青樱桃
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2023年2月12日发(作者：)壳聚糖影响樱桃番茄上青霉菌孢子萌发和生长
汪宏涛;胡鑫;唐晓凤;刘永胜
【摘要】文章探讨了壳聚糖对樱桃番茄上青霉菌生长繁殖以及贮藏品质的影响.在
离体的条件下,进行了4种不同质量浓度的壳聚糖对青霉菌孢子萌发、菌丝生长以
及菌落扩展的抑制实验.在活体条件下,对浸泡过0.2g/L壳聚糖溶液的樱桃番茄接种
青霉菌孢子悬浮液,研究壳聚糖对樱桃番茄病害的控制情况.结果表明:离体条件下,壳
聚糖溶液对青霉菌孢子的萌发、菌丝生长的抑制作用随着壳聚糖质量浓度的增加而
增强,在壳聚糖质量浓度为0.4g/L时,几乎能完全抑制菌丝的生长和孢子的萌
发.0.2g/L壳聚糖对菌落的扩展抑制最明显,但随着壳聚糖质量浓度的增加,抑制效果
却逐渐减弱.在樱桃番茄上的接种实验中,进一步验证了0.2g/L壳聚糖能够对樱桃番
茄上青霉菌的生长繁殖有抑制效果.在壳聚糖对樱桃番茄贮藏品质的影响实验中,检
测了樱桃番茄果实的硬度、可溶性固形物、丙二醛(MDA)、还原性糖质量比等生
理指标,结果均表明壳聚糖有助于延缓樱桃番茄的成熟,提高果实的贮藏品质.
【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(041)011
【总页数】5页(P1558-1562)
【关键词】壳聚糖;樱桃番茄;青霉菌;贮藏品质
【作者】汪宏涛;胡鑫;唐晓凤;刘永胜
【作者单位】合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学
食品科学与工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合
肥230009;合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽合肥230009
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3
樱桃番茄,又名小西红柿、樱桃西红柿、圣女果,为浆果类果实,呼吸跃变型植物。樱
桃番茄具有生津止渴、亲热解毒、健胃消食、补血养血等功效,是一种价值优良的
水果[1]。但樱桃番茄不耐运输储藏,易受到机械损伤和微生物的侵害,采后会产生腐
烂变质[2]。因此,樱桃番茄采后的保鲜储藏一直是比较热门的话题,但传统地使用合
成化学杀菌防腐剂对人体和环境都会产生潜在的危害[3],使得天然的杀菌防腐剂越
来越受到关注。
壳聚糖,又名壳多糖、几丁质、氨基多糖,化学名称为直链(1,4)-2-胺基-2-脱氧-β-
D-葡萄糖,是几丁质由甲壳素通过一定程度的脱乙酰基而得到的多糖类生物大分子,
广泛存在于虾蟹的外壳中,在自然界中的含量非常丰富,仅次于纤维素。壳聚糖无毒
性,使用后能够被土壤中的微生物完全降解,不会对环境造成危害[4]。目前,壳聚糖广
泛地应用于化妆品、食品、医药等各种领域[5-6],在食品领域中,主要使用其作为抗
菌剂[7]、果蔬保鲜剂[8]、抗氧化剂[9]和一些保健食品添加剂[10]等,能有效抑制一
些真菌、细菌和病毒的生长繁殖,但在青霉菌中的研究较少。壳聚糖作为果蔬保鲜
剂和杀菌剂已经在番茄[11]、草莓[12]、梨[13]、苹果[14]、柑橘[15]等一些水果
上进行了研究,发现它能形成具有良好黏度、通透性的薄膜,对采后果蔬的保鲜及病
害的控制具有优良的效果,但壳聚糖对果蔬保鲜的机制研究目前还有待深入发掘。
