蓝白斑筛选原理
世界建筑图片-钻头图片
2023年3月17日发(作者：兰州三十一中)一、
1、蓝白筛选的原理
LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。
MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端
的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，
而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有
外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的
pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。
当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-
氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解
产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。相反，
不互补则产生白色菌落。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互
补，因此菌落是白色的。从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆
菌。
2、影响转化率的几个重要因素
⑴、受体细胞
转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的
突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。
此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养
菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。
⑵、载体DNA和重组DNA方面
载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不
同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶
切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个
数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。
⑶、操作方面
感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子
不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作均应在无菌条件下进行，
所有器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有试剂也都要灭菌处理。
⑷、转化体系中重组DNA的浓度与纯度
转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度
越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。
⑸、外源基因与宿主染色体的同源性
外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易被
宿主核酸酶降解而降低转化率。
二、实验试剂
X-gal：2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，-20℃保存
备用），工作浓度20ul/20ml平板；
氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/ml母液，置-20℃冰箱保存。工作浓度
100ug/ml；
IPTG：母液100mmol/L，-20℃冰箱保存。工作浓度40ul/20ml平板；
LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃
灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；
含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入
Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后铺板；
大肠杆菌DH5a。
试剂的作用：
X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷）：一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖
苷酶水解产生兰色化合物。
IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，它可诱导
LacZ的表达。
三、实验器具
超净工作台；恒温水浴锅；制冰机；微量移液器；恒温摇床；常温离心机；恒温生化培养箱；
冰箱；培养皿；玻璃刮铲。
四、实验步骤
⑴、取4ul连接产物加入100ul感受态细胞中，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30min。
⑵、将管置于水浴锅中42℃水浴热激90sec，立刻放置冰上5min。
⑶、加入1ml37℃预热的LB培养基，混匀。
⑷、将管置于恒温摇床上37℃振荡培养1h。
⑸、将管置于离心机中3000rpm离心5min。
⑹、弃1ml上清，余下约100ul上清，用枪轻轻吹匀，用于涂板。
⑺、在一含氨苄青霉素的LB平板上，加入20μl20mg/mlX-gal和40μl100mmol/LIPTG。
⑻、将玻璃刮铲过火灭菌后伸入培养平板中，待其冷却后均匀涂布平板，玻璃刮铲过火
灭菌后置于酒精中备用，平板于室温放置30min备用。
⑼、将前述所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上，用玻璃刮铲均匀涂布。
将平板置于生化培养箱中正面放置30min后，再倒置，于37℃培养过夜。
五、注意事项
1、质粒的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在
一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情
况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10％。
2、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的，并经
高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，
否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
3、显色反应的时间
需要将平板放入4℃冰箱中3-4h，使得显色反应充分。
4、平板的涂布
菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转
化效率。
附件中包含有：整个过程的步骤的图片、一些常见问题与对策