疏水性
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2023年3月19日发(作者：订订单)2008-6Volume8
疏水层析填料
疏水层析，是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异，进行蛋白分离的一种方法。一
般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，
温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以
用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。
Chisso公司生产的疏水层析填料，有三种类型：CellfineTMButyl,Phenyl和Octyl，分别为在多
孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头，共价键和丁基，苯基或者辛基的层析填料。结构见下图：
填料的疏水性按丁基、苯基、辛基，疏水性程度依次增大。通常，CellfineTMOctyl对疏水性蛋
白的吸附性会强于CellfineTMButyl对疏水性蛋白的吸附。然而，蛋白被吸附的越厉害，也就越难洗
脱。CellfineTMPhenyl，具芳香族物质的特性，因此，在某些情况下，可以更好地吸附丁基和辛基等
脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时，没有通法，只能根据待分离物质的特性，筛
选合适的填料，摸索优化其分离纯化的条件。
三种疏水层析填料的疏水性差异（左图）
色谱柱：8.2x150mm
柱体积：8ml
流动相：2.0–0.0M
AmmoniumSulfate
in0.01Mphosphate,pH7.0
流速：1.32ml/min
样品：5mg/3ml–100µl
2008-6Volume8
AsahipakNH2P色谱柱（氨基柱）
AsahipakNH2P色谱柱是Shodex公司生产的用于分析糖类物质的正相柱。AsahipakNH2P色谱柱，
是以聚合物为基材的氨基柱，化学稳定性良好，在pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基材的氨基柱
相比，聚合物基材的氨基柱AsahipakNH2P，可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种应用；对流动相
的耐受性更好，使用寿命更长久；另外，AsahipakNH2P可用于定量分析；还可以用碱性溶剂冲洗。
聚合物基材氨基柱与硅胶基材氨
基柱的柱寿命比较
左图为AsahipakNH2P色
谱柱与硅胶基材氨基柱的寿命
对比试验。结果显示：随着使用
时间的延长，硅胶基材氨基柱对
单糖、二糖的保留快速下降，其
原因应是硅胶基材氨基柱的氨
基降解所致。
色谱柱：AsahipakNH2P-504E,
其它公司的氨基柱
(4.6mmID*250mm)
流动相：CH3CN/H2O=75/25
流速：1.0mL/min
检测器：ShodexRI
柱温：30度
AsahipakNH2P色谱柱可在正相模式下分离糖类物质，糖类
物质按照分子量由小到大的顺序依次被洗脱。增加洗脱液中有
机溶剂的比例可以延迟糖类的洗脱时间。AsahipakNH2P色谱柱
可以在碱性，室温条件下分离单糖、二糖和糖醇混合物。右图
为AsahipakNH2P色谱柱分离单糖、二糖及三糖混合物的应用
实例。
单糖、二糖及三糖混合物的分离
色谱柱：ShodexAsahipakNH2P-504E(4.6mmID*250mm)
流动相：H2O/CH3CN=25/75
流速：1.0mL/min
检测器：ShodexRI
柱温：30度
2008-6Volume8
学习园地
导致色谱柱柱压升高的原因及解决方案
第一阶段：确认是柱子导致的压力上升，还是HPLC系统导致的压力上升。
由于HPLC系统有很多环节，如泵、管路等，都容易吸附和积聚杂质，这些因素均会导致压力上
