纸层析法原理
-
2023年3月19日发(作者：国寿天财)纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法——氨基酸的分离与鉴定
⼀、实验⽬的
1、了解纸层析法的使⽤原理。
2、掌握⽤纸层析法分离蛋⽩质的操作步骤。
⼆、实验原理
1、纸层析法是以滤纸作为惰性⽀持物的分配层析⽅法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲⽔基团，
滤纸吸附⽔作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲⽔、疏⽔
能⼒不同，在两相之间不断分配，疏⽔能⼒强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲⽔能⼒强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接⼀个氢原⼦和两个亲⽔基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），
唯⼀的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲⽔疏⽔能⼒对⽐中起到了决定性的作⽤。本实验采⽤丙氨酸，苯丙氨酸，
天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲⽔疏⽔能⼒迥异，能在滤纸上明显分开。
3、Rf值表⽰原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离与原点中⼼⾄流动相前沿的距离⽐。在⼀定条件
下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本⾝的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量
原点中⼼⾄显⾊斑点中⼼的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，⼀般取斑点的重⼼，测量出重⼼与起点的距
离即可。
4、显⾊原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，
最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发⽣作⽤⽣成紫⾊物质。
三、试剂
（⼀）提前配制试剂
8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。
8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。（将上述三种溶液装于⼩瓶中实验时，每两组共⽤
⼀组试剂）
正丁醇
88%甲酸
蒸馏⽔
茚三酮晶体
注：实验时，以上试剂均为每两组同学共⽤⼀组试剂。
（⼆）当堂配制试剂
丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:将上述溶液等体积混合即可
四、实验仪器
每组：
钟罩：1试管：15mm*10cm*5
试管架：1培养⽫：95mm*1
移液管：10ml*1洗⽿球：1
⼩烧杯：25ml*2（可以⽤其他⼩规格的烧杯如20,10,8ml的代替）100ml*1
滤纸：15cm*15cm*1
铅笔：1直尺：1
⽑细吸管：4保鲜膜：1
细玻璃棒：1
公⽤：
电吹风：3酒精灯：3
订书机：3电⼦天平或分析天平：3
称量纸：若⼲烘箱：1
量筒：100ml*1薄膜⼿套：若⼲
五、操作步骤
（⼀）展层剂和平衡溶剂的配制
1．在100ml烧杯中按照体积⽐正丁醇：88%甲酸：蒸馏⽔=15：3：2的⽐例配制展层
剂，建议为45ml：9ml：6ml。
2．称取0.05g茚三酮晶体，并⽤玻璃棒搅拌溶于展层剂中，盖上培养⽫。
3．平衡溶剂与展层剂相同。
（⼆）点样
1．实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下⾯可以蘸少量⽔，使得保鲜膜能与实验台⾯紧密贴
合，此后所有操作都在保鲜膜上进⾏，不再赘述。
2．在距平⾏于15cm长的边2cm处⽤铅笔轻轻描出⼀条直线，此为展层起点线，在直
线中间每隔3cm⽤铅笔轻轻点⼀个点，共点四个点。再在另⼀边，距边缘1cm处⽤
铅笔轻描出⼀条直线，此为展层终点线。
3．将⽑细管的⼀端在酒精灯外焰上灼烧3~6s，⽑细管管⼝变细即可。
4．⽤⽑细管分别蘸取三个氨基酸标准液和氨基酸混合液，点样于展层起点线的四个点
上。点完⼀次后，⽤电吹风冷风吹⼲，再点第⼆次样。每次点样均要求斑点半径。
5．在标准样下⾯⽤铅笔做好标记，记录该点的氨基酸名称。
（三）平衡及展层
1．将点好样的滤纸两侧边缘对齐但不接触，卷成筒形，并⽤订书机订3~4次，将圆筒
固定。
2．将圆筒竖直放⼊培养⽫中，滤纸勿与⽫壁接触，⽫周围放2个25ml⼩烧杯，内盛平
衡溶液10ml左右，盖上钟罩，平衡半个⼩时。
3．⽤移液管吸取10ml展层剂，打开钟罩上的塞⼦，将移液管下端尽量伸进培养⽫底部，
将展层剂加⼊到培养⽫中，拿出移液管。添加30ml展层剂，塞上钟罩塞⼦。
4.展层约两个半⼩时，当溶剂前沿⾄展层终点线时，取出滤纸。
（四）显⾊及Rf值计算
1．将取出的滤纸⽤电吹风冷风吹⼲，并放⼊65℃左右的烘箱中烘10min。
2．取出烘完的滤纸，估计出斑点的重⼼，共六个点（三个标准液，三个由混合液分离
出），并⽤铅笔轻轻点出。
3．展层剂跑的距离d0=12cm，⽤直尺测量出斑点中⼼到展层起点线的距离d1~d6，计
算Rfx=（x=1，2…6）
4．将混合样分离出的斑点的Rf值与标准样的进⾏对⽐，从⽽认清各斑点的氨基酸种类，
并在滤纸上标明。
六、注意事项
1.实验全程戴⼀次性薄膜⼿套，全套实验在铺在实验台上的薄膜上进⾏。原因：⼈的⽪肤上
含有含氮化合物，⽽实验台上可能未洗⼲净残留其他氨基酸，会沾染到滤纸上，对实验产⽣影响；保鲜膜可以与钟罩边缘进⾏
更紧密的结合，是平衡效果更好。
2.⽤⽑细吸管进⾏点样时，为保证点样半径⾜够⼩，应使⽑细管内的液体⾼度低于1cm，迅
速的点在滤纸上。若管内液体过⾼，可以先将⽑细管的液体点⼀部分于⼲净的卫⽣纸上，降低管内液体⾼度。
3.在通过移液管添加展层剂时，液体应缓慢放出，避免溅射到滤纸上，移液管拿出时也应该
注意不要碰触滤纸。
4.展层开始时不要使样品浸⼊展层剂中。
5.吹风机吹⼲时切记⽤冷风吹⼲，以免温度过⾼使氨基酸变性。
附：⽣化⼀组各氨基酸实验结果