然后可以通过体
外转录得到RNA标准。竞争性定量PCR可以使用GSP在一步法RT-PCR中
进行，或使用GSP或oligo(dT)在两步法RT-PCR中进行。可以向反向引物中加
入poly(dT)序列得到oligo(dT)序列。
竞争性RT-PCR是一种终点分析法，需要目的模板和内部标准的扩增效率相同。
需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围。为了精确定
量，需要进行内部标准比目的模板多及少的反应。
实时RT-PCR是非竞争性的，在产物形成的同时就进行了检测。几种探针可以
用于产物量的分析，如荧光标记的5'核酸酶探针和MolecularBeacon。第一种
方法基于TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性，其可以切除延伸过程中在分支点的
杂交探针。分析使用两种荧光标记的探针，一种染料作为报告基团，另外一种在
探针被切除时淬灭信号。
MolecularBeacon包含一个5'flurophore和3'quencher。这些探针设计有一个
带有荧光的发卡结构和紧邻的quencher以淬灭荧光。主干结构包括5到7个核
苷且富含GC。外层环状结构包含15到30个核苷且同把序列互补。当存在靶序
列时，molecularbeacon同靶序列结合，发卡结构松散开，从而产生荧光。
对于两种探针，使用与光激发检测装置耦联的PCR仪，在PCR的每个循环实
时检测荧光。发出的荧光的量同PCR产物的量成正比。当释放的荧光的量超出
了一个制定的荧光基线，这个循环称为阈循环或CT。CT同起始目的模板的量
成反比。因此，高拷贝数的样品会有一个低的CT值，而低拷贝数对应高CT值
（图15）。
图15.眼癌mRNA的实时PCR定量
使用Platinum®QuantitativeRT-PCRThermoScript™One-StepSystem（在
60℃进行cDNA合成）对Hela总RNA的相同两份样品进行PCR。在ABIPrism®
7700上使用FAM标记的MolecularBeacon探针（400nM）进行检测。A组.PCR
期间两份样品的相对荧光密度。B组.标准曲线。
为了对mRNA进行绝对定量，可以使用体外转录RNA得到标准曲线。通过不同
浓度的体外转录RNA可以确定CT值。然后CT值可以同RNA浓度作图得到标
准曲线，以定量未知样品的表达水平（图15，B组）。
实时RT-PCR提供了超越竞争性RT-PCR的优点。通过对大范围目的模板浓度
进行线性剂量响应（图15），荧光监测高度灵敏，高度精确。样品不需要进行
扩增后分析，仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息。可以使用两步法
RT-PCR对一个RNA样品中的多个mRNA定量，在处理大量样品时，为了方便，
可以使用一步法。
脱颖而出的定量RT-PCR
Platinum®QuantitativeRT-PCRThermoScript™One-Step系统整合了最好的
逆转录和PCR技术，提供了全方位的高品质。其产量、特异性和灵敏度都卓尔
不群。您会得到mRNA最精确的实时定量。如您所需，怎样做才能得到最好
的定量RT-PCR（qRT-PCR）结果？把实时定量的逆转录和PCR的领先技术结
合一起就可以了。使用了Platinum®QuantitativeRT-PCRThermoScript™
One-Step系统，您就拥有了两种高品质的酶，ThermoScript™逆转录酶和
Platinum®TaqDNA聚合酶，以预先混合的方式，为精确可靠的扩增反应而优
化。
高效的cDNA合成
ThermoScript™逆转录酶，一种克隆的鸟类RNaseH-逆转录酶，通过基因工程
处理，可以在最高65℃进行高特异性的cDNA合成，其最适温度为50℃。因为
降低了RNaseH活性，ThermoScript™逆转录酶增加了全长cDNA的产量。因
为其较高的热稳定性，可以克服高GC含量和RNA二级结构的障碍，在较高温
度下进行高效的cDNA合成（图16）。
图16带有延伸二级结构的富GCRNA的RT-PCR得到高产量
使用ThermoScript™逆转录酶或AMV逆转录酶，根据生产厂商的建议，由10ng
总RNA合成cDNA。将反应产物的1/10使用高保真Platinum®TaqDNA聚合
酶扩增。圈出的带（414bp）表示核糖体大亚基RNA5'端（84％GC）含量的
扩增。
高产量和特异性
在ThermoScript™逆转录酶后，您会用到Platinum®TaqDNA聚合酶，其在
PCR一步中提供了抗体介导的自动热启动功能（图17）。这项技术明显减少了
错误配对和非特异性扩增，在高特异性的同时提供了高产量。cDNA合成和扩增
的优异结果一起成为成功qRT-PCR的基础。
图17室温条件下DNA聚合酶活性的完全抑制