升，所以，应先对HPLC系统进性排查。
排查方法：取下色谱柱，仅用管路连接并正常输送流动相时记录系统压力。如果此时HPLC系统
压力正常，则考虑是柱压升高。
第二阶段：确定是否使用了保护柱（预柱）。
一般在测定容易堵塞色谱柱的样品时，应该使用保护柱。如果使用了保护柱，那么压力的升高就
有可能是保护柱的柱压升高导致的。
排查方法：取下色谱柱，仅以保护柱连接管路并正常输送流动相测试柱压，再反过来取下保护柱
仅以色谱柱连接管路正常输送流动相测试柱压，如果仅当连接保护柱时柱压高的话，则为保护柱引起
的柱压升高，请清洗、或更换保护柱。
第三阶段：如果不是上述第一、第二点原因造成压力升高，就可以确认是色谱柱的原因了。
如果柱压是随着使用时间的延长，慢慢上升，这属于正常现象，是色谱柱达到使用寿命了，只能
更换色谱柱了。
如果柱压是在实验开始时，实施中或经过一次、几次实验后，突然上升，则要结合实验情况考虑
以下因素：
原因解决方案
色谱柱
柱长色谱柱越长，柱压越高。可根据实验情况适当减小柱长。
柱内径柱内径越小，柱压越高。可选择大内径色谱柱。
填料
基质的形态
填料的形态也会对柱压有影响。硅胶基质的形态可以分为无定形
和球形两种，现在一般装柱使用球形硅胶。
颗粒大小
小粒径填料装填的色谱柱柱压较高，在不影响分离效果的同时，
可选择大粒径的填料。
填料合成条件及装柱
条件
不同厂家生产的色谱柱有的柱压可能相差4、5个MPa，特别是
低端和高端色谱柱之间，这一区别比较明显。例如：YMC公司生
产的色谱柱，就属于高效高压型的。
流动相
流动相的前处理
流动相中存在的杂质也会堵塞色谱柱，引起柱压升高。因此，在
实验前应进行必要的试剂前处理，包括滤膜过滤，用固相萃取方
法去除容易吸附于色谱柱填料的强疏水性杂质。
流动相的种类
不同流动相，因其理化性质差异，产生的柱压有所差异。例如：
乙腈产生的压力低于甲醇，但两者的分离效果相似。在某些情况
下，可以通过替换流动相的种类减小柱压。
混合流动相的比例
流动相成分间的比例，也可以引起柱压的差异。如：当甲醇/水
=50/50时，柱压就较高。可以通过调整流动相成分间的比例降低
柱压。
温度
温度的变化也会导致柱压的变化。最好使用柱温箱控温，可根据
实验情况，适当升高柱温以减小柱压。
样品
含有不溶性成分过滤样品，充分离心，防止堵塞预柱及色谱柱，引起柱压升高。
盐分
样品或缓冲液中的盐分结晶于柱内，也可引起柱压升高。如：乙
酸铵。根据实验情况，清洗色谱柱中的盐分，从而降低柱压。如：
先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，
相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗，之后
用纯甲醇冲洗柱子30分钟。
被填料吸附沉积
样品污染沉积也会导致柱压升高。须根据实验情况和柱子类型进
行清洗。（常规的清洗方法如下。）
常规的色谱柱清洗方法（正向冲洗）
使用比目前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱。如果您使用的流动相是乙腈：
水（70:30），请使用更高浓度的乙腈水溶液进行清洗，比如乙腈：水（80:20）或乙腈：水（90:10）。
但是，如果高浓度的乙腈水溶液导致样品溶解困难的话，请停止使用上述流动相，转而使用对样品易
溶的流动相。
如果该方法仍不见效，请试用下述方法。
色谱柱清洗方法（反向冲洗）
将色谱柱反向连接（即与色谱柱上箭头标识相反的方向使流动相由出口处流入、入口处流出）输
送流动相试试。此时，如果柱压太高会对色谱柱造成损坏，所以请将流速调至平时操作时的一半。但
是，如果使用相同的流速，反洗比正向清洗柱压还低的话，可能会发生色谱柱入口处的填料在筛板处
聚集，那么就使用原有流速进行反洗。反洗流动相的选择与上述正向冲洗相同，请选用比平时使用的
流动相溶解性更强的、更易溶解样品的流动相。
注意，反洗时请断开检测器的管路连接，以避免污染检测器。
反洗色谱柱容易对色谱柱造成伤害，不到万不得已不要轻易使用。
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