⼤咖讲座精华回顾外泌体那些不可错过的⼲货
近年来，外泌体蛋⽩质组学的研究成果进展迅速，蛋⽩质分⼦在外泌体信号传递过程中也起到了⾮常重要的作⽤。中科新⽣命9⽉23⽇隆重举办了外泌体专题的系列讲座，得到了⼤家的热烈响应。现在，我们总结了讲座的精华内容及回放视频，包括报告中的问题也提供了详细⽂字答疑，供⼤家参考。
报告⼀
外囊泡的蛋⽩质组、磷酸化蛋⽩质组学的研究进展
来⾃于美国普渡⼤学的陶纬国教授给⼤家带来⼀场精彩的报告，报告内容围绕蛋⽩质分⼦的临床标志物重要性及挑战，细胞外囊泡进⾏治疗及诊断标志物的应⽤潜⼒，外泌体蛋⽩质组学及磷酸化组学⽅法流程，EVTRAP外泌体磷酸化及糖基化提取⽅法等⽅⾯展开。在外囊泡的诊断应⽤案例中，陶⽼师重点介绍了尿液细胞外囊泡在阿尔兹海默症中研究进展，主要利⽤磷酸化蛋⽩质组学技术进⾏标志物筛选。
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报告⼆
外泌体蛋⽩质组学研究难点及解决策略
中科新⽣命产品经理⾼晓静主要围绕外泌体蛋⽩质组学的近期研究进展，外泌体蛋⽩质组学实验设计的关键要素，以及外泌体蛋⽩质组学的案例应⽤等⽅⾯展开报告。详细介绍了外泌体蛋⽩质组学的实验设计思路，外泌体样本准备要求，蛋⽩质组学技术选择以及经典案例，可为⽼师开展外泌体蛋⽩质组学提供参考。
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报告三
细胞外囊泡 (EVs) ⽣物标志物研究现状与开发实践
南⽅医科⼤学、国际细胞外囊泡学会执⾏主席郑磊教授分别从EVs标志物研究现状、开发实践、挑战、展望等四个⽅⾯展开报告。
在研究现状分享中，郑教授表明“EVs是具有⼴阔应⽤前景的⽣物标志物”，⽬前EVs蛋⽩作为标志物在已在诸多疾病，如肿瘤、神经退⾏疾病、⼼⾎管疾病等中具有诊断、预后判断等重要价值。
随后郑教授提到，基于多种不同组学的技术发展，以及基于不同样本（如细胞、组织、⾎液）来源的EVs研究，推动了EVs中不同成分作为潜在标志物应⽤的发展，并分享了其多项肿瘤EVs研究⼯作。最后，郑教授也表⽰EVs研究中存在诸多困难，包括：挑战⼀，细胞外囊泡亚群难以分选；挑战⼆，缺
乏理想检测技术平台；挑战三，细胞外囊泡溯源不清，难以标准化。当然，这些挑战也是未来领域发展及值得展望⽅向，包括：发展特定EVs亚群得⾼通量分选技术；对单个EV绝对定量检测技术；组织EVs与循环EVs联合筛选策略等等。
报告四
细胞外囊泡常见的提取检测⽅法及⽐较介绍
厦门⼤学颜晓梅教授主要就细胞外囊泡的提取技术研究发展⽅⾯带来精彩报告，介绍内容主要包括：EVs分离纯化必要性、检测表征技术、提取⽅法⽐较、及纳⽶流式检测技术的应⽤。
颜教授表⽰“EVs异质性⼤，及其所处⽣理环境基体⼗分复杂”，因此提取⾼纯度EVs是做好后续研究⼯作前提，为准确研究EVs的⽣物合成途径及其功能奠定基础。随后，颜教授就EVs表征进⾏介绍，并提到了纳⽶流式细胞术在检测粒径分布测定中具有浓度准确测定、同时能表征EV marker、⽤量少等特点，为EVs应⽤发展提供了⾼效的表征⼿段。
主要介绍了常见EVs分离纯化⽅法（包括差速离⼼、聚合物沉淀、尺⼨排阻、免疫亲和等）⽐较，结果发现超离⽅法提取纯度最⾼。⽽基于试剂和提的EVs，尤其基于聚合物沉淀原理试剂盒，获取浓度虽然⾼，但杂质较多。该项研究⼯作为选择合适⼿段纯化EVs提供了⼀定数据⽀持。
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报告五
Cell精读：外囊泡蛋⽩质组学在标志物研究中的思路介绍
中科新⽣命产品经理徐⽂佳以2020年8⽉发表在《Cell》杂志上的⽂章“Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers”为出发，分别从研究思路、分析技术、研究意义等多个⽅⾯，详细介绍了细胞外囊泡及颗粒（EVPs）在标志物研究中四个亮点⼯作及发现，包括：对不同样本肿瘤类型来源的⼤规模EVP提取及蛋⽩组分析；鉴定新外囊泡标志物pan-EVP markers；分析组织⾎浆不同来源的EVP蛋⽩特征及EVP肿瘤特异性标志物筛选；筛选⽤于肿瘤分类EVP标志物。该⽂章的研究⼯作发现不同肿瘤组织EVP蛋⽩特异性，⾎浆来源肿瘤特异性EVP蛋⽩具有表征肿瘤及其微环境的系统性变化特点，有⼒⽀持了EVP蛋⽩能够作为肿瘤诊断及分类标志物，并且肯定了⾎浆EVP蛋⽩在液体活检未来发展中的潜在重要价值。