青霉菌是真菌的一种,常见于腐烂的蔬菜、水果上,多呈现灰绿色。番茄的青霉果腐
病是一种常见的番茄采后病害,对番茄的储藏和运输造成巨大的损害[16]。目前还
没有安全、有效的防治方法。本研究通过离体实验验证了壳聚糖能够对青霉菌孢子
的萌发、菌丝的生长以及菌斑的扩展有明显的抑制作用,在活体实验中,青霉菌孢子
悬浮液接种于经壳聚糖处理的樱桃番茄上,观察果实的发病情况,与对照组相比,得出
壳聚糖能够有效抑制青霉菌在樱桃番茄上的生长繁殖,为后续壳聚糖对青霉菌的研
究提供实验基础。壳聚糖对樱桃番茄贮藏品质的影响实验中,经过壳聚糖处理的樱
桃番茄的各项生理指标均优于对照组,反映出壳聚糖可提高樱桃番茄的贮藏品质,同
时为樱桃番茄采后贮藏技术的改良提供了实验基础。
1材料与方法
1.1材料
从市场购买成熟时期的红色樱桃番茄,且外观均一,无病虫斑和机械损伤的新鲜果实,
用体积分数为2%的次氯酸钠浸泡3min后,用清水冲洗,并自然晾干。
青霉菌由本实验室提供,将实验室保存的菌株接种于PDA培养基上,置于25℃、黑
暗条件下培养7～14d,将孢子刮下悬浮于无菌蒸馏水,并用无菌纱布过滤除去菌丝,
稀释孢子的个数至1×106个/mL备用。
壳聚糖从Sigma-Aldrich公司购买75%的脱乙酰度的壳聚糖。配置壳聚糖溶液时
用1%的乙酸溶解,放在25℃摇床150r/min摇24h，并用1mol/LNaOH调
pH值到5.0。
1.2壳聚糖对青霉菌菌落扩展的影响
配置壳聚糖终质量浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4g/L的PDA培养基,115℃灭菌
30min。用直径为0.5cm的打孔器沿青霉菌菌落边缘部位取菌饼转接于上述质量
浓度的培养基中央，放置在25℃培养箱黑暗条件下连续培养。每个处理重复3次，
采用十字交叉法，每隔24h测量1次菌落直径，连续测量10d,计算菌落扩展直
径，即
菌落扩展直径=菌落平均生长直径-菌饼初始直径。
1.3壳聚糖对青霉菌孢子萌发的影响
将配置好的青霉菌孢子悬浮液50μL均匀涂布于0、0.1、0.2、0.3、0.4g/L的
PDA固体培养基,25℃、黑暗条件下培养10h后,在显微镜下观察,测量并计算青
霉菌孢子萌发抑制率,每个处理重复3次,每次统计的孢子数不少于150个。计算孢
子萌发抑制率,即
孢子萌发抑制率=(1-萌发的孢子数/观察的总孢子数)×100%。
1.4壳聚糖对青霉菌菌丝生长的影响
配置壳聚糖终质量浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4g/L的PDA液体培养基,每瓶(50
mL培养基)接种3片在PDA固体培养基上生长的青霉菌菌片,25℃,振荡培养(150
r/min)3d后,过滤烘干,测定菌丝干重,每个质量做3个重复,实验重复2次。采用下
述方法计算菌丝生长抑制率,即
菌丝生长抑制率=(1-处理组菌丝干重/对照组菌丝干重)×100%。
1.5壳聚糖对樱桃番茄上青霉菌的影响
用消毒针在樱桃番茄果实的腰部位置扎一个4mm×3mm的伤口,浸泡在含有0.2
g/L的壳聚糖溶液中5min,然后放置于工作台上晾干。取配制好的孢子悬浮液5
μL接种于扎好的伤口上,由于乙酸能够抑制青霉菌的生长,因此对照组的樱桃番茄用
1%的乙酸溶液(pH值为5.0)浸泡并接种。将上述处理好的樱桃番茄晾干后放置于
塑料筐内,外面套一个塑料袋并保持框内相对湿度在90%左右,储藏于25℃条件下，
每个处理重复3次，每次重复20个果实，每天观察并记录发病症状，发病率计算
公式为：
发病率=(感染的伤口数/总伤口数)×100%。
1.6壳聚糖对樱桃番茄贮藏品质的影响
将消毒洗净的樱桃番茄浸泡于0.2%的壳聚糖溶液中5min,对照组用1%的乙酸
溶液(pH值为5.0)浸泡。把处理好的樱桃番茄晾干后放在塑料筐内,外面套上塑料
袋并保持框内相对湿度在90%左右,贮藏于25℃条件下。每个处理重复3次,每次
重复20个果实。在第1、3、5、7天观察,并取样用于检测樱桃番茄的硬度、可溶
性固形物、丙二醛(MDA)、还原性糖等生理指标。
1.7樱桃番茄各项指标测定
硬度用物性仪检测,每个果实测量重复3次,硬度为10个果实硬度的平均值。可溶
性固形物用折射仪检测,每个果实测量3次。用TBA法[17]和DNS法[18]分别测
定MDA和还原性糖的质量。取樱桃番茄果实果皮,用液氮研磨成粉末,称取0.2g
左右于1.5mL的EP管中,记录实际质量,加1mL冰上预冷的PBS缓冲液,充分混
匀振荡。然后4℃,每分钟10000g离心10min。
(1)取0.3mL上清液加到0.5mL的0.5%的TBA溶液(0.5%硫代巴比妥酸,10%
三氯乙酸)中,95℃加热20min后迅速冰浴5min,然后在每分钟10000g条件下
离心10min。取300μL混合液用酶标仪检测波长在450、532、600nm处的吸
光度，可得MDA大小为：
MDA浓度=6.45×(OD532-OD600)-0.56OD450;
MDA的量=MDA浓度×提取液体积/植物组织鲜重。
(2)取0.1mL上清液加入到0.7mL的DNS溶液(0.65mol/L酒石酸钾钠,0.03
mol/L3,5-二硝基水杨酸,0.5mol/L氢氧化钠,0.05mol/L苯酚)中,并在沸水中煮5
min。取300μL的混合液用酶标仪检测波长在540nm处的吸光度。根据预先绘
制的葡萄糖标准曲线可计算出还原性糖质量比。
1.8统计分析
所有的实验数据用MicrosoftExcel2013进行统计分析,计算标准偏差,并用SPSS
18.0软件进行差异显著性分析。
2结果与分析
2.1壳聚糖对青霉菌菌落扩展的抑制
PDA平板上菌落大小反映了不同质量浓度的壳聚糖对青霉菌生长的抑制效果，实
验结果如图1所示。从图1可看出,与对照组相比,壳聚糖能明显抑制青霉菌的生长。
青霉菌边缘菌丝变短,菌落直径缩小。并且,不同质量浓度的壳聚糖对青霉菌的抑制
作用也有差别,当壳聚糖质量浓度为0.2g/L时,抑菌效果最明显,随着壳聚糖质量浓
度的增加,菌落的直径反而在逐渐增大。随着时间的增加,抑菌效果也在逐渐减弱,可
能是由于青霉菌对生长环境的逐渐适应使得对壳聚糖的抗性也在逐渐增强。
图1壳聚糖对青霉菌菌落扩展的抑制
2.2壳聚糖对孢子萌发及菌丝生长的抑制
壳聚糖对青霉菌菌丝的生长及孢子萌发也有一定的抑制效果,实验结果如图2所示。
图2壳聚糖对青霉菌孢子萌发及菌丝生长的抑制
从图2a可看出,当壳聚糖质量浓度为0.2g/L时,可明显抑制孢子的萌发,抑制率达
到36%,当壳聚糖质量浓度达到0.4g/L时,几乎使孢子不能萌发。同样,从图2b可
看出,不同质量浓度的壳聚糖对菌丝生长也有明显的抑制作用,当质量浓度为0.2
g/L时,抑制率达到45%,当壳聚糖质量浓度为0.4g/L时,菌丝基本没有生长。综合
上述结果,壳聚糖对青霉菌孢子的萌发、菌丝的生长及菌落的扩展均存在明显的抑
制作用。
2.3壳聚糖对樱桃番茄上青霉菌生长的抑制
离体实验验证了壳聚糖对青霉菌的生长繁殖有一定的抑制作用。本文用0.2g/L壳