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提问
Qustions
&
解答
Answers
⽹友提问环节，⼤家也进⾏了激烈的讨论，在此进⾏总结分享。
Q
1. ⾎清和⾎浆外泌体有何区别？临床样本如何选择？
答：⾎浆和⾎清的制备⽅法有所不同，⾎清在沉降过程中可能会带有部分损失，且批次间制备的重复性有所差别。此外，对于⾎清⽽⾔，⾎液样本处理时⾎⼩板凝⾎过程中会分泌⼤量的外泌体到⾎清中，故可能⼲扰所关注疾病来源的外泌体。因此如果条件允许的情况下建议优先先选择⾎浆进⾏外泌体提取。但是友情提⽰⼀点，⾎清外泌体也是可以作为实验材料进⾏后续组学的。
Q
2. 磁珠法富集外泌体的⽅法原理是什么？
答：主要通过EVTRAP进⾏富集，主要原理是磁珠表⾯所偶联的亲⽔亲脂基团，可以特异性结合外泌体表⾯所包裹的脂质，从⽽实现富集的⽬的。
Q
3. ⼼肌组织怎么提取外泌体？
答：组织类和体液类提取外泌体的⽅式差异较⼤，组织类主要通过消化的⽅式，获取上清，然后再进⾏外泌体提取。但是组织中提取外泌体难度较⼤，如果也可以通过同类细胞进⾏培养，对培养的上清进⾏外泌体提取相对较为容易。
Q
4. 细胞上清提外泌体做蛋⽩质组杂蛋⽩的污染严重不？
答：在样本准备阶段，当细胞⽣长⼀定密度时，更换为⽆⾎清培养基或者⽆外泌体培养基的⽅式进⾏上清收集，这样可
答：在样本准备阶段，当细胞⽣长⼀定密度时，更换为⽆⾎清培养基或者⽆外泌体培养基的⽅式进⾏上清收集，这样可以避免⾎清或者其他来源⼲扰，得到细胞上清外泌体提取⼀般背景⽐较⼲净。
Q
5. 请问磷酸化多肽富集的⼿段有哪⼏种呢？
答：⼀般有抗体法，IMAC或TiO2等⽅式可进⾏磷酸化富集。
Q
6. Label free的结果缺失值很多怎么处理的？
答：Labelfree的结果缺失情况⼀般组间组内的重复情况进⾏过滤筛选，如果满⾜⼀定的标准可以作为有⽆定量差异进⾏后续分析；如果在每组中都出现但⼜有缺失，说明该蛋⽩稳定性不⾼，不建议进⾏后续分析。
Q
7. 分泌蛋⽩和外泌体蛋⽩有何区别与联系？
答：两者形成的⽅式也有所不同，提取⽅法也有区别。分泌蛋⽩是在内质⽹及⾼尔基体合成的成熟蛋⽩，穿过细胞膜到胞外发挥作⽤的蛋⽩。⽽外泌体蛋⽩是外泌体在细胞内形成过程中所包裹的蛋⽩，⾥⾯所携带的蛋⽩质随⽣理或病理会有所变化，也可能在正常情况下是在细胞内发挥作⽤的蛋⽩。
Q
8. 发现队列要求⼀般是多少？
答：做标志物研究，筛选队列要避免临床样本个体差异的影响，建议越多越好，⼀般常见的30-50例，超⼤队列的研究⼀般会有上百例甚⾄⼏百例。
Q
9. ⾎清外泌体是不能区分具体脏器来源的对吧？
答：⾎清本⾝是全⾝性循环系统，⼀般难以区分外泌体来源。
Q
10. 体液样本可以提供测试服务吗？对样本有什么要求？
答：体液样本⽐如常见的⾎浆、⾎清、细胞上清、尿液、⽜奶等可以进⾏外泌体提取及组学服务，具体样本要求及样本准备细节可以联系我们索取。
Q
11. 什么时候选择体液做蛋⽩组学？什么时候提取外泌体在做组学？有什么区别？
答：体液及体液的外泌体都可以进⾏组学研究，进⾏标志物筛选。可以查阅相关研究领域的进展，如果该领域体液类研究也⽐较少，可以先从体液做起，样本获取简单⽅便。如果希望有⼀定的创新性，可以提取外泌体进⾏研究。
Q
12. 外泌体蛋⽩的浓度⽅便测吗？BCA⽅法可以测吗？
答：外泌体蛋⽩浓度可以测定，可以通过BCA法检测得到蛋⽩浓度，进⽽评估是否⾜够进⾏蛋⽩质组学实验。
Q
13. wb检测外泌体很多⽤cd63，跟三阳⼀阴有什么出处吗？
答：外泌体表⾯有很多特异性蛋⽩是可以选择的，像CD63，CD81等等都可以阳性检测指标。三阳⼀阴的含义是三个外泌体特异性表达蛋⽩和⼀个外泌体不达标的指标综合判断所提取到的外泌体蛋⽩特异性。该说法主要来源于国际囊泡协会对于外泌体实验的标准建议，但是对于具体选择哪⼀个蛋⽩可以根据实际情况确定。
Q
14. ⽼师，如果我做外泌体的RNA测序和蛋⽩组学都筛选出了有⽤的RNA或者蛋⽩，那么如何知道到底是哪种成分更起作⽤呢？
答：如果已经测序到蛋⽩或者RNA有差异，在数据上您可以先做⼀些功能分析，看哪些和您关注的表型⽐较先关，可以选择⼀种⽅向继续深⼊研究，验证⼀下表达量是否有差异，然后体内外实验进⾏功能验证。
Q
15. 提取的Ev深低温能保存多久？
答：提取完成以后的外泌体相对⽐较稳定，如果不反复冻融，放置⼏个⽉是可以的。
哦
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