聚糖溶液浸泡樱桃番茄,然后在该樱桃番茄上接种青霉菌孢子悬浮液,实验结果如图
3所示,图3中，*代表P<0.05,**代表P<0.01。由图3可知，经过0.2g/L壳聚糖
溶液处理后的樱桃番茄与对照组相比，能明显减缓青霉菌的发病率。在接种后的第
3天,对照组均有一定程度的病斑生长,但经过壳聚糖处理的樱桃番茄的发病率仅为
22%,且对照组病斑扩展速度快。在第7天,处理组的樱桃番茄才有较明显的青霉菌
生长，如图4所示。
图3青霉菌的发病率
图4壳聚糖对樱桃番茄上青霉菌生长的抑制
2.4壳聚糖对樱桃番茄贮藏品质的影响
以上实验表明壳聚糖能够抑制青霉菌在樱桃番茄上的生长繁殖,其对果实各项生理
指标的影响如图5所示。
图5壳聚糖对樱桃番茄贮藏品质的影响
图5中，*代表P<0.05,**代表P<0.01。从图5a、5b可看出,随着贮藏时间的延
长,对照组樱桃番茄果实的硬度逐渐降低、可溶性固形物质量分数不断升高,但处理
组的硬度比对照组的大,可溶性固形物质量分数也比对照组低,说明处理组果实成熟
度比对照组低。从图5c、5d的MDA以及还原性糖质量比数据也可看出,处理组均
小于对照组,说明果实成熟度是对照组高于处理组,因此,经过壳聚糖处理的樱桃番茄
能明显延缓果实的后熟,有利于延长果实的货架期。
3讨论
本研究先通过离体实验验证壳聚糖抑制青霉菌生长,在PDA平板上,4种不同质量浓
度的壳聚糖显示了对青霉菌生长繁殖的抑制作用。在壳聚糖质量浓度为0.2g/L时,
菌落的扩展受到的抑制最为明显,但随着壳聚糖质量浓度的增大,抑制效果却逐渐减
弱。并且,壳聚糖对孢子的萌发以及菌丝的生产均有显著的抑制效果。在壳聚糖质
量浓度为0.2g/L时,相对抑制率达到36%,在壳聚糖质量浓度为0.4g/L时,青霉菌
孢子基本不能萌发,菌丝的生长抑制率达到93%。造成这种现象的原因可能是壳聚
糖具有生物降解性,部分抑菌物质发生降解导致抑菌能力减弱。在含0.3、0.4g/L
壳聚糖的PDA平板上,壳聚糖在高质量浓度下易发生絮凝,也会导致抗菌物质浓度
的降低。当然,也可能与培养时间有密切关系,孢子的萌发、菌丝的生长均在较短的
时间下测定,而青霉菌在PDA平板上培养时间长,可能使得青霉菌适应壳聚糖存在
的环境,从而导致抑菌效果逐渐减弱。且对于不同的病原菌,壳聚糖有不同的最适抑
菌浓度[19]，造成这种现象的具体原因还需要更多的实验来验证。
樱桃番茄接种实验表明,经过0.2g/L壳聚糖处理的樱桃番茄,在第3天与对照组相
比,22%的发病率说明壳聚糖对樱桃番茄上青霉菌的生长抑制作用明显,且处理组病
斑扩展速度慢,在第7天,处理组才全部发病。另外,本文通过实验验证了壳聚糖处理
樱桃番茄能够提高其贮藏品质。硬度、可溶性固形物质量分数、还原性糖质量比、
MDA等测定的生理指标表明,经过处理的樱桃番茄比对照组后熟,且处理组比对照
组保持较好的新鲜度。综上所述,壳聚糖在应对樱桃番茄上的青霉病有良好的预防
效果,能提高樱桃番茄的贮藏品质,具有较广的应用前景,但其抑菌保鲜机理还需要进
一步研究,后续实验也将关注壳聚糖的生理功能和抑菌机理。
[参考文献]
【相关文献】
[1]BADAWYMEI,ialofthebiopolymerchitosanwithdifferentmolecular
weightstocontrolpostharvestgraymoldoftomatofruit[J].PostharvestBiology&
Technology,2009,51(1):110-117.
[2]ZHANGH,LIR,sofchitinanditsderivativechitosanonpostharvestdecay
offruits:areview[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2011,12(2):917-934.
[3]ZHANGDF,WANGHT,HUY,ancontrolspostharvestdecayoncherry
tomatofruitpossiblyviathemitogen-activatedproteinkinasesignaling
pathway[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2015,63(33):7399-7404.
[4]CHENJ,ZOUX,LIUQ,ationeffectofchitosanandmethyljasmonateon
controllingAlternariaalternata,andenhancingactivityofcherrytomatofruitdefense
mechanisms[J].CropProtection,2014,56(2):31-36.
[5]廖春燕,马国瑞,陈美慈,等.不同分子量壳聚糖对几种植物病原真菌的拮抗作用[J].浙江农业学
报,2001,13(3):172-175.
[6]刘凤英,王刚,任小芳.利用壳聚糖防治柑橘采后青霉病的研究[J].安徽农学通报,2008,14(21):161-
162.
[7]杨玲玉,孟祥红,刘成圣,等.壳聚糖的抗菌性及其对果实病害的防治研究进展[J].中国农业科
学,2009,42(2):626-635.
[8]WANGL,WUH,QING,andisruptsPenicilliumexpansum,andcontrols
postharvestbluemoldofjujubefruit[J].FoodControl,2014,41(1):56-62.
[9]HANC,ZUOJH,WANGQ,sofchitosancoatingonpostharvestqualityand
shelflifeofspongegourd(Luffacylindrica)duringstorage[J].Scientia
Horticulturae,2014,166:1-8.
[10]CHIENPJ,SHEUF,gcitrus(Murcotttangor)fruitwithlowmolecular
weightchitosanincreasespostharvestqualityandshelflife[J].Food
Chemistry,2007,100(3):1160-1164.
[11]LIUJ,TIANS,MENGX,sofchitosanoncontrolofpostharvestdiseasesand
physiologicalresponsesoftomatofruit[J].PostharvestBiology&
Technology,2007,44(3):300-306.
[12]ROMANAZZIG,FELIZIANIE,SANTINIM,ivenessofpostharvesttreatment
withchitosanandotherresistanceinducersinthecontrolofstoragedecayof
strawberry[J].PostharvestBiology&Technology,2013,75(3):24-27.
[13]MENGXH,YANGLY,KENNEDYJF,sofchitosanandoligochitosanon
growthoftwofungalpathogensandphysiologicalpropertiesinpearfruit[J].Carbohydrate
Polymers,2010,81(1):70-75.
[14]LIH,WANGY,LIUF,sofchitosanoncontrolofpostharvestbluemolddecay
ofapplefruitandthepossiblemechanismsinvolved[J].ScientiaHorticulturae,2015,186:77-
83.
[15]CHIENPJ,ngalactivityofchitosananditsapplicationtocontrol
post-harvestqualityandfungalrottingofTankancitrusfruit(Citrustankan
Hayata)[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2006,86(12):1964-1969.
[16]刘艳红,李光伟,刘永胜.提高番茄品质的番茄去泛素化酶基因AMSH3[J].合肥工业大学学报(自
然科学版),2016,39(4):548-553.
[17]SONGH,FANP,pressionoforganellarandcytosolicAtHSP90in
arabidopsisthalianaimpairsplanttolerancetooxidativestress[J].PlantMolecularBiology
Reporter,2009,27(3):342-349.
[18]赵凯，许鹏举，徐广烨.3,5-二硝基水杨酸比色法测定还源糖含量的研究[J].食品科
学,2008,29(8):534-536..
[19]吴小勇,曾庆孝,阮征,等.壳聚糖的抑菌机理及抑菌特性研究进展[J].中国食品添加剂,2004(6):46-
49.